Summary
Her præsenterer vi en stereologisk metode, den optiske fraktionator, der bruges til at kvantificere dannelsen af nye neuroner og deres overlevelse i rottehippocampus efter elektrokonvulsiv stimulering. Ved korrekt implementering sikrer følsomheden og effektiviteten af stereologiske metoder nøjagtige estimater med en fast og forudbestemt præcision.
Abstract
Stereologiske metoder er designet til at beskrive kvantitative parametre uden at antage størrelser, form, orientering og distribution af celler eller strukturer. Disse metoder har været revolutionerende til kvantitativ analyse af pattedyrshjerne, hvor volumetriske cellepopulationer er for høje til at tælle manuelt, og stereologi er nu den valgte teknik, når estimater af tredimensionelle mængder skal udvindes fra målinger på todimensionale sektioner. Alle stereologiske metoder er i princippet upartiske; De er dog afhængige af korrekt viden om interessestrukturen og vævets egenskaber. Stereologi er baseret på systematisk ensartet tilfældig prøveudtagning (SURS) med justering af prøveudtagning til det mest effektive niveau med hensyn til præcision, der giver pålidelig, kvantitativ information om hele strukturen af interesse. Her præsenterer vi den optiske fraktionator i forbindelse med BrdU immunhistokemi tO estimere produktion og overlevelse af nydannede neuroner i granulacellelaget (herunder den undergranulære zone) af rottehippocampus efter elektrokonvulsiv stimulering, som er blandt de mest potente stimulatorer af neurogenese. Den optiske fraktioneringsteknik er designet til at tilvejebringe estimater af det totale antal celler fra tykke sektioner, der er samplet fra den fulde struktur. Tykke sektioner giver mulighed for at observere celler i deres fulde 3-D-udstrækning og dermed muliggøre let og robust celleklassificering baseret på morfologiske kriterier. Når korrekt implementeret giver følsomheden og effektiviteten af den optiske fraktionator præcise estimater med en fast og forudbestemt præcision.
Introduction
Kvantificering af celler i en tredimensionel (3-D) struktur kan kræve opnåelse af estimater baseret på upartiske principper. Selv i dag bruger studier ofte todimensionale (2-D) metoder til at rapportere data om 3-D strukturer. Imidlertid anser disse metoder ikke strukturens heterogene karakter hvad angår form og distribution af celler, der resulterer i metodiske begrænsninger; De gør antagelser om 3-D-strukturen af interesse, og resultaterne henviser ikke til den komplette struktur. Disse begrænsninger reducerer følsomheden og nøjagtigheden af metoderne samt øger risikoen for fejl 1 .
Bias i celletælling kan undgås ved anvendelse af designbaseret stereologi, hvilket er af generel betydning for opnåelse af kvantitativ information om antallet af celler i et givet væv eller en struktur. Mens stereologi tidligere har været en meget tidskrævende metode, fremskridt i procedurer, blødWare og billeddannelse, har gjort det til at blive meget mere effektivt og bredt anvendeligt. Stereologi indebærer statistiske prøvetagningsprincipper og stokastisk geometrisk teori for at tilvejebringe effektive værktøjer til estimering af volumen, overfladeareal, længde og antal objekter i en 3-D struktur ved prøveudtagning i 2-D sektioner 2 . Således giver stereologi en mulighed for at opnå upartiske kvantitative data om strukturelle ændringer i vævssektioner, hvilket giver gennemsnitlige estimeringer af de sande tal uden udtømmende analyse 1 . Stereologi defineres som den statistiske indledning af geometriske parametre fra samplet information. Dette kan opnås ved upartisk prøveudtagning, det vil sige systematisk stikprøveudtagning, af sektioner samt tælleregler, der sikrer, at alle objekter har lige sandsynligheder for at blive talt 3 . Mens stereologiske resultater kan have varierende grader af præcision som angivet ved fejlkoefficienten (CE), kan dette være annonceJusteret for at passe til den iboende biologiske varians (varianskoefficienten) ved at justere mængden af prøveudtagning som krævet 4 , 5 . Nogle tidligere stereologiske undersøgelser har undersøgt de kortvarige virkninger af elektrokonvulsiv stimulering (ECS) på hippocampal plasticitet hos gnavere 6,7 . Data fra disse undersøgelser viser en initial stigning i det totale antal neuroner såvel som forhøjet synaptisk differentiering efter gentagen ECS. Disse undersøgelser estimerer imidlertid ikke neurogenese direkte, da de ikke bruger specifikke markører til celleproliferation.
