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Neuroscience

माउस प्राथमिक अनुमस्तिष्क granules न्यूरॉन्स में ंयूरॉन मौत और अध कि मॉडलिंग

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

इस प्रोटोकॉल 6-7 दिन पुराने पिल्ले, नुकसान और समारोह के अध्ययन के लाभ के लिए CGNs के कुशल transduction से अलग और संवर्धन प्राथमिक माउस सेरेब्रल granules न्यूरॉन्स (CGNs) के लिए एक सरल विधि का वर्णन है, और मॉडलिंग एनएमडीए-प्रेरित न्यूरॉनी excitotoxicity, कम पोटेशियम प्रेरित कोशिका मौत, डीएनए-क्षति, और oxidative तनाव ही संस्कृति मॉडल का उपयोग कर ।

Abstract

अनुमस्तिष्क granules ंयूरॉंस (CGNs) एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया ंयूरॉन मॉडल, सेरिबैलम में एक प्रचुर मात्रा में सजातीय जनसंख्या का गठन कर रहे हैं । उनके जंम के बाद विकास, बहुतायत, और पहुंच के प्रकाश में, CGNs ंयूरॉन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल हैं, जिसमें ंयूरॉन विकास, ंयूरॉंस प्रवास, और शारीरिक न्यूरॉन गतिविधि उत्तेजना । इसके अलावा, CGN संस्कृतियों excitotoxicity और apoptosis सहित कोशिका मृत्यु के विभिंन साधनों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करते हैं । संस्कृति में एक सप्ताह के भीतर, CGNs एक्सप्रेस N-मिथाइल-D-aspartate (एनएमडीए) रिसेप्टर्स, ंयूरॉन स्वास्थ्य और रोग में कई महत्वपूर्ण कार्यों के साथ एक विशिष्ट ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर । एनएमडीए के कम सांद्रता के अलावा झिल्ली ध्रुवीकरण को कुतर प्राथमिक CGN संस्कृतियों के साथ संयोजन के रूप में शारीरिक न्यूरॉन गतिविधि उत्तेजना मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि एनएमडीए के उच्च सांद्रता के अलावा मॉडल के लिए नियोजित किया जा सकता excitotoxic न्यूरॉन की चोट । यहाँ, अलगाव और संवर्धन की एक विधि 6 दिन पुराने पिल्ले के साथ ही एडिनोवायरस और lentiviruses द्वारा CGNs के आनुवंशिक हेरफेर से CGNs का वर्णन कर रहे हैं । हम भी कैसे एनएमडीए प्रेरित excitotoxicity, कम पोटेशियम प्रेरित apoptosis, oxidative तनाव और इन न्यूरॉन्स के transduction के बाद डीएनए क्षति को उत्तेजित करने पर अनुकूलित प्रोटोकॉल मौजूद ।

Introduction

अनुमस्तिष्क granules ंयूरॉंस (CGNs) अच्छी तरह से संस्कृति में विशेषता है और एक प्रभावी मॉडल के रूप में कार्य किया है के लिए ंयूरॉन मृत्यु और विकास के अध्ययन 1,2,3,4,5, 6. N-मिथाइल-D-aspartate (एनएमडीए) की प्रारंभिक अभिव्यक्ति विट्रो में CGN संस्कृतियों में रिसेप्टर्स उन्हें एनएमडीए प्रेरित संकेत का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल बनाता है. झिल्ली ध्रुवीकरण के साथ संयोजन के रूप में एनएमडीए के साथ इन रिसेप्टर्स के सक्रियकरण मॉडल शारीरिक न्यूरॉन गतिविधि उत्तेजना के लिए प्रयोग किया जाता है, और synaptic प्लास्टिक 7के तंत्र में अनुसंधान के लिए अनुमति दी है,8. इसके विपरीत, पर एनएमडीए ligand द्वारा इन रिसेप्टर्स की उत्तेजना मॉडल excitotoxicity, तीव्र मस्तिष्क क्षति और neurodegenerative रोगों में ंयूरॉन नुकसान का एक प्रमुख तंत्र के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 9. excitotoxicity की प्रेरण के लिए एक तंत्र कम ऑक्सीजन के साथ एटीपी भुखमरी के माध्यम से है, के रूप में तीव्र ंयूरॉन चोट के साथ देखा । यह झिल्ली ध्रुवीकरण और synapse में ग्लूटामेट रिहाई के स्तर को ऊंचा में परिणाम है । इन रिसेप्टर्स के माध्यम से अत्यधिक सीए2 + में ऊंचा ग्लूटामेट परिणाम द्वारा एनएमडीए रिसेप्टर के बाद अधिक उत्तेजना, जो बारी में सीए सहित कई रास्ते सक्रिय करता है2 +-सक्रिय teases, phospholipases, और endonucleases, गंभीर सेलुलर घटकों और कोशिका मृत्यु के अनियंत्रित क्षरण में जिसके परिणामस्वरूप । इसके अतिरिक्त, उच्च intracellular Ca2 + ऑक्सीजन मुक्त कण और mitochondrial क्षति 10,11की पीढ़ी की ओर जाता है ।

जबकि एनएमडीए-प्रेरित न्यूरॉनी excitotoxicity के बाद ंयूरॉन नुकसान के बहुमत कैल्शियम आमद के कारण है और Bax/Bak स्वतंत्र, कोशिका मृत्यु के अन्य तंत्र इस मॉडल से बाहर नहीं किया जा सकता है । दोनों और excitotoxicity के कारण कोशिका मौत की तरह अपोप्तोटिक की उपस्थिति आंशिक रूप से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) और डीएनए उच्च intracellular Ca की वजह से नुकसान की पीढ़ी के कारण है2 + स्तर 12। डीएनए क्षति अपोप्तोटिक तंत्र के माध्यम से ंयूरॉन मौत में परिणाम, अपोप्तोटिक कोशिका मृत्यु की पहचान के साथ संबद्ध किया जा रहा है, जैसे क्रोमेटिन जनता और अपोप्तोटिक निकायों की उपस्थिति के रूप में । apoptosis की प्रेरण mitochondria से cytochrome सी की रिहाई के माध्यम से मध्यस्थता है, और Bax/Bak oligomerization 13पर निर्भर होना दिखाया गया है । Bax/Bak oligomerization बाहरी mitochondrial झिल्ली में ताकना गठन को बढ़ावा देता है, cytochrome सी रिलीज में जिसके परिणामस्वरूप और समर्थक अपोप्तोटिक नियामकों के सक्रियण के रूप में हल्के कोरोनरी चोट के साथ देखा 14।

