Summary
Här presenterar vi en stereologisk metod, den optiska fraktionen, som används för att kvantifiera bildandet av nya neuroner och deras överlevnad i råttahippocampus efter elektrokonvulsiv stimulering. När korrekt implementeras säkerställer känsligheten och effektiviteten hos stereologiska metoder noggranna uppskattningar med en bestämd och förbestämd precision.
Abstract
Stereologiska metoder är utformade för att beskriva kvantitativa parametrar utan att göra antaganden om storlek, form, orientering och fördelning av celler eller strukturer. Dessa metoder har varit revolutionerande för kvantitativ analys av däggdjurshjärnan, i vilken volymetriska cellpopulationer är för höga för att räkna manuellt och stereologi är nu den valfria tekniken när uppskattningar av tredimensionella kvantiteter behöver extraheras från mätningar på tvådimensionella sektioner. Alla stereologiska metoder är i princip objektiva; De litar dock på korrekt kunskap om intressestrukturen och vävnadens egenskaper. Stereologin baseras på systematisk enhetlig slumpmässig sampling (SURS), med justering av provtagning till den mest effektiva nivån med avseende på precision, vilket ger pålitlig, kvantitativ information om hela intressekonstruktionen. Här presenterar vi den optiska fraktionen i samband med BrdU immunohistokemi tO uppskatta produktion och överlevnad av nybildade neuroner i granulatcellskiktet (inklusive den subgranulära zonen) hos råtthippocampus efter elektrokonvulsiv stimulering, som är bland de mest potenta stimulatorerna för neurogenes. Den optiska fraktioneringstekniken är utformad för att ge uppskattningar av det totala antalet celler från tjocka sektioner samplade från hela strukturen. Tjocka sektioner ger möjlighet att observera celler i sin fulla 3-D-utsträckning och möjliggör sålunda enkel och robust cellklassificering baserat på morfologiska kriterier. När korrekt implementeras, ger känsligheten och effektiviteten hos den optiska fraktionern noggranna uppskattningar med en fast och förutbestämd precision.
Introduction
Kvantifiering av celler i en tredimensionell (3-D) struktur kan kräva att man erhåller uppskattningar baserat på objektiva principer. Även idag använder studier ofta tvådimensionella (2-D) metoder för att rapportera data om 3-D-strukturer. Emellertid anser dessa metoder inte strukturen heterogena när det gäller form och distribution av celler som resulterar i metodiska begränsningar; De gör antaganden om 3-D-strukturen av intresse och resultaten hänvisar inte till den fullständiga strukturen. Dessa begränsningar minskar känsligheten och noggrannheten hos metoderna samt ökar risken för fel 1 .
Bias i cellräkning kan undvikas genom tillämpning av designbaserad stereologi, vilken är av allmän betydelse för att erhålla kvantitativ information om antalet celler i en given vävnad eller struktur. Medan stereologi tidigare har varit en mycket tidskrävande metod, framsteg i förfaranden, mjukWare och bildbehandling har gjort det mycket mer effektivt och allmänt tillämpligt. Stereologi medför statistiska provtagningsprinciper och stokastisk geometrisk teori för att tillhandahålla effektiva verktyg för uppskattning av volymen, ytan, längden och antalet objekt i en 3-D struktur genom provtagning i 2-D sektioner 2 . Sålunda tillåter stereologi att man erhåller obearbetade kvantitativa data om strukturella förändringar i vävnadssektioner, vilket ger genomsnittliga uppskattningar av de sanna siffrorna, utan uttömmande analys 1 . Stereologi definieras som den statistiska inferensen av geometriska parametrar från samplad information. Detta kan uppnås genom objektsampling, det vill säga systematisk stickprovtagning, av sektioner samt räkning av regler som säkerställer att alla objekt har lika sannolikheter att räknas 3 . Medan stereologiska resultat kan ha varierande grad av precision som anges av felkoefficienten (CE) kan detta vara annonsJusterad för att passa den inneboende biologiska variansen (varianskoefficienten) genom att justera mängden provtagning som krävs 4 , 5 . Några tidigare stereologiska studier har undersökt de kortsiktiga effekterna av elektrokonvulsiv stimulering (ECS) på hippocampal plasticitet hos gnagare 6,7 . Data från dessa studier visar en initial ökning av det totala antalet neuroner samt förhöjd synaptisk differentiering efter upprepad ECS. Emellertid uppskattar dessa studier inte neurogenes direkt, eftersom de inte använder specifika markörer för cellproliferation.