Her præsenterer vi en anvendelse af en stereologisk metode, den optiske fraktioneringsteknik 8 , 9 , til kvantificering af det samlede antal nydannede neuroner i rottehippocampalt granulacellag (GCL), herunder også den undergranulære zone (SGZ) Som deres langsigtede sUrvival 10 , 11 . Vi udsatte rotter til en klinisk relevant tidsplan for ECS (tre gange om ugen i 3 uger), som er en af de mest potente stimulatorer af neurogenese 12 . Kontroldyr blev behandlet under anvendelse af samme fremgangsmåde, men uden at passere strøm. På hver af de 21 dages forsøg blev alle rotter injiceret intraperitonealt med 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU), der inkorporerer i DNA i stedet for thymidin under celledeling 13 . Efterfølgende forsøg blev rotterne opretholdt i fire forskellige tidsperioder (24 timer, 3 måneder, 6 måneder og 12 måneder). Ved anvendelse af fraktioneringsprincippet opnåede vi en kendt fraktion af hippocampuset gennem ensartet tilfældig prøveudtagning af sektioner og anvendte optiske disektorer (3-D-prober) til de samplede og immunfarvede tykke vævssektioner. Det er især bemærket, at frosne sektioner normalt falder sammen i z-aksen under processenOg at optiske disektorer baseret på den talvægtede gennemsnitssektionstykkelse skal anvendes i dette særlige tilfælde 14 . Som brændpunktsplanet for de optiske disektorer blev flyttet en kendt afstand ned gennem sektionen, blev BrdU-positive neuroner talt, da deres egenskab af interesse blev klart genkendt. Inden for stereologien er der noget debat om det samlede antal partikler, der skal tælles 15 ; Typisk 150-200 neuroner tælles i strukturen af interesse for at opnå tilstrækkelig præcision dvs. en koefficient på 7-8% 8 . De BrdU-positive neurontællinger blev afsluttet ved hjælp af stereologisk software med billeddannelse ved hjælp af et standardmikroskop udstyret med kamera og følgende mål: 2X, 4X og 10X samt et 100X olieinddrivningsmål (numerisk blænde = 1,40) og et motoriseret trin . Bevægelser i z-retningen blev målt med en digital mikrocator. Den endelige forstørrelseVar 3000X.
Protocol
Alle dyreprocedurerne blev udført i overensstemmelse med retningslinjer fra Dyreforsøgsinspektionen og godkendt af det lokale etiske udvalg for eksperimentelle dyr.
1. Væv behandling
BEMÆRK: Efter transcardial perfusion og postfixering i 4% paraformaldehyd (PFA) fortyndet i 0,2 M phosphatpuffer natten over ved 4 ° C, overføres hjerner til 30% saccharose i phosphatpufret saltvand (PBS) i tre dage ved 4 ° C. Herefter fryses hjernerne på pulveriseret tøris og opbevares ved -80 ° C indtil snitning.
- Adskil højre og venstre halvkugler langs hjernens midterlinie ved hjælp af en skalpell og vælg derefter en eller anden halvkugle tilfældigt i den første hjerne, og skift derefter systematisk mellem højre og venstre halvkugle ( figur 1A ). Monter den samplede halvkugle på en prøveplade med længdeaksen vinkelret på diskenVed hjælp af et monteringsmedium.
- Plads nummererede multidiske beholdere til forkøling i kryostat.
- Monter prøvepladen i kryostaten og skar hele hippocampus (Bregma 1,80 til - 7,04 16 ) i 80 μm tykke sektioner i koronalplanet ( Figur 1B ).
- Placer alle samplede sektioner i rækkefølge i de afkølede flerlagsbeholdere for at sikre, at sektionerne holdes i rækkefølge.
- Dæk sektionerne fuldstændigt med cryoprotectant og hold beholderne ved -20 ° C indtil videre brug.
2. Immunostaining
BEMÆRK: For at holde styr på de enkelte sektioner gennem farvningsproceduren placeres de samplede sektioner i 25-brønds farvningsnet. Brug hver 5. sektion, hvilket giver et gennemsnitligt endelige antal 12 (8-16) sektioner pr. Hippocampus til immunfarvning og efterfølgende celletælling.