ROS के उत्पादन में antioxidants के कम अंतर्जात स्तर के कारण मस्तिष्क में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, बड़ी ऑक्सीजन की आवश्यकता के साथ मिलकर के लिए ंयूरॉंस कार्य 15। जब एक कोरोनरी घटना के संपर्क में, नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस, नाइट्रिक ऑक्साइड का उत्पादन और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में वृद्धि 14विनियमित है । ऑक्सीजन कण की वृद्धि की एकाग्रता डीएनए नुकसान में परिणाम और परोक्ष रूप से ऊर्जा भुखमरी का कारण बन सकता है । डीएनए के उच्च स्तर डबल-फंसे टूट पाली adp-ribose पोलीमरेज़-1 (प्प-1), एक युकेरियोटिक क्रोमेटिन-बाउंड प्रोटीन catalyzing से ADP-ribose इकाइयों के हस्तांतरण के लिए जिंमेदार के सक्रियकरण द्वारा उपचारात्मक है+, एक प्रक्रिया को अभिंन डीएनए मरंमत 16। हालांकि, अत्यधिक oxidative तनाव की वजह से नुकसान के साथ, प्प-1 सक्रियण ऊर्जा भुखमरी णड पर वृद्धि हुई नाली के कारण हो सकता है+, oxidative फास्फारिलीकरण के माध्यम से एटीपी उत्पादन के लिए एक आवश्यक सब्सट्रेट । अंत में, oxidative तनाव एक Bax में apoptosis ट्रिगर होगा/Bak निर्भर तरीके से mitochondrial cytochrome सी रिलीज के लिए अग्रणी है, और mitochondrial 17में CGNs पुननिर्माण प्रेरित दिखाया गया है ।

अंत में, CGN संस्कृतियों में पोटेशियम क्लोराइड (KCl) की एकाग्रता में परिवर्तन मॉडल कम पोटेशियम/ 18,19,20मध्यस्थता apoptosis के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जब कश्मीर के निंन स्तर को उजागर+, CGNs अलग शारीरिक परिवर्तन से गुजरना, दोनों mitochondrial श्वसन और glycogen की कटौती में जिसके परिणामस्वरूप, सेलुलर मांग 21की कमी के लिए जिंमेदार ठहराया, साथ ही साथ के स्तर में कमी नाभिकीय कारक-κB (NFκB) जो शोथ और synaptic संचरण सहित कार्यकलापों को विनियमित करता है 22. यह मॉडल ंयूरॉन विकास के दौरान कोशिका मृत्यु के अध्ययन के लिए विशेष रुचि का है । कम कश्मीर+ पर्यावरण और अधिक निकटता शारीरिक परिस्थितियों जैसा दिखता है, और कोशिका मौत की पहचान का कारण बनता है ंयूरॉन विकास 23के दौरान देखा ।

संक्षेप में, CGNs एक पुराना मॉडल प्रदान करने के लिए ंयूरॉन मौत और अध की अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच । निंनलिखित प्रोटोकॉल अलगाव और CGNs के संवर्धन की अनुमति देगा, अभिव्यक्ति या एक विशेष आनुवंशिक मार्ग के वायरस और न्यूरॉन की चोट और अध कि पतन का प्रतिनिधित्व करने के विभिंन तंत्र के माध्यम से ंयूरॉन मौत की प्रेरण का उपयोग कर के दमन ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यह प्रोटोकॉल उन कार्यविधियों के संशोधनों पर आधारित है जिनका पहले वर्णन किया गया है < सुप class = "xref" > 18 , < सुप class = "xref" > 24 , < सुप class = "xref" > 25 , < सुप वर्ग = "xref" > २६ , < सुप वर्ग = "xref" > २७ . इस प्रोटोकॉल मैकगिल विश्वविद्यालय में पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित है ।

< p class = "jove_title" > 1. प्रायोगिक तैयारी

< p class = "jove_content" > नोट: निम्न स्टॉक समाधानों का उपयोग करने तक तैयार और बनाए रखा जा सकता है.