Här presenterar vi en tillämpning av en stereologisk metod, den optiska fraktioneringstekniken 8 , 9 , för att kvantifiera det totala antalet nybildade neuroner i det råtta hippocampala granulacellskiktet (GCL) inklusive även den granulära zonen (SGZ) Som deras långsiktiga sUrvival 10 , 11 . Vi utsatte råttor för ett kliniskt relevant schema av ECS (tre gånger i veckan i 3 veckor), vilket är en av de mest potenta stimulatorerna av neurogenes 12 . Kontrolldjur behandlades med användning av samma förfarande, men utan att strömmen överfördes. På var och en av de 21 dagarna av experimentet injicerades alla råttor intraperitonealt med 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) som inkorporerar i DNA i stället för tymidin under celldelning 13 . Efter experimentering behöll råttorna i fyra olika tidsperioder (24 timmar, 3 månader, 6 månader och 12 månader). Med användning av fraktionsprincipen erhöll vi en känd fraktion av hippocampus genom likformig slumpmässig provtagning av sektioner och applicerade optiska disektorer (3-D-prober) till de provtagna och immunfärgade tjocka vävnadssektionerna. Det är speciellt noterat att frusna sektioner brukar kollapsa i z-axeln under processenOch att optiska disektorer baserade på den antalviktade genomsnittliga sektionstjockleken bör användas i detta speciella fall 14 . När fokalplanet för de optiska disektorerna flyttades ett känt avstånd ned genom sektionen räknades BrdU-positiva neuroner när deras egenskaper av intresse var tydligt igenkända. Inom stereologin är det en del debatt om det totala antalet partiklar som ska räknas 15 ; Typiskt 150-200 neuroner räknas i strukturen av intresse för att uppnå tillräcklig precision dvs en koefficient på 7-8% 8 . De BrdU-positiva neurontalen kompletterades med användning av stereologisk mjukvara med avbildning av ett standardmikroskop utrustat med kamera och följande mål: 2X, 4X och 10X samt ett 100X oljedämpningsmål (numerisk bländare = 1,40) och ett motoriserat stadium . Rörelser i z-riktningen mättes med en digital mikrocator. Den slutliga förstoringenVar 3000X.
Protocol
Alla djurprocedurer utfördes i enlighet med riktlinjerna från Djurförsöksinspektionen och godkändes av den lokala etiska kommittén för försöksdjur.
1. Vävnadsbehandling
OBS: Efter transcardiell perfusion och postfixering i 4% paraformaldehyd (PFA) utspädd i 0,2 M fosfatbuffert över natten vid 4 ° C överförs hjärnor till 30% sackaros i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i tre dagar vid 4 ° C. Därefter frystas hjärnorna på pulveriserad torris och lagras vid -80 ° C till sektion.
- Separera höger och vänstra halvkärmen längs hjärnans mittlinje med hjälp av en skalpell och välj sedan en eller andra halvklotet slumpmässigt i den första hjärnan, därefter skiftas systematiskt mellan höger och vänster halvklot ( Figur 1A ). Montera den provade halvklotet på en provskiva med längdaxeln vinkelrätt mot skivanMed hjälp av ett monteringsmedium.
- Placera numrerade multidiska behållare för förkylning i kryostat.
- Montera provskivan i kryostat och skär hela hippocampusens helhet (Bregma 1,80 till - 7,04 16 ) i 80 μm tjocka sektioner i koronplanet ( Figur 1B ).
- Placera alla provtagna sektioner i följd i de kylda flervärda behållarna, för att säkerställa att sektionerna hålls i skärningsordning.
- Täck sektionerna fullständigt med kryoskyddsmedel och håll behållarna vid -20 ° C tills de används ytterligare.