- Inden subsampling hver nt sektion med en tilfældig start mellem sektion 1 og afsnit n ( Figur 1C ) overføres beholderne fra -20 ° C til stuetemperatur (RT).
- Brug f.eks. En pensel til at overføre sektionerne i numerisk rækkefølge til 25-brøndsfarvningsnetene placeret i petriskål fyldt med PBS.
BEMÆRK: Fra dette punkt skal du holde sektionerne i farvningsnetene, som er anbragt i matchende glasskåle placeret på en orbital shaker (afsnit 2.3 til 2.9). - Overfør farvenetene til de matchende glasskåle og vask sektionerne to gange i 10 minutter i PBS ved stuetemperatur inden inkubation i 3% hydrogenperoxid (H 2 O 2 ) fortyndet i destilleret vand (dH 2 O) i 20 minutter.
- Overfør sektionerne til tre forskellige opløsninger af saltsyre (HCl) (1 M ved 0 ° C i 10 minutter, 2 M ved stuetemperatur i 10 minutter og 2 M ved 37 ° C i 20 minutter), inden neutralisering i 0,1 M natriumtetraborat -enT RT i 20 minutter.
- Efter 3 x 10 min inkubationer i 1% Triton X-100 fortyndet i PBS (vaskebuffer) overføres sektionerne til vaskebuffer indeholdende 10% føtalt bovint serum (blokeringsopløsning) i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber sektionerne i 48 timer ved 4 ° C i mus-anti-BrdU fortyndet 1: 100 i blokeringsopløsning.
- Vask sektionerne 3 × 10 min i vaskebuffer og inkuber i 48 timer i hestekærderperoxidase fortyndet 1:10 i vaskebuffer.
- Overfør sektionerne til PBS i 5 x 10 minutter og derefter i 7 minutter i 0,01% diaminobenzidin (DAB) fortyndet i PBS, før de overføres til en lignende DAB-opløsning indeholdende 0,02% H202 i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Afslut en række vasker (2 × 10 min i PBS og 2 × 10 min i phosphatbuffer uden tilsat natriumchlorid) og monter sektionerne i numerisk rækkefølge på mikroskopglas.
- Tør sektionerne i ca. 30 minutter før modstrygning med cresylviolet.
- Placer mikroskopets dias i et glidestativ.
- Rehydrer sektionerne i 10 minutter i diætfarvningsskåle indeholdende dH20 og derefter overfør gliderne til 0,02% cresylviolet i dH20 i 15 minutter.
- Gentag trin 2.12, før sektionerne dehydreres tre gange i ethanol (96% i 5 minutter og 99% i 2 × 2 minutter).
- Placer sektionerne i xylen i 2 x 15 min og dækslid gliderne med et hurtigt tørremiddel til montering.
- Til sidst skal du lade dækslisterne gå i ca. 24 timer, før de kan bruges til mikroskopi.
3. Estimering af det totale antal BrdU-mærkede neuroner ved anvendelse af den optiske fraktionator
BEMÆRK: Gennemfør en pilotundersøgelse med et par dyr til bestemmelse af de optimale prøvetagningsparametre, såsom antallet af sektioner, der skal analyseres, og antallet af optiske disektorer inden for de samplede sektioner. Denne pilot giver også enForeløbigt CV (standardafvigelse / gennemsnit) og muligheden for at justere CE (se afsnit 3.9.3) for at opnå en tilfredsstillende præcision af de estimater, som undersøgeren har fastsat (se nærmere nedenfor). På samme måde udfører en z-fordelingsanalyse for at adressere følgende punkter: krympning af vævet, farvefarvningens kvalitet i hele sektionen og distribution af cellerne i z-aksen 14 .
- Kontroller tykkelsen af vævet i sektionerne for at bekræfte, at de er egnede til brug af den optiske fraktionator, fx er tyk nok til den valgte disektorhøjde inklusive beskyttelseszoner (se nedenfor). BEMÆRK: Vævstykkelsen er foranstaltninger på flere steder inden for interesseområdet.
- Placer diasene på det motoriserede trin i mikroskopet og tænd den foretrukne stereologiske software.