  1. विच्छेदन समाधान
    1. भंग ३.६२ जी का सोडियम क्लोराइड (NaCl), ०.२ ग्राम पोटेशियम क्लोराइड (KCl), ०.०६९ ग्राम का सोडियम फॉस्फेट (णः 2 PO 4 & #8729; ज 2 O), और १.३०६ g के D-(+)-ग्लूकोज की ५०० मिलीलीटर में आसुत H 2 O. फिर HEPES बफर के १२.५ मिलीलीटर, ४५० & #181; Phenol लाल समाधान के एल, और BSA अंश वी के 20 मिलीलीटर के समाधान के लिए जोड़ें । समायोजित करने के लिए पीएच ७.४ का उपयोग कर 1 N सोडियम हीड्राकसीड (NaOH).
    2. नसबंदी के साथ एक ०.२२ & #181; m फिल् म और स्टोर पर 4 & #176; ग. यह समाधान 10 दिनों तक एक सप्ताह तक स्थिर रहेगा ।
  2. Trypsin
    1. ०.९% सोडियम क्लोराइड में Trypsin के 25 ग्राम/एल की एकाग्रता पर एक शेयर समाधान तैयार करें । समाधान को संग्रह-20 & #176; C.
  3. Trypsin अवरोधक
    1. 1 मिमी एचसीएल के १०० मिलीलीटर में चिकन अंडे सफेद Trypsin अवरोधक के 1 जी भंग करके 10 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के साथ एक शेयर तैयार करें । इस समाधान को इस पर संग्रहीत करें-20 & #176; C.
  4. DNase
    1. भंग १०० बाँझ पानी की 10 मिलीलीटर में DNase 1 के मिलीग्राम 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक उत्पन्न करने के लिए । समाधान को संग्रह-20 & #176; C.
  5. MgSO 4
    1. Add ६.०२ g of मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO 4 ) से ५० मिलीलीटर तक आसुत जल (H 2 O) को 1 M शेयर जनरेट करें । हल को 4 & #176; C.
      2. पर संग्रहीत करना
  6. CaCl 2
    1. भंग ०.७३५ कैल्शियम क्लोराइड की छ (CaCl 2 & #8729; 2H 2 o) में ५० मिलीलीटर की आसुत एच 2 हे के एक शेयर एकाग्रता १०० मिमी । 4 & #176 पर संग्रह समाधान; C.
  7. KCl
    1. भंग ३.७२७५ के ५० मिलीलीटर में KCl के आसुत ज 2 O का एक शेयर एकाग्रता के लिए 1 एम. स्टोर समाधान पर 4 & #176; ग.
  8. d-(+)-ग्लूकोज
    1. भंग १.८०२ जी के डी-(+)-ग्लूकोज की ५० मिलीलीटर में आसुत H 2 O १०० mM की एक शेयर एकाग्रता करने के लिए । 4 & #176 पर संग्रह समाधान; C.
  9. सेल कल्चर मिडिया
    1. सेल कल्चर मीडिया को निम्नानुसार तैयार करें: गर्मी के 5 मिलीलीटर निष्क्रिय dialyzed भ्रूण गोजातीय सीरम, ५०० & #181; l की २०० mM l-Glutamine, १०० & #181; l की ५० mg/मब गेन्तमयसीं और 1 मिलीलीटर की १.० M KCL को ४५ मिलीलीटर से जोड़ा जाना चाहिए of फ़िल्टर निष्फल ईगल & #39; s ंयूनतम आवश्यक मीडिया (E-मेम) कि १.१२५ g/L D-ग्लूकोज के साथ पूरक है अनुमस्तिष्क granules ंयूरॉन संस्कृति मीडिया के ५० मिलीलीटर उत्पंन करने के लिए । स्टोर मीडिया पर 4 & #176; ग.
  10. Cytosine बीटा-डी-Arabino Furanoside
    1. भंग ४८ 20 मिमी के एक शेयर एकाग्रता के लिए विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर में Cytosine बीटा-डी-Arabino Furanoside के मिलीग्राम । संग्रह समाधान at-20 & #176; C.
  11. पाली-डी-Lysine
    1. उत्पन्न करने के लिए एक 2 मिलीग्राम/एमएल पाली डी-Lysine स्टॉक, जोड़ें 10 मिलीलीटर के बाँझ ज 2 हे करने के लिए 20 मिलीग्राम की पाली डी-Lysine. स्टॉक पाली D-lysine पर संग्रहित किया जाना चाहिए-८० & #176; ग म १०० & #181; L aliquots.
  12. नोट: निम्नलिखित समाधानों को विच्छेदन से पहले तैयार किया जाना चाहिए और 4 & #176 पर बनाए रखा जाना चाहिए; C तक उपयोग करें.
  13. MgSO 4 पूरण विच्छेदन हल
    1. Add ३०० & #181; L ऑफ स्टॉक MgSO 4 से २५० मिलीलीटर का विच्छेदन समाधान.
  14. Trypsin विच्छेदन हल
    1. Add १०० & #181; l ऑफ स्टॉक Trypsin और 12 & #181; l ऑफ स्टॉक MgSO 4 से 10 मिलीलीटर का विच्छेदन समाधान.
  15. Trypsin अवरोधक समाधान 1
    1. Add १६४ & #181; l ऑफ स्टॉक Trypsin अवरोधक, २५० & #181; l ऑफ स्टॉक DNase 1 र 12 & #181; l ऑफ स्टॉक MgSO 4 से 10 मिलीलीटर का विच्छेदन समाधान.
  16. Trypsin अवरोधक हल 2
    1. Add १०४० & #181; l ऑफ स्टॉक Trypsin अवरोधक, ७५० & #181; l ऑफ स्टॉक DNase 1 र 12 & #181; l ऑफ स्टॉक MgSO4 से 10 मिलीलीटर का विच्छेदन समाधान.
  17. CaCl 2 supplements section समाधान
    1. जोड 10 & #181; l द स्टॉक CaCl 2 र 25 & #181; l द स्टॉक MgSO 4 से 10 मिलीलीटर का विच्छेदन समाधान.
  18. पाली डी-Lysine लेपित संस्कृति व्यंजन
    1. कोट संस्कृति व्यंजन, पतला १०० & #181; शेयर का L प पाली डी-Lysine में ४० मिलीलीटर की बाँझ ज 2 हे. ३५ मिमी Nunc संस्कृति व्यंजन के लिए, पतला पाली डी Lysine समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें । के लिए 4 अच्छी तरह से प्लेटें, जोड़ें ३०० & #181; पतला पाली डी के एल-Lysine प्रत्येक अच्छी तरह से ।
    2. चलो पाली डी-lysine aspirating से पहले 1 ज के लिए बैठो और 4 मिलीलीटर या ६०० & #181 के साथ एक अच्छी तरह से धोने; एल (३५ mm संस्कृति व्यंजन या 4 अच्छी प्लेटें के लिए क्रमशः) बाँझ की h 2 ओ. इसके बाद महाप्राण को h 2 हे और व्यंजन को 1 ज.
      3. के लिए सुखा कर हवा दें
< p class = "jove_title" > 2. मस्तिष्क निष्कर्षण और अलगाव की सेरिबैलम