2. Immunostaining
OBS! För att hålla koll på de enskilda sektionerna under färgproceduren placera de provtagna sektionerna i 25-brunnsfärgarn. Använd varje 5: e sektion, vilket ger ett genomsnittligt slutligt antal 12 (8-16) sektioner per hippocampus för immunostaining och efterföljande cellräkning.
- Före delprovtagning ska varje nt sektion med slumpmässig start mellan sektion 1 och sektion n ( Figur 1C ) överföra behållarna från -20 ° C till rumstemperatur (RT).
- Använd t.ex. en pensel för att överföra sektionerna i numerisk ordning till 25-brunnsfärgarnen placerade i petriskålar fyllda med PBS.
OBS! Från den här punkten behåll de avsnitten i färgnätet som placeras i matchande glasrätter som placeras på en orbital shaker (avsnitt 2.3 till 2.9). - Överför färgnätet till matchande glasrätter och tvätta sektionerna två gånger i 10 minuter i PBS vid RT före inkubation i 3% väteperoxid (H2O2) spätt i destillerat vatten (dH2O) under 20 minuter.
- Överför sektionerna till tre olika lösningar av saltsyra (HCl) (1 M vid 0 ° C i 10 minuter, 2 M vid RT under 10 minuter och 2 M vid 37 ° C under 20 minuter) före neutralisering i 0,1 M natriumtetraborat enT RT under 20 min.
- Efter 3 x 10 min inkubationer i 1% Triton X-100 utspädd i PBS (tvättbuffert), överför sektionerna till tvättbuffert innehållande 10% fetalt bovint serum (blockerande lösning) i 1 timme vid RT.
- Inkubera sektionerna i 48 timmar vid 4 ° C i mus-anti-BrdU utspätt 1: 100 i blockeringslösning.
- Tvätta sektionerna 3 × 10 min i tvättbuffert och inkubera i 48 timmar i räkoradoxidas utspädd 1:10 i tvättbuffert.
- Överför sektionerna till PBS i 5 x 10 min och därefter i 7 minuter i 0,01% diaminobenzidin (DAB) utspädd i PBS innan de överförs till en liknande DAB-lösning innehållande 0,02% H2O i 10 minuter vid RT.
- Fyll i en serie tvättar (2 × 10 min i PBS och 2 × 10 min i fosfatbuffert utan tillsatt natriumklorid) och montera sektionerna i numerisk ordning på mikroskopglas.
- Torka avsnitten i ca 30 min innan motståndet med cresylviolett.
- Placera mikroskopskivorna i en glidhylla.
- Rehydrera sektionerna i 10 minuter i glidfärgningsfat innehållande dH20 och överför sedan glidorna till 0,02% cresylviolett i dH20 under 15 minuter.
- Upprepa steg 2.12 innan sektionerna dehydreras tre gånger i etanol (96% i 5 minuter och 99% i 2 × 2 min).
- Placera sektionerna i xylen i 2 x 15 min och täcka glidglasen med ett snabbt torkmedium för montering.
- Slutligen lämna de täckta glidbanorna i ca 24 h innan de kan användas för mikroskopi.
3. Uppskattning av det totala antalet BrdU-märkta neuroner med användning av den optiska fraktionen
ANMÄRKNING: Gör en pilotstudie med några djur för att bestämma de optimala provtagningsparametrarna, såsom antalet sektioner som ska analyseras och antalet optiska disektorer inom de provtagna sektionerna. Denna pilot ger också enPreliminärt CV (standardavvikelse / medelvärde) och möjlighet att justera CE (se avsnitt 3.9.3) för att uppnå en tillfredsställande precision av de uppskattningar som fastställts av utredaren (för mer information se nedan). På samma sätt utföra en z-fördelningsanalys för att ta itu med följande punkter: krympning av vävnaden, färgningens kvalitet i hela sektionen och fördelning av cellerna i z-axeln 14 .
- Kontrollera tjockleken på vävnaden i sektionerna för att bekräfta att de är lämpliga för användning av den optiska fraktionen, t ex är tjock nog för den valda dis-korshöjden inklusive skyddszoner (se nedan). OBS: Vävnadstjockleken är mått på flera ställen inom intresseområdet.
- Placera bilderna på mikroskopets motoriserade steg och sätt på den föredragna stereologiska mjukvaran.