- Afgræns området med interesse ved hjælp af et lav forstørrelsesmål (2X eller 4X), inden du skifter til en 100X olie-immErstatningsmål (se figur 2A ).
- Brug et bestemt punkt i en tælleramme ( f.eks. Ved eller ved siden af et hjørne) ved at placere toppen af sektionen ved at bevæge sig langs brændpunktet, indtil nogle funktioner i sektionen vises i fokus. Registrér denne z-position som 0 (se figur 2B ).
- Flyt brændpunktet ned gennem vævet, indtil det samme specifikke punkt i tællerammen er ved det sidste z-niveau af væv i fokus og markér denne position. Den lokale vævstykkelse er defineret fra 0 til dette endepunkt og kan læses på z-aksen. Registrér vævstykkelsen (se figur 2B ).
- Dokument fuld penetration af pletten og distribution af cellerne i sektionens fulde tykkelse.
BEMÆRK: Fordelingen af BrdU-mærkede neuroner bruges som vejledning til bestemmelse af de nødvendige beskyttelseszoner. Selv om en ensartet fordeling af celler er kritisk, er detDet er acceptabelt at observere færre celler nær toppen og bunden af sektionen, hvilket angiver virkningen af tabte caps (for yderligere detaljer se Dorph-Petersen et al., 2009).- Prøve BrdU-mærkede neuroner og registrer deres z-position sammen med den lokale sektionstykkelse målt i det valgte hjørne af hver tælleramme.
- Plot antallet af BrdU-positive neuroner som en funktion af deres z-position.
- Fastgør højden af disektor og beskyttelseszoner baseret på den gennemsnitlige sektionstykkelse og fordelingen af celler (se 3.1 og 3.2).
BEMÆRK: Disistorens højde skal være mindre end snittykkelsen for at undgå genstande tæt på overfladerne. Denne risiko er omgået ved at inkludere beskyttelseszoner til toppen og bunden af sektionen. - Bestem trinlængden mellem disektorerne.
- Afgræk regionens interesse for alle de sektioner, der skal analyseres og registrere områderne.
- Sum disse områder og divider derefter bY antallet af disektorer, der skal placeres inden for dette område.
BEMÆRK: På baggrund af tidligere erfaringer medfører et godt udgangspunkt 75 prober. Dette vil give en tilnærmelse af området og de tilsvarende prøveudtagninger (et trin ) (for yderligere detaljer se Vest, 2012). - Tag kvadratroden af et trin , som vil give xy-trin størrelsen.
- Bestem størrelsen af tællerammen.
- Indstil størrelsen af tællerammen til en vilkårlig enhed og udfør en pilotprøveudtagning af BrdU-positive neuroner ved hjælp af parametrene opnået i afsnit 3.3 og 3.4.
BEMÆRK: Størrelsen skal bestemmes empirisk af forsøg og fejl, men det anbefales, at det justeres for at muliggøre prøveudtagning på 2-3 celler pr. Disektor 8 .
- Indstil størrelsen af tællerammen til en vilkårlig enhed og udfør en pilotprøveudtagning af BrdU-positive neuroner ved hjælp af parametrene opnået i afsnit 3.3 og 3.4.
- Efter dette sidste trin i pilotundersøgelsen påbegyndes celleprøveudtagning.
BEMÆRK: De opnåede prøveudtagningsparametre skal resultere i tæller på ca. 150-200 celler iN hvert dyr, der er tilstrækkeligt til at opnå et effektivt stereologisk design 8 . - Tæl de BrdU-positive neuroner ved hjælp af et 100 × olie-nedsænkningsmål og en endelig forstørrelse på 2000-3000 ×. I hver optisk disektor skal du identificere eventuelle BrdU-mærkede neuroner, der klart genkendes af interessen (i det foreliggende studie er kriteriet, når forkanten af den BrdU-mærkede neuron kommer i fokus for første gang), er placeret Inde i tællerammen eller berør inklusionslinjerne ( figur 2B ). Tæl ikke de BrdU-positive neuroner, der, når de klart genkendes af den egenskab, der er af interesse inden for disektorhøjden, berører udelukkelseslinjerne. Det er kritisk vigtigt at følge nøje disse tælleregler gennem hele den stereologiske kvantificering.