  1. Decapitate एक 6-7 दिन पुराने माउस decapitation कैंची का उपयोग पिल्ला । एक बाँझ ऊतक संस्कृति डाकू में मस्तिष्क के विच्छेदन प्रदर्शन.
  2. मस्तिष्क को दूर करने के लिए, सिर लोभी संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर और सिर के पूर्वकाल की ओर त्वचा के माध्यम से कट microdissection कैंची का उपयोग कर के रूप में प्रदर्शित < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 . फिर एक नई जोड़ी कैंची का उपयोग कर खोपड़ी की हड्डी के माध्यम से कटौती करने के लिए संदूषण के जोखिम को कम । संदंश का उपयोग कर मस्तिष्क को कवर खोपड़ी निकालें और संदंश या एक रंग का उपयोग कर मस्तिष्क को चिढ़ाते हैं ।
    1. के रूप में की जरूरत है, ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से कटौती के लिए एक पूरे के रूप में मस्तिष्क बाहर हो रही सुविधा ।
  3. MgSO 4 के साथ पूरक है जो विच्छेदन समाधान में मस्तिष्क जगह । समाधान और मस्तिष्क बर्फ पर रखें.
  4. मस्तिष्क हटाने के बाद, एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे, टुकड़े मस्तिष्क से सेरिबैलम बाहर जबकि अभी भी MgSO में 4 पूरक विच्छेदन समाधान, और मेनिन्जेस ठीक संदंश का उपयोग कर हटा दें । अपनी ventral पक्ष को सेरिबैलम मुड़ें और रंजित जाल के हटाने बीमा ।
  5. पूल में cerebella एक ३५ मिमी युक्त पकवान ~ MgSO 4 पूरक विच्छेदन समाधान की 1 मिलीलीटर ।
  6. छोटे टुकड़ों में ऊतक काटना और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण MgSO 4 बफर भंग समाधान के 30 मिलीलीटर से युक्त ।
< p class = "jove_title" > 3. माउस अनुमस्तिष्क granules ंयूरॉन अलगाव और संवर्धन

  1. ५० एमएल ट्यूब 5 मिनट के लिए कटा हुआ मस्तिष्क ऊतक युक्त ६४४ x g पर और 4 & #176; C.
  2. supernatant निकालें और trypsin विच्छेदन समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें । फिर 15 मिनट के लिए हाई स्पीड पर ट्यूब शेक ३७ & #176; C.
  3. trypsin अवरोध करनेवाला समाधान 1 के 10 मिलीलीटर ट्यूब और रॉक करने के लिए धीरे जोड़ें 2 min.
    4. के लिए
  4. केंद्रापसारक ट्यूब के लिए 5 मिनट में ६४४ x g और 4 & #176; C.
  5. निकालें supernatant और के 2 मिलीलीटर जोड़ें trypsin अवरोध करनेवाला समाधान 2, और फिर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण.
  6. Triturate 15 मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक जब तक समाधान संदिग्ध हो जाता है । तो 5 मिनट के लिए बसने दो.
  7. साफ़ supernatant को हटा दें और supernatant को एक नई ट्यूब पर ट्रान्सफर करें जिसमे 1 मिलीलीटर की CaCl 2 पूरक विच्छेदन समाधान.
  8. ३.६ कदम से गोली युक्त ट्यूब के नीचे करने के लिए trypsin अवरोध करनेवाला समाधान 2 की एक और मिलीलीटर जोड़ें । फिर Triturate और 5 मिनट के लिए बसने दो । supernatant निकालें और यह ३.७ कदम से supernatant युक्त ट्यूब करने के लिए जोड़ें (है कि एक दोहराने के कदम 3.6-3.7) । इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक ऊतक के अधिकांश यांत्रिक असंबद्ध.
  9. जोड़ें ०.३ मिलीलीटर की CaCl 2 पूरक विच्छेदन समाधान supernatant संग्रह करने के लिए supernatant के हर एमएल के लिए
  10. ट्यूब की सामग्री मिश्रण है और फिर ६४४ x g.
    11. पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक
  11. supernatant निकालें और गोली और मिश्रण करने के लिए ताजा मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
  12. कोशिकाओं को फिर गिना जा सकता है और १.५ x 10 6 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता को पतला । कृपया ध्यान दें कि सामान्य १०,०००,००० कोशिकाओं में प्रत्येक विच्छेदित मस्तिष्क से आशा की जाती हैं, trypsinization समय और विच्छेदन की दक्षता पर निर्भर. प्लेट कोशिकाओं पर पहले से बना पॉली डी-lysine प्लेट्स । 4 के लिए अच्छी तरह से प्लेटें, प्लेट ०.५ मिलीलीटर, ७.५ x 10 5 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से दे रही है । ३५ मिमी के व्यंजन, प्लेट 4 मिलीलीटर, 6 x 10 6 कोशिकाओं प्रति थाली दे रही है ।
  13. 24 ज के बाद, add cytosine-& #946;-arabino furanoside (अरैक) प्लेटों को glial दूषण को कम करने के लिए । मीडिया के प्रत्येक एमएल के लिए ०.५ & #181; एल ऑफ 20 एमएम अरैक की आवश्यकता है । अरैक के अलावा एक मीडिया परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है । यदि 7-8 दिनों के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए कर रहे हैं, 3 दिन पर इस उपचार को दोहराएँ.
  14. में संस्कृतियों को बनाए रखने के एक 5% सह 2 मशीन में ३७ & #176; सी और फीड विथ १०० & #181; एल ऑफ १०० mM ग्लूकोज हर 2 दिनों में पिछले 5 दिनों के प्रत्येक 2 मिलीलीटर के लिए संस्कृति में जोड़ा गया । एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है ।
< p class = "jove_title" > 4. Lentivirus पैकेजिंग, शुद्धिकरण और अनुमापन

< p class = "jove_content" > नोट: पैकेजिंग, एकाग्रता, शुद्धिकरण और Lentivirus के अनुमापन के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग बिना किसी किट के पहले विस्तार से बताया गया है < सुप class = "xref" > 28 , अनुमापन के लिए वैकल्पिक तरीकों सहित, जैसे फ्लो cytometry < सुप क्लास = "xref" > 29 . यहाँ हम संक्षेप में तेजी से वायरस शुद्धि समाधान और एक qPCR lentiviral अनुमापन किट का उपयोग कर न्यूरॉन्स की चोट का अध्ययन करने के लिए lentivirus के उत्पादन के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल मौजूद.

