Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.
Abstract
Die Existenz von endothelialen Progenitorzellen (EPC) im peripheren Blut und seine Einbindung in Vaskulogenese wurde zuerst von Ashara und Kollegen1berichtet. Später, dokumentiert andere die Existenz von ähnlichen Arten von EPC aus dem Knochenmark2,3. Vor kurzem hatte Yoder und Ingram zeigte, dass Nabelschnurblut EPCs abgeleitet ein höheres proliferative Potential im Vergleich zu denen von Erwachsenen peripheren isoliert Blut-4,5,6. Neben der postnatalen Vaskulogenese beteiligt zu sein, haben EPC auch Versprechen als eine Zelle Quelle für die Erstellung von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil Konstrukte7,8gezeigt. Verschiedenen Isolierung Protokolle sind vorhanden, von denen einige beinhalten Zellsortierung mononukleären Zellen (MNU) abgeleitet aus den Quellen erwähnt mit Hilfe von Endothelzellen und hämatopoetischen Marker oder Kultivierung dieser multinationalen Unternehmen mit spezialisierten endothelial Wachstum Medium, oder eine Kombination dieser Techniken-9. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultur des EPC mit spezialisierten Endothelzellen Medium ergänzt mit Wachstumsfaktoren, ohne den Einsatz von Immunosorting, gefolgt von der Charakterisierung von der isolierten Zellen mittels Western blotting und Immunostaining.
Introduction
Mehrere Forscher untersuchten die Eigenschaften und das Potential der menschlichen EPCs5,10,11,12,13. EPC können beschrieben werden als Zellen, die Fähigkeit zur Einhaltung endothelial Gewebe an Standorten von Hypoxie, Ischämie, Verletzungen oder Tumorbildung und tragen zur Bildung von neuen vaskulären Strukturen4,14in Umlauf. Ihre beobachteten Beteiligung an Neovaskularisation, in Form von postnatale Vaskulogenese, führte zu einem Verständnis der Pathophysiologie der diese Zellen und deren Anwendung in therapeutischen Anwendungen4,15, 16. die Anzahl der EPC im Einzelfall nachweislich korreliert mit Herz-Kreislauf-Pathologie9,15,16,17,18,19 ,20. Andere Studien haben auch differenzierte EPC in einem Ventil Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp und schlug vor, dass diese Zellen für Gewebe-Engineering Herz Ventile7,21verwendet werden könnten.
Bestimmte Zelle Oberfläche Moleküle EPCs isolieren musste wurden aufgrund von Unstimmigkeiten zwischen den Untersuchungen4nicht eindeutig identifiziert. Die Haftung der multinationalen Konzerne zu einer bestimmten Matrix, mit der Exposition gegenüber einer Vielzahl von Kulturbedingungen durchgeführt worden durch mehrere Gruppen1,17,22,23, was darauf hindeutet, dass vermeintliche EPCs kann unterschiedlichen phänotypische Eigenschaften anzeigen. Zu diesen Eigenschaften gehören einen Mangel an phagocytotic Fähigkeit, Rohr-Bildung in Matrigel und die Aufnahme von Low-Density-Lipoproteine Dil acetyliert. Die hohe klonogenen und proliferative Potential sind zwei Eigenschaften, die mit dem EPC hierarchisierte5werden können. EPC können auch in-vitro- Tubuli wenn mit menschlichen fetalen Lunge Fibroblasten4cocultured bilden. Diese Zellen sind Endothelzellen Oberflächenmarker zum Ausdruck zu bringen und einige der hämatopoetischen Marker13,24,25Teilen bekannt. Die positiv ausgedrückt Marker, die weithin für Phänotypisierung EPCs akzeptiert werden sind CD31, CD34, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (VEGFR2), von-Willebrand-Faktor (vWF), CD133, c-Kit und vaskulären endothelialen Cadherin (VE-Cadherin)4 , 18. Zellen, die CD90, CD45, CD14, CD115 oder Alpha-Glattmuskel Aktin (α-SMA) Co ausdrücken gelten nicht als EPC wegen ihrer begrenzten proliferative potenzielle, Fähigkeit, Phagozytose von Bakterien und die Unfähigkeit, de Novo menschlichen bilden Schiffe in Vivo4,7. Dieser Artikel beschreibt ein modifiziertes Protokoll für die Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut ohne die Notwendigkeit für jede Zelle sortieren Protokolle. In diesem Artikel verwendet CD31, CD34 und VEGFR2 als die positive Markierungen mit α-SMA als negativer Indikator.