BEMÆRK: Da BrdU inkorporerer i alle opdelte celler, anvendes morfologi til at skelne mellem neuroner og andre typer af celler. NeuRon egenskaber er en klart defineret kerne med en neutral cytoplasma og en mørk nukleolus. BrdU-positive celler genkendes som nydannede neuroner baseret på deres relativt større størrelse sammenlignet med glialceller. Det bør nævnes, at i dobbelt studier med kortvarig proliferation (fx <24 timer) kan dobbeltfarvning med umodne neuronmarkører være en forudsætning 17 . - Anslå det samlede antal BrdU-positive neuroner i hver hjerne ved at multiplicere det samlede antal celler, der tælles (Σ Q - ) med de gensidige prøveudtagningsfraktioner:
til
hvor
Q- er den numeriske vægtede gennemsnitsafsnitstykkelse, h er disektorens højde, somf er prøveudtagningsfraktionen, ssf er sektionen sAmpling fraktion og t i er tykkelsen af tykkelsen i den første tælleramme med et celleantal på 
I disectoren 14 , 18 . - Beregn fejlkoefficienten (CE) 8, som er prøveudtagningsvariancen af BrdU-positive neuroner i systematisk ensartet stikprøveudtagning (SURS).
- Først beregner du støj , som er lig med det samlede antal BrdU-positive neuroner, der tælles:
- Herefter beregnes variansen i SURS:
BEMÆRK: Vi har bedømt området og celleantalet i hippocampus for at ændre jævnt fra afsnit til sektion og anvendte følgelig "glathedsklasse" m = 1 (1/240) 8 , 19
hvor
P i er antallet af punkter, der tælles for objektet i I - sektionen, og n er antallet af sektioner 4 , 20 . - Endelig beregne CE-estimatet:
BEMÆRK: Generelt opnås optimal præcision, når CE-værdien er mindre end halvdelen af det observerede CV, da OCV 2 = ICV 2 + CE 2 , hvor OCV er det observerede CV og ICV er den iboende CV 4 .
- Først beregner du støj , som er lig med det samlede antal BrdU-positive neuroner, der tælles:
Q- er den numeriske vægtede gennemsnitsafsnitstykkelse, h er disektorens højde, somf er prøveudtagningsfraktionen, ssf er sektionen sAmpling fraktion og t i er tykkelsen af tykkelsen i den første tælleramme med et celleantal på 
I disectoren 14 , 18 . 
FIgur 1: Skematisk illustration, der viser vævsbearbejdning i overensstemmelse med fraktionsprincipperne anvendt i den foreliggende undersøgelse.
Efter eksperimenter separeres halvkuglerne og højre eller venstre halvkugle valgt systematisk og tilfældigt (A). Den komplette hjerne, der strækker sig over hele hippocampus, skæres i 80 μm tykke koronale sektioner (B), hvorefter hver 5. del er subsamplet, starter tilfældigt mellem sektion 1 til 5, til endelig immunfremkaldende og stereologisk kvantificering (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Illustration, der viser den stereologiske prøveudtagningsprocedure ved hjælp af optiske disektorer.
(A) Efter histologisk behandling af hIppocampal GCL / SGZ var afgrænset og optiske disektorer blev anvendt ensartet og tilfældigt over regionen. (B) I de optiske disektorer (til venstre) blev de BrdU-positive neuroner kun talt, hvis deres egenart af interesse blev klart genkendt inden for disektorhøjden og placeret inde i tællerammen eller rørende inklusionslinjen (højre). Neuroner, der rører udelukkelseslinjen, blev ikke talt. Skalestænger = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
Prøveudtagningsparametre
Ved at analysere z-fordelingen i en pilotundersøgelse ( Figur 3 ) fandt vi en ensartet fordeling af BrdU-positive neuroner i disektorhøjden. Krympning af sektionerne blev målt; Den endelige gennemsnitstykkelse var 26,4 μm (19,0-32,0 μm) i sektioner, der oprindeligt blev skåret til 80 μm. Baseret på vævstykkelsen og fordelingen af BrdU-mærkede neuroner blev disektorhøjden sat til 10 μm, og beskyttelseszonen øverst og nederst i sektionen blev indstillet til henholdsvis 5 μm og 4-17 μm. Afhængigt af cellernes tæthed var området af tællerammerne 1414 eller 5210 μm 2 . Trinnlængden var 220 μm i både x- og y-retningerne, og celletælling blev udført i et gennemsnit på 12 (område 8-16) sektioner pr. Dyr. Disse prøvetagningsparametre resulterede i et gennemsnit på 133 (rækkevidde 33-372) BrdU-positive celler tælles i 173 (107-204) disektorer i hver hjernehalvdel.