- Avgränsa området av intresse med hjälp av ett lågförstoringsmål (2X eller 4X) innan du byter till en 100X oljeväxelErsion-målet (se figur 2A ).
- Använd en viss punkt i en räkneram ( t.ex. vid eller intill ett hörn) genom att placera toppen av sektionen genom att flytta längs fokusplanet tills någon del av avsnittet visas i fokus. Registrera denna z-position som 0 (se Figur 2B ).
- Flytta fokusplanet ner genom vävnaden tills samma specifika punkt i räkningsramen ligger vid den sista z-nivån av vävnad i fokus och markera den här positionen. Den lokala vävnadstjockleken definieras från 0 till denna ändpunkt och kan läsas på z-axeln. Registrera vävnadstjockleken (se figur 2B ).
- Dokument full penetration av fläcken och fördelning av cellerna i sektionens fulla tjocklek.
OBS! Distributionen av BrdU-märkta neuroner används som en guide för att bestämma de nödvändiga skyddszonerna. Även om en likformig cellfördelning är kritisk är denDet är acceptabelt att observera färre celler nära toppen och botten av sektionen, vilket indikerar effekten av förlorade kepsar (för ytterligare detaljer se Dorph-Petersen et al., 2009).- Prov BrdU-märkta neuroner och registrera deras z-position tillsammans med den lokala sektionstjockleken mätt i det valda hörnet av varje räkneram.
- Rita antalet BrdU-positiva neuroner som en funktion av deras z-position.
- Fixa höjden på disektorn och skyddszonen baserat på den genomsnittliga sektionstjockleken och fördelningen av celler (se 3.1 och 3.2).
OBS! Disektorns höjd ska vara mindre än sektionstjockleken för att undvika artefakter nära ytorna. Denna risk kringgås genom att skyddszoner inkluderas i övre och nedre delen av sektionen. - Bestäm steglängden mellan disektorerna.
- Avgränsa området av intresse för alla sektioner som ska analyseras och registrera områdena.
- Summa dessa områden och dela sedan bY antalet disektorer som ska placeras inom detta område.
OBS: Baserat på tidigare erfarenheter medför en bra utgångspunkt 75 sonder. Detta kommer att ge en approximation av området och motsvarande provtagningspositioner (A- steg ) (för ytterligare detaljer se West, 2012). - Ta kvadratroten av ett steg , som kommer att ge xy-steg-storleken.
- Bestäm storleken på räkneramen.
- Ställ in räkneramens storlek till en godtycklig enhet och utför en provtagning av BrdU-positiva neuroner med parametrarna som erhållits i avsnitt 3.3 och 3.4.
OBS! Storleken måste bestämmas empiriskt av försök och fel, men det rekommenderas att det justeras för att möjliggöra provtagning av 2-3 celler per disektor 8 .
- Ställ in räkneramens storlek till en godtycklig enhet och utför en provtagning av BrdU-positiva neuroner med parametrarna som erhållits i avsnitt 3.3 och 3.4.
- Efter detta sista steg i pilotstudien börjar cellprovtagning.
OBS: De erhållna provtagningsparametrarna skulle resultera i räkningar av ca 150-200 celler iN varje djur som är tillräckligt för att erhålla en effektiv stereologisk utformning 8 . - Räkna de BrdU-positiva neuronerna med ett 100 × oljedämpningsmål och en slutgiltig förstoring av 2000-3000 ×. I varje optisk disektor identifierar du alla BrdU-märkta neuroner som tydligt känns igen av intresset (i den aktuella studien är kriteriet när framkanten av BrdU-märkt neuron kommer i fokus för första gången) Inuti räkningsramen eller peka på inkopplingslinjerna ( Figur 2B ). Räkna inte med de BrdU-positiva neuronerna, när de är tydligt igenkända av intresset av intresse inom disektorns höjd, röra uteslutningslinjerna. Det är kritiskt viktigt att noggrant följa dessa räkningsregler under hela stereologiska kvantifieringen.