In diesem Artikel schlagen wir vor, dass eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von endothelialen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut ohne Zelle sortieren mit endothelialen Wachstumsmedium ergänzt mit Wachstumsfaktoren (EGM) spezialisiert. Diese EGM vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und enthält Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), die das Überleben, Proliferation und Migration von Endothelzellen26zu verbessern. Es enthält auch Ascorbinsäure, die für die Aufrechterhaltung der Kopfsteinpflaster-Morphologie der Zellen verantwortlich ist; Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-1 (IGF-1), die Angiogenese und wandernden Funktion bietet; und Heparin, wodurch verbesserte Langzeitstabilität von Wachstumsfaktoren in der mittleren26. Andere Wachstumsfaktoren hinzugefügt, um die endotheliale Zellkulturmedium umfasst die Supplementation mit epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), die hilft, anregende Zell-Proliferation und Differenzierung und Hydrocortison, die die Zellen EGF26 sensibilisiert . Wir zeigen, dass die Nutzung dieses Mediums spezifischen Wachstumsraten höhere Anzahl von EPC im Vergleich zu Endothelzellen basal Medium (EBM) oder Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM ergibt).
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Protocol
dieser Forschung wurde mit Zustimmung der University of Arkansas Institutional Review Board (Zulassungsnummer 16-04-722) durchgeführt. Nabelschnur Blut Einheiten wurden in Citrat Phosphat Traubenzucker (CPD) Lösung in Arkansas Nabelschnurblutbank und Einheiten, die nicht die Voraussetzung für die Lagerung für die Forschung gespendet wurden. Cord Blood Einheiten waren couriered im Labor innerhalb von 24 h Kollektion bei Umgebungstemperaturen.
1. Isolation der endothelialen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut
- Vorbereitung der Reagenzien.
- Ergänzt bereiten EGM durch Zugabe von endothelialen basal Medium (EBM), 10 % fetalen bovine Serum (FBS) mit 20 ng/mL des Insulin-Like Growth Factor (IGF), 1 µg/mL Ascorbinsäure, 5 ng/mL rekombinanten menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (RhEGF), 22,5 µg/mL Heparin, und 0,5 ng/mL vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), zusammen mit 10 ng/mL von rekombinanten menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor B (RhFGF-B), 0,2 µg/mL Hydrocortison und 2 % Penicillin-Streptomycin-Glutamin. Sterilisieren Sie das Kulturmedium mit einem 0,2 µm Polyethersulfone (PES) Membrane Vakuumfilter.
- Vorbereiten Ratte tail ich Kollagen-Lösung mit einer Konzentration von 50 µg/mL mit 0,02 N Essigsäure. Diese Lösung mit einem 0,2 µm Spritze Filter sterilisieren.
- Pre-Mantel-6-Well-Platten mit 2 mL der vorbereiteten Ratte tail ich Kollagen-Lösung für jedes gut. Legen Sie sie in einem Inkubator auf 5 % CO 2 und 37 ° C für mindestens 1 h vor der Aussaat gehalten.
- Verdünnen etwa 25 mL Nabelschnurblut mit Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS) in einer Konzentration von 1:1.
- Vorbereiten-Radio-Immuno-Niederschlag assay (RIPA) Puffer mit 150 mM Natrium-Chlorid, 1 % Triton x-100, 0,5 % Natrium Deoxycholate, 1 mM β-Glycerophosphat, 0,1 % SDS und 50 mM Tris (pH 8,0).
- Isolation von endothelialen Progenitorzellen.