Som eksempel opnået vi følgende CV- og CE-værdier for BrdU-positive neuronestimeringer i ECS-behandlede rotter: 24 timer: CV = 0,59, CE = 0,11; 3 måneder: CV = 0,34, CE = 0,12; 6 måneder: CV = 0,43, CE = 0,09; 12 måneder: CV = 0,22, CE = 0,09.
Vi kvantificerede det samlede antal nydannede neuroner og deres langsigtede overlevelse i rottehippocampus efter ECS ved anvendelse af den optiske fraktionator i forbindelse med en BrdU-farvningsteknik 10 , 11 . De endelige resultater viste en basal neurogenese i de fire grupper af kontroldyr, som ikke signifikant adskiller sig som en funktion af overlevelsestiden ( figur 3 ). Endvidere inducerede ECS en signifikant forøgelse af det totale antal BrdU-positive neuroner ved 24Timer (259%, p <0,0001), 3 (229%, p <0,001), 6 (152%, p <0,05) og 12 måneder (162%, p <0,05) efter forsøg i sammenligning med kontrollerede dyr.
Figur 3: Kvantitative data af det totale antal BrdU-positive neuroner i GCL / SGZ fra rottehippocampus 10 , 11 .
Horisontale stænger repræsenterer middelværdierne. Forkortelser: GCL, granulatcellelag; SGZ, sub-granulær zone; H, timer; M, måneder. **** p <0,0001, *** p <0,001 og * p <0,05 versus kontrol (n = 11-12 pr. Gruppe). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Ved hjælp af ECS som metode til at fremkalde neurogenese finder vi en øjeblikkelig stigning på 260% i dannelsen af nye BrdU-positive neuroner i hippocampus. I denne pulje af akut genererede neuroner fandt vi 40% afgang fra dag 1 til 3 måneder, med næsten 50% af de nydannede neuroner overlevende mindst 12 måneder efter behandling 10 , 11 . Tællingen af BrdU-mærkede neuroner fulgte et strikt prøveudtagningsskema, hvorved hele hippocampus blev skåret i 80 μm tykke sektioner efterfulgt af undersampling af hver 5. sektion med en tilfældig prøveudtagning mellem sektion 1 og sektion fem. Forudsat at disse sektioner vælges systematisk, er dette påviseligt en glimrende metode til at reducere slutresultatets varians uden udtømmende tælling 1 . Dette prøveudtagningssystem tillod os at tælle BrdU-positive neuroner i et gennemsnit på 12 (8-16) hippocampAl sektioner i hver rottehjerne med en endelig præcision på 9-11%.
Ved anvendelse af fraktionsmetoden er det vigtigt at kende den brøkdel af sektionshøjden, hvori tællingen udføres, da vævskrumpning og deformation ofte forekommer under histologisk behandling 14 . Faktisk så vi en betydelig krympning af tykkelsen i denne undersøgelse. Det skal endvidere bemærkes, at forskelligt vævskrumpning kan forekomme, som præsenteret i Dorph-Petersen et al. 2001. Så længe den samlede interesseinteresse er tilgængelig til analyse, resulterer disse begrænsninger ikke i en bias af det samlede antal partikler, det vil sige BrdU-positive neuroner. I undersøgelser, hvor vævskrumpning er et bestemt problem, skal det altid angives, at resultaterne opnås i deformeret væv. I denne undersøgelse tælles vi i en disektorhøjde på 10 μm. Afsnittene i den foreliggende undersøgelse havde en endelig middeltykkelse på 26 μm, en 5 μmVagtzone øverst og en 11 μm (middel) vagtzone nederst i sektionen. Disse parametre er acceptable, da beskyttelseszoner skal være ca. diameteren af de samplede partikler.