  1. प्लेट Hek293T कोशिकाओं में 10 सेमी कल्चरल डिश के साथ Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल & #39; एस न्यूनतम आवश्यक मध्यम (DMEM) 10% FBS के साथ पूरक. एक उच्च वायरल titer प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक अभिकर्मक के लिए Hek293T कोशिकाओं के कम से 5 प्लेटें बढ़ती । अभिकर्मक कोशिकाओं के दिन पर सुनिश्चित करें कि ७०% धाराप्रवाह हैं । अभिकर्मक.
    2. से तीन घंटे पहले मीडिया बदलें प्रत्येक अभिकर्मक के लिए
  2. , दो ट्यूबों तैयार करते हैं । ट्यूब में 1 जोड़ १.५ एमएल मेम कम सीरम मीडिया और ४१ & #181; अभिकर्मक रिएजेंट के एल, मिश्रण अच्छी तरह से । ट्यूब 2 में, मेम-कम सीरम मीडिया के १.५ मिलीलीटर जोड़ें और 6 & #181; के g लए अंतरण प्लाज्मिड, 6 & #181; के g लए pCMV-डा0 8.2 सदिश (पैकेजिंग प्लाज्मिड), 3 & #181; g pCMV-VSV-g वेक्टर (लिफ़ाफ़ा प्लाज्मिड), और ३५ & #181; L का p3000 बढ़ाने वाला रिएजेंट (lipofectamine के साथ आपूर्ति). मिश्रण अच्छी तरह से, और ट्यूबों 1 और 2, भंवर और 15 min.
    3. के लिए मशीन गठबंधन
  3. Hek293T प्लेटों से मीडिया का ५०% निकालें और कोशिकाओं को डीएनए-लिपिड परिसरों जोड़ें । ३७ & #176 पर 6 ज के लिए मशीन; ग, 5% कं 2 । मीडिया निकालें और ताजा DMEM के 5 मिलीलीटर के साथ बदलें, रात भर गर्मी ।
  4. में 24 ज पोस्ट-अभिकर्मक, प्रत्येक प्लेट से वायरल supernatant का पहला बैच लीजिए । वायरल मीडिया को 4 & #176 पर रखें; सी और Hek293T कोशिकाओं की प्रत्येक थाली में ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें । रात भर गर्मी.
  5. ४८ एच पोस्ट-अभिकर्मक, वायरल supernatant के दूसरे बैच इकट्ठा, पहले बैच के साथ गठबंधन और ६०० x g.
    6. में 10 मिनट के लिए संयुक्त वायरल supernatant केंद्रापसारक
  6. फ़िल्टर के माध्यम से supernatant को ४५ & #181; मी पोरे आकार.
  7. एक तेजी से वायरस शुद्धि समाधान का उपयोग कर वायरस शुद्ध । वायरल supernatant के हर ४५ मिलीलीटर के लिए, lentiviral बाध्यकारी समाधान, मिश्रण के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक & #62; ५,००० x g और 4 & #176; C.
  8. supernatant सावधानी से निकालें ताकि गोली परेशान करने के लिए नहीं है ।
  9. Add 20-40 & #181; यम के एल और गोली को पुनः निलंबित. Aliquot और स्टोर पर-८० & #176; ग.
  10. प्राप्त करने के लिए lentiviral titer, एक qPCR lentiviral अनुमापन किट का प्रयोग किया जाता है । पतला 2 & #181; शुद्ध वायरस के एल में ५०० & #181; पंजाब के एल. 2 & #181; पतला वायरस के 18 & #181; l के वायरस lysis बफर (किट में प्रदान की) एल जोड़ें.
  11. triplicates में तीन अलग आरटी-क्यू-पीसीआर प्रतिक्रियाओं की स्थापना की और के रूप में उन्हें लेबल, वायरल lysate, सकारात्मक नियंत्रण 1 (STD1), और सकारात्मक नियंत्रण 2 (STD2) । त्यात प्रत्येक प्रतिक्रिया जोड, १२.५ & #181; के एल 2x qPCR MasterMix, २.५ & #181; या तो वायरल lysate या STD1 (किट में प्रदान की) या STD2 (किट में प्रदान की गई), और 10 & #181; एल ऑफ रिएजेंट-मिक्स (किट में प्रदान की) में ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों ।
  12. इस प्रकार के रूप में पीसीआर कार्यक्रम सेट: पर 20 मिनट में ४२ & #176; ग के लिए रिवर्स प्रतिलेखन, 10 मिनट पर ९५ & #176; c एंजाइम सक्रियण के लिए, ४० चक्र 15 एस के ९५ & #176; c के लिए विकार और 1 मिनट पर ६० & #176; c for एनीलिंग/विस्तार.
  13. इस सूत्र का उपयोग कर वायरल titer की गणना:
    Titer of viral lysate = 5 x 10 7 /2 3 (Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1) .
    Ctx = औसत सीटी मान अज्ञात नमूना की, Ct1 = औसत मान STD1 का, Ct2 = औसत मान STD2.
    का नोट: CGNs lentiviruses या एडिनोवायरस से संक्रमित चोट की विधा पर निर्भर करता है के साथ सबसे अच्छा transduced किया जा सकता है अध्ययन किया जा रहा है । 2-3 के एक मुि में सेल संस्कृति समाधान के लिए lentiviruses के अलावा चढ़ाना के समय संस्कृति के 7 दिन में एनएमडीए प्रेरित संकेत अध्ययन किया जाता है । यह ८०% से अधिक transduction में परिणाम है और इन न्यूरॉन्स के जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ आगे बढ़ाने के लिए उपयुक्त है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ). संस्कृति के 5 दिन में एडिनोवायरस के अलावा (मुि ५० पर) और अध्ययन एनएमडीए प्रेरित संकेत दिन 7-8 में इमेजिंग के रूप में अंय तकनीकों के लिए प्रयोग किया जाता है । इस उपचार न्यूरॉन्स के 10% से कम संक्रमण में परिणाम, यह इमेजिंग और सह प्रोटीन के स्थानीयकरण के लिए आदर्श बना. एडिनोवायरस दिन 2-3 या oxidative तनाव हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा द्वारा camptothecin के अलावा डीएनए क्षति प्रेरित सेल मौत का अध्ययन करने के लिए चढ़ाना के समय इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रतिदीप्ति प्रोटीन की उपस्थिति (GFP, आरएफपी, transduction या YFP) ब्याज के जीन के लिए टैग प्रतिशत और संभावित विषाक्तता अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अनुशंसित मुि के साथ, हम मिनिमल विषाक्तता और अधिकतम transduction (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ) देखते हैं.
< p class = "jove_title" > 5. मॉडलिंग न्यूरॉन्स चोट