- Warm All vorbereitet Reagenzien in einem Wasserbad auf 37 ° C vor der Isolierung gehalten.
- 20 mL Dichte Gradienten mittlere Reagenz hinzufügen eine 50 mL Zentrifugenröhrchen.
- Sorgfältig Schicht 20 mL verdünnten Nabelschnurblut in der Dichte-Gradienten-Medium ohne diese Schicht mit dem Ziel, der Pipette auf den Seitenwänden des Rohres mit Zentrifugenröhrchen.
- Einzelteilen anhand ihrer Dichte ( Abbildung 1) Blut durch Zentrifugieren bei 800 X g für 30 min bei Raumtemperatur mit den Bremsen des Rotors Zentrifuge ab. Die verschiedenen Schichten nicht stören.
- Entfernen der Plasmaschicht durch pipettieren sie sorgfältig aus der Tube ohne zu stören andere Zelle, die Schichten bis die Pipettenspitze erreichen das MNC ist überlagern (siehe Abbildung 1). Entsorgen Sie das entfernte Plasma.
Hinweis: Bei der Verwendung von Pipettenspitzen, um das Plasma zu entfernen, lassen Sie eine kleine Schicht von Plasma über den MNC-Schicht ( Abbildung 1), um Störungen zu reduzieren. - Sammeln die buffy Mantel, den die multinationalen Konzerne mit einer Spritze ausgestattet, ein 18-Gauge-Nadel enthält und überträgt es auf eine frische Zentrifugenröhrchen.
- Hinzufügen einem gleichen Volumen der EBM die gesammelten MNCs. Zentrifuge diese Rohre bei 500 X g für 10 min bei 4 ° C. verwerfen des Überstands.
Hinweis: Die Zelle-Pellet erscheinen rot wegen der Anwesenheit von roten Blutkörperchen/Erythrozyten. - 5 mL Ammoniumchlorid-Lösung für die Erythrozyten lysiert hinzugeben. Dieses Rohr für ca. 5-10 min, mit gelegentlichen schütteln auf Eis brüten.
Hinweis: Vorsicht getroffen werden während dieses Schrittes nicht überschreiten die Zeitdauer, wie es für die multinationalen Konzerne schädlich sein kann. - Schläuche am 500 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entsorgen. Wenn Erythrozyten bestehen bleiben, wiederholen Sie die Schritte 1.2.8 und 1.2.9, bis keine rote Farbe in das Pellet beobachtet wird.
- Das Pellet in vorbereiteten EGM Aufschwemmen und verwenden die Hemocytometer, die multinationalen Konzerne zählen.
- Aspirat Ratte tail ich Kollagen beschichtet 6-Well-Platte (aus Schritt 1.1.3) und waschen Sie die Brunnen dreimal mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Samen das MNC-Pellet Nukleinsäuretablette in EGM auf die Kollagen-Platte in einer Konzentration von 1 x 10 7 MNCs in jede Vertiefung. Legen Sie sie in das 37 ° C, 5 % CO 2-Inkubator.
- Nach 24 h, aspirieren Sie das Medium und die Brunnen einmal mit EGM zu waschen. Jede Vertiefung 3 mL EGM Medium hinzu und legen Sie sie zurück in das 37 ° C, 5 % CO 2-Inkubator.
- Ergänzen die Platte mit frischen EGM Medium täglich für 7 Tage. Nach 7 Tagen das EGM-Medium verändern jeden zweiten Tag.
- Mit einem Hellfeld Mikroskop Bilder von der 6-Well-Platte nehmen jeden Tag, um das Fortschreiten der Endothelzellen Kolonien zu verfolgen. Markieren Sie die Platte, wo die Kolonien entstehen, deren Wachstum nachzuverfolgen.
Hinweis: Es dauert in der Regel zwischen 5 und 9 Tage für die Kolonien in der Kultur angezeigt werden.
- Ausbau der endothelialen Vorläuferzellen.