OBS! Eftersom BrdU inkorporerar i alla delande celler används morfologi för att skilja mellan neuroner och andra typer av celler. NeuRon egenskaper är en klart definierad kärna med en neutral cytoplasma och en mörk nukleolus. BrdU-positiva celler är kända som nybildade neuroner baserat på deras relativt större storlek jämfört med glialceller. Det bör nämnas att i studier av kortvarig proliferation (t.ex. <24 h) kan dubbelfärgning med omogna neuronmarkörer vara en förutsättning 17 . - Uppskatta det totala antalet BrdU-positiva neuroner i varje hjärna genom att multiplicera det totala antalet celler som räknas (Σ Q - ) med de ömsesidiga provtagningsfraktionerna:
för
var
Q- är den numeriska vikten av medelstorlekens tjocklek, h är disektorens höjd, asf är provtagningsfraktionen, ssf är sektionen sAmpling fraktion och t i är tjockleken i den räknande ramen med ett cellantal av 
I disektorn 14 , 18 . - Beräkna felkoefficienten (CE) 8 som är provtagningsvariationen av BrdU-positiva neuroner i systematisk likformigt stickprovtagning (SURS).
- Beräkna först bruset , vilket är lika med det totala antalet BrdU-positiva neuroner som räknas:
- Beräkna därefter variansen i SURS:
OBS! Vi har bedömt området och celltal i hippocampus för att ändra smidigt från avsnitt till sektion och följaktligen använt "jämnhetsklass" m = 1 (1/240) 8 , 19
var
P i är antalet poäng som räknas för objektet i den i-delen och n är antalet sektioner 4 , 20 . - Slutligen beräkna CE: s uppskattning:
OBS: Generellt uppnås optimal precision när CE-värdet är mindre än hälften av det observerade CV-värdet, eftersom OCV 2 = ICV 2 + CE 2 , där OCV är det observerade CV och ICV är det inneboende CV 4 .
- Beräkna först bruset , vilket är lika med det totala antalet BrdU-positiva neuroner som räknas:
Q- är den numeriska vikten av medelstorlekens tjocklek, h är disektorens höjd, asf är provtagningsfraktionen, ssf är sektionen sAmpling fraktion och t i är tjockleken i den räknande ramen med ett cellantal av 
I disektorn 14 , 18 . 
FIgur 1: Schematisk illustration som visar vävnadsbehandling enligt de fraktionsprinciper som används i föreliggande studie.
Efter experimentet separeras hemisfärerna och höger eller vänster halvklot väljs systematiskt och slumpmässigt (A). Den fullständiga hjärnan som sträcker sig över hela hippocampus skärs i 80 μm tjock koronaldelar (B), varefter var 5: e sektionen subsampleras, startar slumpmässigt mellan avsnitt 1 till 5, för slutlig immunförstärkning och stereologisk kvantifiering (C). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Illustration som visar det stereologiska provtagningsförfarandet med hjälp av optiska disektorer.
(A) Efter histologisk bearbetning hIppocampal GCL / SGZ var avgränsade och optiska disektorer applicerades enhetligt och slumpmässigt över regionen. (B) I de optiska disektorerna (vänster) räknades de BrdU-positiva neuronerna endast om deras egenskaper av intresse tydligt återkändes inom disektorns höjd och belägen inuti räkningsramen eller vidrör inklusionslinjen (höger). Neuroner som rör utslagslinjen räknades inte. Skalstänger = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
Provtagningsparametrar
Genom att analysera z-fördelningen i en pilotstudie ( Figur 3 ) hittade vi en enhetlig fördelning av BrdU-positiva neuroner i disektorhöjden. Krympning av sektionerna mättes; Den slutliga medeltjockleken var 26,4 μm (19,0-32,0 μm) i sektioner som ursprungligen skars vid 80 μm. Baserat på vävnadstjockleken och fördelningen av BrdU-märkta neuroner bestämdes höjdshöjden till 10 μm och skyddsområdena på toppen och botten av sektionen var inställda på 5-μm respektive 4-17 μm. Beroende på cellernas densitet var området för räkneramarna 1414 eller 5210 μm 2 . Steglängden var 220 pm i både x- och y-riktningarna och cellräkning utfördes i ett genomsnitt av 12 (intervall 8-16) sektioner per djur. Dessa provtagningsparametrar resulterade i ett medelvärde av 133 (intervall 33-372) BrdU-positiva celler räknade i 173 (107-204) disektorer i varje hjärnhalvfrumma.