  1. के लिए प्रेरित एनएमडीए प्रेरित ंयूरॉन excitotoxicity, निंनलिखित 7 दिन इन विट्रो , CGNs के साथ इलाज १०० & #181; m एनएमडीए र 10 & #181; m glycine 1 ज. के साथ समानांतर संस्कृतियों से वातानुकूलित मध्यम के साथ सभी मध्यम बदलें उपचार. इस एकाग्रता परिणाम 24 में ५०% सेल मौत एच पद उपचार (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 सी ). Mitochondrial विखंडन 6-8 एच पोस्ट उपचार में स्पष्ट है (देखें जहनी-Asl एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > २६ , < सुप वर्ग = "xref" > २७ ).
  2. प्रेरित ROS-प्रेरित कोशिका मृत्यु (oxidative stress), न्यूरो उपचार75-100 & #181 के साथ एनएस; मी हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ 2 ) और समानांतर संस्कृतियों से वातानुकूलित मीडिया के लिए स्विच करने के लिए 5 मिनट के जोखिम के बाद एच 2 हे 2 . ध्यान दें, एच 2 ओ 2 की अस्थिरता के कारण, एक स्तर है कि उपचार के 24 ज निंनलिखित संस्कृति में 50-70% कोशिका मृत्यु लाती है एकाग्रता का अनुकूलन ।
  3. डीएनए क्षति प्रेरित कोशिका मृत्यु, CGNs के साथ इलाज 10 & #181; मी camptothecin. इस एकाग्रता से अधिक ५०% सेल 24 घंटे Mitochondrial विखंडन में मृत्यु और जल्दी अपोप्तोटिक संकेत होता है 2-3 इस एकाग्रता में camptothecin के अलावा के बाद एच लाती है (देखें जहनी-Asl एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > 18 )
  4. के लिए प्रेरित करने के लिए कम K + प्रेरित न्यूरॉनी apoptosis में CGNs, परिवर्तन मीडिया युक्त 25 मिमी k + से कम पोटेशियम मीडिया के साथ 5 मिमी k + के बाद 7 दिन इन विट्रो .

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Representative Results

सावधान विच्छेदन के साथ, बरकरार मस्तिष्क आंकड़ा 1aबीमें देखा के रूप में ंयूनतम क्षति के साथ हटाया जाना चाहिए । प्रयास को हटाने के दौरान मस्तिष्क को नुकसान को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए, विशेष रूप से सेरिबैलम को नुकसान । सेरिबैलम हानिकारक और अधिक कठिन पहचान और मेनिन्जेस के पूर्ण हटाने के लिए बनाता है, और न्यूरॉन्स संस्कृति के संदूषण की संभावना बढ़ जाती है. एक बार मेनिन्जेस हटा दिया गया है, सेरिबैलम शेष ऊतक से विच्छेदित किया जा सकता है के रूप में चित्रा 1C में देखा और पृथक्करण के लिए तैयार किया ।

चढ़ाना से पहले, CGNs lentivirus के साथ transduced जा सकता है या एडीनोवायरस के साथ संक्रमित के रूप में चित्रा 2में वर्णित है । हम एडीनोवायरस के साथ संक्रमण के लिए मुि ५० के साथ अधिकतम दक्षता और न्यूनतम विषाक्तता पाते हैं, और lentivirus के लिए चढ़ाना के दिन में 2-3 की एक मुि (चित्रा 3) ।

Transduced स्वस्थ CGN संस्कृतियों 7 DIV में चित्रा 3ए में प्रस्तुत कर रहे हैं । यदि बड़ी संख्या में glia संस्कृति में विद्यमान रहते हैं, तो शुद्ध न्यूरॉन जनसंख्या सुनिश्चित करने के लिए अरैक की एकाग्रता को बढ़ाया जा सकता है । इसके अलावा glial कोशिकाओं को और अधिक आसानी से ंयूरॉंस से वायरस ले और जो महत्वपूर्ण हो जाता है अगर transductions 5 दिन में प्रदर्शन कर रहे हैं । कोशिका मृत्यु के दौर से गुजर न्यूरॉन्स की उपस्थिति pyknotic नाभिक के गठन के रूप में चित्रा 3सी में देखा द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. एनएमडीए के सभी सांद्रता, एच2ओ2, और Camptothecin 24 एच के बाद ५०% सेल मौत प्रेरित करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । यह mitochondrial विखंडन जैसे न्यूरॉन हानि से पहले अन्य प्रारंभिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है.