- Mantel der t-25-Kultur-Küvette mit Ratte tail ich Kollagen (50 µg/mL) und legen Sie sie in das 37 ° C, 5 % CO 2 Inkubator für mindestens 60 min. Absaugen und waschen die t-25 Zelle Kultur Küvette dreimal mit 1 X PBS vor der Aussaat Zellen.
- Trypsinize die Endothelzellen Kolonien, wenn sie etwa 3 mm groß mit 150 µL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung in jede Vertiefung zu erreichen. Setzen Sie die 6-Well-Platte wieder in 37 ° C, 5 % CO 2 Inkubator für 2-3 min.
- Klopfen die 6-Well-Platte um die angeschlossenen Zellen verdrängen. Sofort 2 mL der EGM und Wiederherstellen der Zellen in einem Zentrifugenröhrchen 15 mL.
- Der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer zählen und rechnen die ursprünglichen Aussaatdichte.
- Spin der Zentrifuge 15 mL Röhrchen bei 400 X g für 5 min. Aufschwemmen der Zelle Pellet in EGM und Samen den t-25 Kolben mit ~ 500.000 Zellen. Markieren Sie dieses Fläschchen als Durchgang 1 und t-25 Kolben wieder in 37 ° C, 5 % CO 2-Inkubator.
Hinweis: Zellen können in EBM und DMEM, das Wachstum mit EGM vergleichen vernickelt werden. - Für weitere Passagen, wenn der Kolben Zusammenfluss von 90 % erreicht, führen Sie Schritte 1.3.1 - 1.3.5 und reseed Zellen 10 4 Zellen/cm 2 T-75 oder T-175 Zellkulturflaschen. Fahren Sie mit der Charakterisierung der isolierten Zellen (Schritte 2 und 3).
2. Charakterisierung der isolierten Zellen mittels Western Blotting
- Lyse hinzufügen 50-100 µL Puffer bei jedem Durchgang Handlungsschritte auf Ausbau der isolierten Zellen zu charakterisieren. Proteine von etwa 500.000 oder mehr Zellen sammeln.
- Pipette oben und unten kräftig zu platzen die Zellen und Proteine. Sammeln und übertragen den Puffer zu einem Microcentrifuge Schlauch.
- Spin Microcentrifuge Schlauch bei 500 X g und den Überstand sorgfältig auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen. Benennen und Speichern der Rohre bei-80 ° C für die Langzeitspeicherung.
- Quantifizieren die Menge der Proteine in jedem Röhrchen verwenden entweder Bradford ' s oder BCA assay 27 , 28 , 29.
- Führen durch Western Blot mit Standardverfahren 27 , 28 , 29. 5 µg Gesamt-Protein für den Ausdruck von CD31, CD34, VEGFR2 und α-SMA zu analysieren. Α-Tubulin für die Normalisierung der Daten verwenden.
3. Indirekte Immunfluoreszenz
- 18 mm Glasdeckgläser in 50 % igem Ethanol beschallen und trocknen Sie sie. Verlassen sauberen Deckgläsern in ein 12-Well-Platte über Nacht in der Biosicherheits-Haube mit einem UV-Licht auf um sie zu sterilisieren.
- Mantel Deckgläsern mit 50 & #181; g/mL Ratte tail ich Kollagen und übertragen Sie die Platte auf einem 37 ° C, 5 % CO 2 Inkubator für mindestens 60 min.
- Aspirieren das Kollagen und die 12-Well-Platte, die Deckgläsern waschen 1 mL 1 X PBS hinzufügen. 1 X PBS Aspirieren und zweimal wiederholen.
- Samen 250.000 kultiviert EPC in jedem gut und sie zurück in das 37 ° C, 5 % CO 2 Inkubator für mindestens 3 Tage vor Durchführung Immunostaining.
- Waschen die Platte 3 Mal mit 1 X PBS. Fügen Sie 1 mL eiskaltes Methanol in jede Vertiefung und Inkubation bei Raumtemperatur 15 Minuten, die Zellen zu beheben.
- Führen Immunostaining mit einem Standardprotokoll 27 , 28 , 29. Die Antikörper bei ihren entsprechenden Verdünnungen verwenden (z. B. CD31 (01:20), CD34 (01:50), α-SMA (1: 100) und VEGFR2 (01:50)).