Som ett exempel fick vi följande CV- och CE-värden för BrdU-positiva neuronestimeringar i ECS-behandlade råttor: 24 timmar: CV = 0,59, CE = 0,11; 3 månader: CV = 0,34, CE = 0,12; 6 månader: CV = 0,43, CE = 0,09; 12 månader: CV = 0,22, CE = 0,09.
Vi kvantifierade det totala antalet nybildade neuroner och deras långsiktiga överlevnad i råtthippocampus efter ECS med användning av den optiska fraktioneringsanordningen i samband med en BrdU-färgningsteknik 10 , 11 . Slutresultatet visade en basal neurogenes i de fyra grupperna av kontrolldjur, som inte skilde sig signifikant som en funktion av överlevnadstiden ( Figur 3 ). Vidare inducerade ECS en signifikant ökning av det totala antalet BrdU-positiva neuroner vid 24Timmar (259%, p <0,0001), 3 (229%, p <0,001), 6 (152%, p <0,05) och 12 månader (162%, p <0,05) efter experiment, jämfört med kontroller av djur.
Figur 3: Kvantitativa data av det totala antalet BrdU-positiva neuroner i GCL / SGZ hos råtthippocampus 10 , 11 .
Horisontella staplar representerar medelvärdena. Förkortningar: GCL, granulatcellskikt; SGZ, subgranulär zon; H, timmar; M, månader. **** p <0,0001, *** p <0,001 och * p <0,05 kontra kontroll (n = 11-12 per grupp). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Med hjälp av ECS som metod för att framkalla neurogenes finner vi en omedelbar ökning av 260% vid bildandet av nya BrdU-positiva neuroner i hippocampus. I denna pool av akut genererade neuroner fann vi 40% avgång från dag 1 till 3 månader, med nästan 50% av de nybildade neuronerna som överlevde minst 12 månader efter behandling 10 , 11 . Räkning av BrdU-märkta neuroner följde ett strikt provtagningsschema, varigenom hela hippocampusen skars i 80-pm tjocka sektioner följt av delprovtagning av varje 5: e sektion med en slumpmässig provtagningsstart mellan sektion 1 och sektion fem. Att tillhandahålla dessa sektioner väljs på ett systematiskt slumpmässigt sätt, detta är bevisligen en utmärkt metod för att minska varians av slutresultatet, utan uttömmande räkning 1 . Detta provtagningsschema tillät oss att räkna BrdU-positiva neuroner i ett genomsnitt på 12 (8-16) hippocampAl sektioner i varje råtthjärna, med en slutgiltighet på 9-11%.
Vid användning av fraktionsmetoden är det väsentligt att känna av fraktionen av sektionshöjden i vilken räkning utförs, eftersom vävnadsminskning och deformation ofta uppträder under histologisk behandling 14 . Vi såg faktiskt en betydande minskning av tjockleken i denna studie. Vidare bör det noteras att differentialvävnads krympning kan uppträda, såsom presenteras i Dorph-Petersen et al. 2001. Så länge som den fullständiga intressanta strukturen är tillgänglig för analys, leder dessa begränsningar inte till en bias av det totala antalet partiklar, dvs BrdU-positiva neuroner. I studier där vävnadsminskning är ett särskilt problem bör det alltid anges att resultaten erhålls i deformerad vävnad. I denna studie räknade vi i en disektorhöjd på 10 μm. Sektionerna i föreliggande studie hade en slutlig medeltjocklek av 26 μm, en 5-umSkyddszon överst och en 11-mm (medel) skyddsområde längst ner på sektionen. Dessa parametrar är acceptabla eftersom skyddszoner borde vara ungefär diametern hos de provtagna partiklarna.