Figure 1
चित्रा 1: माउस मस्तिष्क को हटाने और सेरिबैलम के विच्छेदन. (ए) एक 6-7 दिन पुराने माउस के मस्तिष्क निकालने के लिए, संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर, सिर पकड़ और microdissection कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर बिंदीदार लाइनों के साथ पूर्वकाल त्वचा में कटौती । केवल त्वचा और संयोजी ऊतक में कटौती करने के लिए सावधान रहें, बहुत गहरी एक चीरा खोपड़ी पंचर और मस्तिष्क को नुकसान हो सकता है । इन तीन चीरा, सीधे midline साथ, और दो curving बाद में, त्वचा के लिए अनुमति देने के लिए वापस खोपड़ी खुलासा धक्का दे दिया । एक बार उजागर, खोपड़ी कैंची की नोक के साथ प्रवेश किया जा सकता है, और पूर्वकाल में कटौती । महान देखभाल के लिए सेरिबैलम को नुकसान की पहचान और मेनिन्जेस को हटाने की सुविधा नहीं लिया जाना चाहिए । एक बार कटौती, संदंश वापस खोपड़ी छील करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मस्तिष्क जो तो शांत विच्छेदन संदंश या रंग की एक जोड़ी का उपयोग कर समाधान में छेड़ा जा सकता है उजागर । आदेश में मस्तिष्क को दूर करने के लिए, ऑप्टिक तंत्रिका गंभीर होने की आवश्यकता हो सकती है । (ख) एक बार खोपड़ी से हटा दिया, मेनिन्जेस ठीक इत्तला दे दी संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर सेरिबैलम से हटा दिया जाना चाहिए । (ग) ठीक इत्तला दे दी संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, सेरिबैलम शेष ऊतक से विच्छेदित है और मेनिन्जेस की पूरी तरह से हटाने को सुनिश्चित करने के लिए निरीक्षण किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: मॉडलिंग अनुमस्तिष्क granules ंयूरॉंस में न्यूरॉन चोट । पृथक cerebella दिन से 6-7 चूहों एकल कोशिकाओं में असंबद्ध 3 भाग में प्रस्तुत की प्रक्रिया का पालन कर रहे हैं । पृथक्करण के बाद, कोशिकाओं को गिना जाता है और संस्कृति मीडिया के एक खंड में reसस्पैंड १.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल के लिए उत्पंन करने के लिए, ३५ मिमी व्यंजन के लिए, 4 मिलीलीटर चढ़ाया जाता है, प्रति प्लेट 6 x 106 कोशिकाओं दे रही है । इमेजिंग स्लाइड्स के लिए ०.५ एमएल चढ़ाया गया है, दे ७.५ x 105 सेल/ CGNs तो lentivirus के साथ transduced या एडीनोवायरस से संक्रमित हो सकता है. चढ़ाना के दिन पर एडीनोवायरस का प्रयोग (0 दिनों में इन विट्रो (DIV)) से अधिक ९०% अभिकर्मक दक्षता देता है और oxidative तनाव और डीएनए क्षति के माध्यम से ंयूरॉन चोट के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । 10 µ एम camptothecin (CPT) के अलावा डीएनए क्षति पैदा करेगा, जबकि 75-100 µ मीटर हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) oxidative तनाव पैदा करेगा । एच2ओ2 की एकाग्रता को 24 के बाद ५०% कोशिका मृत्यु प्रेरित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । 5 DIV पर एडिनोवायरस के साथ संक्रमण से कम 10% की एक कम transduction दक्षता देता है । पर 7 DIV जब एनएमडीए रिसेप्टर्स संस्कृति में समृद्ध कर रहे हैं, ंयूरॉंस के साथ इलाज किया जा सकता १०० µ m एनएमडीए और 10 µ मीटर glycine प्रेरित करने के लिए । यह बाद इमेजिंग विश्लेषण के लिए आदर्श है या एक एकल ंयूरॉन अनुरेखण । अंत में, 0 div पर lentivirus के साथ transducing, १०० µ एम एनएमडीए और 10 µ एम glycine 7 div पर के साथ इलाज के बाद, एक पर्याप्त उच्च transduction दक्षता देता है (& #62; ८०%) संस्कृति के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए, चिप अनुक्रमण सहित, की जांच प्रोटीन अभिव्यक्ति, और जीवित प्रदर्शन/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अनुमस्तिष्क granules न्यूरॉन्स । (A) न्यूरॉन्स चढ़ाना के समय 3 में से एक मुि पर आरएफपी के लिए lentiviruses के साथ transduced थे, और तय और इन विट्रो में 7 दिन पर दाग. आरएफपी संकेत, MAP2, और Hoechst के Colocalization स्वस्थ ंयूरॉंस कि transduced द्वारा पूरी तरह से lentiviruses है प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है । (B) छवियां विभिंन मुि से संक्रमित न्यूरॉन्स के जीवित मृत परख विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करती हैं, विषाक्तता को मापने के लिए । 25 और ५० के बीच एक मुि में LacZ व्यक्त एडीनोवायरस से संक्रमित CGNs न्यूनतम विषाक्तता को बनाए रखते हुए अधिक से अधिक दक्षता के लिए अनुमति देता है. सेल अस्तित्व में एक 1% अंतर से कम नियंत्रण की तुलना में देखा जाता है जब इस मुि में संक्रमण । (ग) Hoechst नियंत्रण CGNs और CGNs के एनएमडीए के साथ इलाज के लिए सेल मौत पैदा दाग । एनएमडीए उपचार के साथ pyknotic नाभिक के गठन पर ध्यान दें । यह कोशिका मृत्यु का संकेत है, और १०० µ एम एनएमडीए और 10 µ एम Glycine के साथ उपचार के बाद संस्कृति 24 ज के लगभग ५०% में देखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां हम प्राथमिक माउस अनुमस्तिष्क granules न्यूरॉन्स (CGNs), हानि और समारोह के अध्ययन के लाभ के संवर्धन के लिए एक सरल तरीका प्रदान करते हैं, और सेल मौत के विभिंन तंत्र मॉडलिंग । कई कारकों इस प्रक्रिया है जो बंद निगरानी की आवश्यकता का उपयोग कर परिणामों के reproducibility को प्रभावित करते हैं । इनमें संस्कृति में glial कोशिकाओं के उन्मूलन, संस्कृति का संगम, और स्वस्थ कोशिकाओं को बनाए रखने सहित संस्कृति की पवित्रता शामिल है । इन कारकों में परिवर्तनशीलता का परिचय परिणाम पूर्वाग्रह और reproducibility चुनौती कर सकते हैं । नीचे हम कारक है कि नकारात्मक परिणामों को प्रभावित कम करने के लिए कैसे का वर्णन ।