- Bilder von den Immunostained Deckgläsern mit einem Epifluoreszenz Mikroskop nehmen.
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Representative Results
Isolation und Ausbau der endothelialen Vorläuferzellen:
Ein Schaltplan (Abbildung 1) steht zur Verfügung, zeigt das gesamte Protokoll. Die verschiedenen Blut Komponentenschichten wurden nach Dichte Gradienten Zentrifugieren der menschlichen Nabelschnurblut mit Dichte Gradienten Medium beobachtet. Bei der Aussaat MNCs auf die Kollagen-behandelten Platten, wurde erstmals Auswuchs von Kolonien zwischen 5 Tagen und 7 (Abb. 2A) beobachtet. Diese Kolonien weiter gewachsen und hatte eine spindelförmige Zelle Morphologie (Abbildung 2A-2D) in den frühen Stadien, die später zu einem Pflasterstein-ähnliche Morphologie (Abbildung 2E-2F) fortgeschritten. Abbildung 3 A zeigt die Gesamtzahl der Zellen im Vergleich zur Zeit in Kultur, und jeder Datenpunkt stellt die Gesamtzahl der Zellen bei jedem Durchgang. Abbildung 3 B zeigt die durchschnittliche Bearbeitungszeit für die erste Kolonie in der Kollagen-behandelten 6-Well-Platte entstehen nach der Aussaat die multinationalen Konzerne.
Charakterisierung mittels Western Blotting:
Abbildung 4 A zeigt die Vertreter Ergebnisse der Western blot Membran, die gegen die verschiedenen Antikörper getestet wurde. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Zellen für CD31 und CD34 positiv waren. Der Ausdruck der CD31 (Abbildung 4B) und CD34 (Abb. 4C) erschien in nachfolgenden Passagen sinken, während VEGFR2 (Abbildung 4D) drückte sich auch in späteren Passagen mit dem ersten Durchgang mit höheren Ausdruck. Wir beobachten auch, dass der EPC die mesenchymalen Zellen Marker α-SMA (Abbildung 4E) nicht geäußert hat. Menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (HUVECS) und Herzklappenfehler interstitiellen Zellen (VIC) Zelle Lysates dienten als positive und negative Kontrollen, beziehungsweise. Mediumwechsel bekanntermaßen CD31, CD34 und VEGFR2, ausdrücken, während VICs α-SMA ausdrücken.
Abbildung 1 : Schaltplan der EPC Isolation. Start die Isolation durch Verdünnung Schnur Blut mit HBSS und schichtet es sorgfältig auf das Dichte Gradienten Medium, wie gezeigt. Dichte Gradienten Zentrifugation von geschichteten Blut erfolgt, um unterschiedliche Schichten des Blutes, der MNU (buffy Coat), Dichte-Gradienten-Medium, Granulozyten und Erythrozyten besteht zu erwirken. Das Teilmenge Bild zeigt diese verschiedenen Schichten. Multinationale Unternehmen gesammelt und auf einer Kollagen-behandelte Kultur Zellplatte nachgesät. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Fortschreiten der Zelle Kolonie. (A-E) Repräsentative Hellfeld Bilder der EPC Kolonie Progression im Laufe der Zeit. Beachten Sie, dass die Kolonie spindelförmige Zellen in einem frühen Stadium, anzunehmen die Kopfsteinpflaster-Morphologie. (E) repräsentatives Bild des EPÜ in einem T-75-Kolben in der Passage 3 kultiviert. Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Wachstumskurven des EPCs. (A) die Grafik zeigt die Anzahl der Zellen, die über einen bestimmten Zeitraum hinweg wächst, und jeder Datenpunkt bezeichnet die Zelle Nummer bei jedem Durchgang (P0 - P10) geerntet (n = 4). (B) Zeit für die erste EPC-Kolonie in der 6-Well-Platte angezeigt werden (n = 4). Die Fehlerbalken kennzeichnen den Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Keine statistische Signifikanz wurde gefunden mit One-Way ANOVA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Western Blotting. (A) Western-Blot-Membran mit verschiedenen Antikörpern gefärbt. HUVECS lysate und VIC lysate wurden als Positivkontrollen verwendet. (B) durchschnittliche Intensität