Efter afgrænsning af GCL / SGZ blev disektorer ensartet tilfældigt placeret inden for afgrænset område. Disektorerne skal placeres med en fast trinlængde, der optimerer prøveudtagning og tælling for effektivt at opnå estimater med en præcision bestemt af efterforskeren. Optimal præcision opnås typisk ved at tælle op til 150-200 celler i hver interessestruktur 5 . I den foreliggende undersøgelse tællede vi et gennemsnit på 133 (række 33-372) BrdU-positive neuroner i hver rottehippocampus. På grund af et lavt celleantal i nogle af kontroldyrene faldt vores antal BrdU-positive neuroner under det generelt acceptable antal celler, der var nødvendige for at opnå en passende præcision, hvilket resulterede i relativt høje CE-værdier for disse tilfælde. HOwever, da vi opnåede CE-værdier på mindre end halvdelen af CV-værdierne (se repræsentativ resultatafsnit) var der ikke behov for yderligere prøveudtagning og tælling. De høje CV-værdier viser, at den største bidragyder til den observerede variation stammer fra den biologiske variation. Faktisk kan vi hævde, at det gennemsnitlige antal BrdU-positive neuroner, der tælles i den foreliggende undersøgelse, var højere end nødvendigt. For eksempel opnåede vi i en gruppe rotter en CE-værdi på 9% og observerede en CV-værdi på 43%. I dette særlige tilfælde kunne vi have rettet mod en præcision på ca. 20%. Sammenfattende er præcisionen af det samlede antal BrdU-positive neuroner i den foreliggende undersøgelse tilstrækkeligt, idet det fanger reelle behandlingseffekter på det sande antal partikler. På grund af den ret store biologiske variation i visse grupper af dyr kunne de samme skøn have været opnået med en acceptabel præcision, på trods af mindre indsatsbesparelser. Høje biologiske afvigelser inden for grupper kan kunKompenseres ved at øge antallet af dyr.
Man kan argumentere for, at guldstandarden til opnåelse af nøjagtige celle tal indebærer udtømmende tælling af alle genstande af interesse. Men i de fleste hjernestudier er det ikke en mulighed på grund af det store antal celler. Selv om det er meget mere effektivt end udtømmende celletælling, er den valgfrie fraktionator relativt tidskrævende i sammenligning med simpel screening af forskelle i celleantal, som er foretrukket, hvis det nøjagtige antal celler ikke er essentielt. Det er vores erfaring, at forskelle på mere end 20-30% kan detekteres udelukkende ved screeningsprocedurer.
Hvis det udføres korrekt, giver prøveudtagning ved hjælp af designbaseret stereologi upartiske og præcise estimater på en effektiv måde 1 . Sterilologiens upartiske egenskab frembringer estimater, at når de replikeres, tilnærmelsesvis den sande populationsmiddel og forøge reproducerbarheden afSkøn 21 . I første omgang skal en repræsentativ prøve af hele strukturen af interesse (i dette studie hippocampal GCL / SGZ) opnås, hvilket giver mulighed for estimering i en statistisk gyldig delmængde af sektioner 4 . For at opnå et passende antal sektioner og tælleprober bruger vi SURS, hvilket reducerer variansen i forhold til tilfældig prøveudtagning 8 . Desuden sikrer SURS at partikler af interesse inden for strukturen samples med de samme sandsynligheder uafhængigt af deres størrelse, form, orientering og fordeling i strukturen. Som sådan er stereologien stærkt anbefales, når man opnår præcise og upartiske estimater er et centralt aspekt af projektet.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Susanne Sørensen for den dygtige tekniske assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra The Velux Foundation; The Jascha Foundation; Aase og Ejnar Danielsens Fond; Hartmann Brothers Foundation; Direktør Jacob Madsen og kone Olga Madsens Foundation; Læge Sofus Carl Emil Friis og Hustru Doris Friis 'Trust; Stiftelsen 1870; Torben og Alice Frimodts Foundation og Stiftelsen for Neurologisk Forskning. Manuskriptredigering blev udført af Inglewood Biomedical Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- West, M. J. Introduction to stereology. 2012 (8), Cold Spring Harb. Protoc. 843-851 (2012).
- West, M. J. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias. Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression. Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).
- Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus. Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Kiëu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered. J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).
- West, M. J. Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material. Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).
- Olesen, M. V., Wörtwein, G., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study. Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).
- Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats. Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach. J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. Sydney. (1986).
- Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. 130 (2), 391-399 (2003).
- Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus. Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).
- Dorph-Petersen, K. A., et al. Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders. Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).
- Eriksen, N., et al. Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images. Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).
- Gundersen, H. J. Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope? Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).