Efter avgränsning av GCL / SGZ placerades disektorerna likformigt i det avgränsade området. Disektorerna ska placeras med en fast steglängd som optimerar provtagningen och räkningen för att effektivt uppnå uppskattningar med en precision som bestäms av utredaren. Optimal precision uppnås typiskt genom att räkna upp till 150-200 celler i varje intressant struktur 5 . I den föreliggande studien räknade vi ett medelvärde av 133 (intervall 33-372) BrdU-positiva neuroner i varje råtthippocampus. På grund av låga celltal i vissa av kontrolldjuren föll våra räkningar av BrdU-positiva neuroner under det allmänt acceptabla antalet celler som erfordras för att erhålla en lämplig precision, vilket resulterade i relativt höga CE-värden för dessa fall. HOwever, eftersom vi fick CE-värden på mindre än hälften av CV-värdena (se representativa resultatavsnitt) krävs ytterligare provtagning och räkning. De höga CV-värdena visar att den största bidragsgivaren till den observerade variationen härrör från den biologiska variationen. Faktum är att vi kan hävda att det genomsnittliga antalet BrdU-positiva neuroner som räknades i föreliggande studie var högre än nödvändigt. Till exempel uppnådde vi i en grupp råttor ett CE-värde på 9% och observerade ett CV-värde på 43%. I det här fallet kunde vi ha riktat oss till en precision på cirka 20%. Sammanfattningsvis är precisionen av det totala antalet BrdU-positiva neuroner i den föreliggande studien tillräcklig genom att det fångar verkliga behandlingseffekter på det verkliga antalet partiklar. På grund av den ganska stora biologiska variationen i vissa djurgrupper kunde samma uppskattningar ha erhållits med en acceptabel precision, trots mindre ansträngningar. Höga biologiska variationer inom grupper kan baraKompenseras genom att antalet djur ökar.
Man kan hävda att guldstandarden för att erhålla exakta celltal innebär en uttömmande räkning av alla föremål av intresse. Men i de flesta hjärnstudier är det inte en möjlighet på grund av det stora antalet celler. Även om det är mycket effektivare än uttömmande cellräkning, är den frivilliga fraktorn relativt tidskrävande i jämförelse med enkel screening av skillnader i cellnummer som är föredraget om det exakta antalet celler inte är väsentligt. Det är vår erfarenhet att skillnader på mer än 20-30% kan detekteras rent genom screeningprocedurer.
Om korrekt utförd ger provtagning med hjälp av designbaserad stereologi objektiva och exakta uppskattningar på ett effektivt sätt 1 . Den opartiska egenskapen hos stereologi producerar uppskattningar att när de replikeras approximerar den sanna populationens medelvärde och förbättrar reproducerbarheten hosUppskattning 21 . Initialt måste ett representativt urval av hela strukturen av intresse (i denna studie hippocampala GCL / SGZ) erhållas, vilket möjliggör uppskattning i en statistiskt giltig delmängd av sektionerna 4 . För att erhålla ett lämpligt antal sektioner och räknar prober tillämpar vi SURS, vilket minskar variansen jämfört med slumpmässig provtagning 8 . Dessutom säkerställer SURS att de intressanta partiklarna i strukturen samplas med samma sannolikheter oberoende av deras storlek, form, orientering och fördelning i strukturen. Som sådan är stereologin starkt rekommenderad när man får exakta och objektiva estimat är en central aspekt av projektet.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Susanne Sørensen för det skickliga tekniska biståndet. Detta arbete stöddes av bidrag från The Velux Foundation; Jascha Foundation; Aase och Ejnar Danielsens Stiftelse; Hartmann Brothers Foundation; Direktör Jacob Madsen och fru Olga Madsens Foundation; Doktor Sofus Carl Emil Friis och fru Doris Friis Trust; Stiftelsen 1870; Torben och Alice Frimodts Foundation och Stiftelsen för neurologisk forskning. Manuskriptredigering utfördes av Inglewood Biomedical Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- West, M. J. Introduction to stereology. 2012 (8), Cold Spring Harb. Protoc. 843-851 (2012).
- West, M. J. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias. Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression. Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).
- Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus. Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Kiëu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered. J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).
- West, M. J. Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material. Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).
- Olesen, M. V., Wörtwein, G., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study. Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).
- Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats. Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach. J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. Sydney. (1986).
- Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. 130 (2), 391-399 (2003).
- Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus. Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).
- Dorph-Petersen, K. A., et al. Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders. Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).
- Eriksen, N., et al. Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images. Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).
- Gundersen, H. J. Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope? Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).