der CD31 Bands mit α-Tubulin normalisiert. (C) mittlere Intensità ¤ t der CD34-Bands mit α-Tubulin normalisiert. (D) mittlere Intensità ¤ t der VEGFR2 Bands mit α-Tubulin normalisiert. (E) durchschnittliche Intensität der α-SMA Bands mit α-Tubulin normalisiert (n = 3-6). Die Fehlerbalken kennzeichnen SEM Keine statistische Signifikanz wurde gefunden mit One-Way ANOVA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Immunostaining. Repräsentative Bilder von EPC in EGM für 7 Tage und Immunostained an verschiedenen Stellen für CD31, CD34, VEGFR2 und α-SMA kultiviert. Skala bar - 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung 1: Das Diagramm zeigt die Anzahl der Zellen pro Flächeneinheit über einen Zeitraum von 7 Tagen bei EGM, EBM und DMEM kultiviert. EGM zeigte höhere Zellwachstum im Vergleich mit den Medien (EBM und DMEM). Die Daten zeigten statistische Signifikanz, mit p < 0,01, mit One-Way ANOVA (n = 2). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
/ > Ergänzende Abbildung2: repräsentative Bilder von EPC in EBM für 7 Tage und Immunostained für CD31, CD34, VEGFR2 und α-SMA kultiviert. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung 3: Repräsentative Bilder von EPC in DMEM für 7 Tage und Immunostained für CD31, CD34, VEGFR2 und α-SMA kultiviert. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wie bereits erwähnt, anhaftende EPCs besitzen eine Kopfsteinpflaster-Morphologie. Unsere isolierten MNCs entwickelte sich von einer spindelförmigen Zelle Kolonie (Abbildung 2A-2D) in den frühen Stadien zu einer gepflasterten Kolonie (Abbildung 2E-2F) über einen Zeitraum von zehn Tagen in Kultur. EPC haben unterschiedlich von verschiedenen Forschungsgruppen, nämlich als späten endothelial Progenitor Zellen10, endotheliale koloniebildenden Zellen5oder endothelial Progenitor Zellen12bezeichnet worden. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Zellen funktionell identisch sind und ähnliche Zelle Oberflächenmarker ausdrücken. Die Anzahl der Zellen während der Kulturdauer (Abbildung 3) stieg auf fast 108 Zellen, analog zum vorherigen Veröffentlichungen und typisch für das hohe proliferative Potential von EPC3,5beobachtet. In der Tat ergab, dass menschliche Nabelschnurblut zeigten eine hohe proliferative potenzielle und zeigte mehrere Bevölkerung Verdoppelungen vor einer im Vergleich zu EPC isoliert von Erwachsenen menschlichen peripheren Blut5 Seneszenz EPCs entnommen , 10.
Unsere westlichen befleckenden Ergebnisse (Abb. 4A) zeigte die Anwesenheit von CD31, CD34 und VEGFR2 auf die Zelle Lysates EPC im Vergleich zu der Positivkontrolle, HUVECS entnommen. Mediumwechsel CD31, CD34 und VEGFR2 ausdrücken und VIC ausdrückliche α-sSMA aktiviert. Ähnlich wie bei früheren Berichten10,18, die Expression von CD31 mit höheren Passagen verringert. Das Muster des Ausdrucks ähnelte auch im Falle von CD34 und VEGFR2, wo die beiden Markierungen stark in der ersten Passage und in relativ geringer aber gleiche Mengen in späteren Passagen zum Ausdruck gebracht wurden. Diese Daten zeigen eine Tendenz, die in Übereinstimmung mit früheren Gruppen Ergebnisse zu erzielen, ist in dem Immunosorting-basierte Protokolle verwendet werden, für die Isolierung der Kabel Blut abgeleitet EPCs12. In der Regel EPC nicht ausdrücklich mesenchymalen Marker und um sicherzustellen, dass die isolierten Zellen nicht in der Natur, mesenchymale waren wir Immunolabeled unsere Western-Blot-Membranen mit α-SMA. Unsere Ergebnisse zeigen deutlich, dass es kein α-SMA-Ausdruck in der kultivierten EPCs war verglichen mit Positivkontrolle Zelle Lysates gesammelt von VICs, die starken Ausdruck der α-SMA Antikörper aufweisen.
