Drosophila imaginal disk epitelyumunda mozaik klon analizi, tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir model sistemidir. Burada, GAL4-UAS sistemini kullanarak Drosophila kanat imaginal disklerinde tümörleri indüklemek için bir protokolü tarif eder ve tümör fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunmaktayız.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Kanserin erken evrelerinde, dönüştürülmüş mutant hücreler sitolojik anormallik gösterir, kontrolsüz aşırı büyümeye başlar ve doku organizasyonunu giderek bozmaktadır. Drosophila melanogaster , tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için kanser biyolojisinde popüler bir deneysel model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Drosophila imaginal diskler için genetik araçlar (larvalarda gelişen epitel), insan kanserinin başlangıç evrelerine benzer bir durum olan normal bir epitel dokusunda dönüştürülmüş pro-tümör hücrelerinin oluşturulmasını sağlar. Bununla birlikte, Drosophila kanat imaginal disklerinde yapılan tümörigenez üzerine yakın tarihli bir çalışmada, tümör başlangıcının doku intrensek sitolojik mimarisine ve yerel mikro çevreye bağlı olduğunu göstermiştir; bu, imaginal olarak tümör fenotiplerini değerlendirmede tümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik duyarlılığın göz önüne alınmasının önemli olduğunu düşündürmektedir diskler. Tümör gelişiminin fenotipik analizini kolaylaştırmakİmaj disklerinde, burada, kanat imgesel disklerinde neoplastik tümörleri indüklemek için GAL4-UAS sistemini kullanan genetik deneyler için bir protokolü açıklıyoruz. Daha önce tarif edilmemiş olan, tümör progresyonunun çeşitli aşamalarını (hiperplazi, displazi veya neoplazi gibi) ayırt etmek için net bir sınıflandırma yöntemi olduğu için, imaginal epitelde indüklenen klonal lezyonların fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi daha sunuyoruz. Bu yöntemler, Drosophila'daki çeşitli organlarda tümör fenotiplerinin klonal analizi için geniş çapta uygulanabilir.
Giriş
Epitel dokuları, gelişim ve hücre döngüsü yoluyla organizasyonlarını sürdürmek için olağanüstü homeostatik kabiliyet gösteren oldukça organize sistemlerdir. Bununla birlikte, bu sağlam kendi kendini düzenleyen sistem, tümör gelişiminde aşamalı olarak bozulmaktadır. Tümör gelişiminin başlangıcında, bir onkojen aktivasyonundan ya da tümör süpresör geni inaktivasyonundan kaynaklanan mütasyona uğramış hücreler epitel tabakasında ortaya çıkar. Bu "tümör öncesi hücre", baskılanmış bir ortamdan kaçınır, epitelin düzenlenmesini bozar ve kontrolsüz çoğalmaya başlar, tümörojenez oluşur 1 . Son birkaç on yıl içinde, genetik ve moleküler biyolojideki olağ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Fly Haçlar ve Klon İndüksiyonu
- Bakire flies toplamadan önce flakona 12 saat boyunca tüm sinekler çıkarın.
- Şişe içindeki sinekleri CO 2 gazı enjekte ederek anestezi altına alın ve CO 2 sineklik pedi üzerine sinek yerleştirin.
- 10 - 20 bakire dişiyi ve 10 erkek, CO 2 sineklik pedinden yeni bir tüp içine aktarın ve 1 gün süreyle 25 ° C'de inkübe edin.
- Bu sinekleri yeni bir flakona aktarın ve 12 saat 25 ° C'de inkübe edin.
NOT: Bakire dişiler ilk gün yeterli miktarda yumurta bırakmadığı için ilk flakonu atın. - Geliştirici-GAL4 hatları için, yetişkin sinekleri çıkarın ve di....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Drosophila kanat imaginal disklerinde RNAi aracılı nTSG-knockdown ile deneysel olarak indüklenen neoplastik tümör oluşumunu göstermek için lgl veya scrib için UAS-RNAi ifade etmek için üç farklı GAL4 sürücüsü kullanılmıştır: (1) sd-GAL4, güçlü UAS ekspresyonunu Kanat çantası ve menteşe bölgelerinde hafif ifade ( Şekil 2 ve Şekil 3A ); (2) dorsal medial katmanın iki alanındaki.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
GAL4-UAS sistemi, Drosophila 26'da hedef gen ekspresyonu için en güçlü genetik araçlardan biridir ve in vivo tümör hücresi indüksiyonu ve analizini büyük ölçüde kolaylaştırır 4 . Bu sistem, transforme edilmiş pro-tümör hücrelerinin normal epitel hücreleri tarafından çevrelendiği insan kanserinin başlangıç aşamalarına oldukça benzer bir durum olan, vahşi tipli epitel dokusunda tümör baskılayıcı genlerin dökülmesini veya kanserojenlerin aşırı ekspresy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Makalenin eleştirel okunması için J. Vaughen'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, JSPS KAKENHI Grant Numaraları 26891025, 15H01500 ve YT'ye Takeda Bilim Vakfı Araştırma Yardımı hibeleri tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifler< / güçlü > | |||
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehit | Wako | 064-00406 | |
| sığır serum albümini | Sigma | A7906 | |
| normal keçi serumu | Sigma | G6767 | |
| montaj ortamı, Vectashield | Vektör Laboratuvarları | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| fare-anti-Dlg 4F3 | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | 4F3 anti-diskler büyük, RRID: AB_528203 | PBTG'de seyreltik, 1:40 |
| fare-anti-MMP1 | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 karışık 1:1:1 ve PBTG'de seyreltik, 1:40 |
| fare-anti-MMP1 | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 karışık 1:1:1 ve PBTG'de seyreltik, 1:40 |
| fare-anti-MMP1 | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 karışık 1:1:1 ve PBTG'de seyreltik, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | AA4.3, RRID: | PBTG'de seyreltik AB_579793, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Moleküler problar | A22283 | PBS'de seyreltik, 1:40 |
| keçi anti-fare IgG antikoru, Alexa Fluor 546 | Moleküler problar | A11030 | PBTG'de seyreltik, 1: 400 |
| < güçlü > Adı < / strong> < | strong>Company < / strong > | < strong > Katalog Numarası< / güçlü> | Comments< |
| strong>Fly suşları | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | #8609 | UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | #26796 | UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Viyana Drosophila RNAi merkezi | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Viyana Drosophila RNAi merkezi | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (dışa çevrilebilir GAL4) | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | #4780 | UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | #5428 | X kromozomu |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | #6658 | üçüncü kromozom |
| UAS-Dicer2 | Bloomington ile yeniden birleştirildi Drosophila Stok Merkezi | #24650 | ikinci kromozom |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | #24651 | üçüncü kromozom |
| vkg-GFP | Morin ve ark. 2001 | GFP protein tuzağı |
Kaynaklar
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