CGNs संस्कृति से glial कोशिकाओं को खत्म करने और एक शुद्ध ंयूरॉन जनसंख्या स्थापित करने के लिए, हम cytosine के 10 µ मीटर का उपयोग करें-β-arabino furanoside (अरैक), एक न्यूक्लियोटाइड antimetabolite कि डीएनए संश्लेषण बाधा द्वारा proliferating कोशिकाओं को मारता है. अगर अभी भी glial कोशिकाओं की आबादी मौजूद है तो अरैक की एकाग्रता को बढ़ाकर 15 µ मीटर तक किया जा सकता है । यह भी बहुत निर्भर है । इसके अलावा, संस्कृतियों है कि अप करने के लिए 7-8 दिनों के लिए बनाए रखा जाता है के लिए, एक दूसरे अरैक उपचार 3 दिन पर प्रदर्शन किया जा सकता है । एक शुद्ध ंयूरॉन जनसंख्या को प्राप्त करने और सेल मौत से बचने के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए सेरिबैलम बंद सभी मेनिन्जेस छील से पहले टुकड़ों में ऊतक काटने, trypsinization द्वारा पीछा किया । यह समय की एक हद तक कम अवधि में किया जाना चाहिए (सेरिबैलम प्रति 7-10 मिनट से अधिक नहीं) । अस्वस्थ संस्कृति और अंततः कोशिका मृत्यु में ंयूरॉन संस्कृति परिणामों में मेनिन्जेस की उपस्थिति । एक और पहलू यह है कि उपचार से पहले ंयूरॉंस की मौत में परिणाम trypsinization समय हो सकता है । यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को खत्म नहीं कर रहे है-trypsinized । दूसरी ओर, trypsinization कोशिकाओं है कि उंहें नुकसान या कम उपज में परिणाम हो सकता है की आगे यांत्रिक पृथक्करण की आवश्यकता है । इसलिए, trypsinization समय अनुकूलन की आवश्यकता है और यह बहुत निर्भर है ।

माना जाने वाला अगला कारक प्रयोग के समय कोशिकाओं का संगम होता है. विभिंन प्रवाह परिणामों में परिवर्तनशीलता उत्पंन कर सकते हैं । यह विशेष रूप से प्रयोगों में readout के आधार पर महत्वपूर्ण है । एक कम संगम राज्य के साथ, न्यूरॉन्स 2-3 दिनों के बाद झुरमुट के लिए शुरू करते हैं । न्यूरॉन्स की एक बहुत कम या बहुत उच्च संगम राज्य संकेत. यह सटीक चढ़ाना के लिए जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

CGN संस्कृतियों के अंय तरीकों का वर्णन किया गया है, विशेष रूप से बुनियादी संवर्धन एक Papain पृथक्करण प्रणाली किट 30 का उपयोग कर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पोस्ट-संवर्धन प्रक्रियाओं और CGN के हेरफेर में आदेश के लिए ंयूरॉंस प्रवास का अध्ययन करने पर देख और आकृति 31. ली एट अल द्वारा प्रस्तुत प्रोटोकॉल । Papain पृथक्करण सिस्टम किट के उपयोग का वर्णन करता है । वे अलग CGNs की पवित्रता बढ़ाने के लिए दो तरीकों की सिफारिश: एक Percoll ढाल जुदाई के माध्यम से कोशिकाओं को चलाने, साथ ही पूर्व एक पाली-डी-Lysine प्लेट पर 20 मिनट के लिए चढ़ाना । दोनों तरीकों को glial संदूषणों से CGNs की जुदाई में सहायता कर रहे हैं । यह अरैक के साथ मामले में इलाज की सिफारिश की है अकेले शुद्ध ंयूरॉन संस्कृति के लिए समृद्ध करने के लिए पर्याप्त नहीं है । इसके अतिरिक्त, ली 4-6 दिन पुराने माउस पिल्ले का उपयोग करता है, जबकि यह न्यूरॉन विभेद की जांच के लिए एक प्रभावी मॉडल कार्य करता है; हम 6-7 दिन पुराने माउस पिल्ले से CGNs का उपयोग कर पाते है और अधिक ंयूरॉन चोट के अध्ययन के लिए उपयुक्त है । Holubowska एट अल. पोस्ट mitotic अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स के अभिकर्मक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है कैल्शियम फॉस्फेट विधि का उपयोग इन विट्रो और electroporation में vivo. इन ंयूरॉंस में एक एकल ंयूरॉन का पता लगाया जा सकता है की आनुवंशिक हेरफेर के लिए उत्कृष्ट तरीके हैं । अभिकर्मक क्षमता कैल्शियम फॉस्फेट विधि का उपयोग कर 0.1-5% से भिन्न हो सकते हैं. इसलिए, हम पाते है कि जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए चिप सहित-Seq विश्लेषण, सह immunoprecipitation, और immunoblotting, lentiviruses का उपयोग अधिक उपयुक्त है क्योंकि यह ८०% से अधिक में परिणाम transduction जब चढ़ाना के समय transduced ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा की परिषद और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान के संस्थानों जे-ए द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १२९ सेरिबैलम अनुमस्तिष्क granules न्यूरॉन्स (CGN) एडीनोवायरस Lentiviral Transduction Excitotoxicity एन मिथाइल-डी-aspartate (एनएमडीए) Apoptosis पोटेशियम क्लोराइड (KCl) Camptothecin हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)
माउस प्राथमिक अनुमस्तिष्क granules न्यूरॉन्स में ंयूरॉन मौत और अध कि मॉडलिंग
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