Um zu demonstrieren, dass EGM erhöhten Zellproliferation im Vergleich zu anderen Nährmedien verwendet für EPC ermöglicht, wir kultivierten Zellen in drei verschiedene Arten von Medien: DMEM, EBM und EGM (d. h. EBM ergänzt mit Wachstumsfaktoren, wie zuvor beschrieben). Alle wurden ergänzt mit 10 % FBS. Wir ausgesät Zellen der verschiedenen Passagen in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte. Zusätzliche Abbildung1 zeigt die Anzahl der Zellen pro Flächeneinheit in jede Vertiefung im Laufe der Zeit in der Kultur in den verschiedenen Medien-Formulierungen. Wir stellen fest, dass die EPC im EGM einer stetigen Zunahme in Zellennummer und für Zellen in EBM, zeigten gab es ein langsamer Anstieg der Anzahl von Zellen in den ersten drei Tagen, die anschließend Plateau. Dies deutet darauf hin, dass die EPC könnte noch im EBM überleben, aber das Fehlen von Wachstumsfaktoren Verbreitung behindert. Wir beachten auch, dass EPC in DMEM Abnahme an der Zahl, was darauf hindeutet, dass diese mittlere Formulierung nicht geeignet für ihr Überleben oder Verbreitung ist kultiviert. Unsere Immunostaining Daten zeigen, dass die EPC im EGM (Abbildung 5) CD31 mehr im Vergleich zu EPC kultiviert im EBM (ergänzende Abbildung2) und DMEM (ergänzende Abbildung 3) ausgedrückt. Vergleich von Abbildung 5 mit ergänzenden Abbildung2 und ergänzende Abbildung 3ersichtlich, dass die Zellen nicht mit anderen Zelltypen kontaminiert wurden. Auch kann beim Vergleich der Immunostained EPC (Abbildung 5) wir qualitativ feststellen, dass verringerte sich der Ausdruck CD31 und CD34 höheren Passagen unterstützen unsere Western-Blot-Daten (Abbildung 4).
Um es zu wiederholen, ist das primäre Ziel unseres vorgeschlagenen Protokolls zu zeigen, dass man endotheliale Vorläuferzellen durch Kultivierung Blut MNCs in spezialisierten Selektivmedien isolieren kann. Dies soll zeigen, dass EPCs ohne hochentwickelte Geräte und Verfahren, im Gegensatz zu anderen Methoden, bei denen die Verwendung der Durchflusszytometrie - entweder sofort nach MNC Isolierung1,3,20 isoliert werden können , 30 oder nach die Kolonien in einem Monolayer - gewachsen sind, gefolgt von replating4,10,12,13,23. Die EPC-Kolonien erscheinen in der Regel zwischen 5 und 9 Tage. Unsere Methode ist somit eine schnellere und kostengünstigere Methode zur Isolierung von EPC. Die größte Einschränkung dieser Technik ist, dass der Ausdruck CD31 und CD34 mit nachfolgenden Passagen,, was darauf hindeuten könnte sinkt, dass die Zellen ihre Vorläuferzellen Phänotyp verlieren. Daher empfiehlt es sich, dass man Zellen aus Durchgang 5 oder niedriger verwenden sollte, Experimente durchzuführen, wenn dieses Protokoll verwenden.
Vorsichtsmaßnahmen sollten nach der Zentrifugation Dichte unternommen werden, um die verschiedenen Schichten nicht zu stören, wenn die zentrifugiert Rohre in die Haube zurücknehmen und auch wenn das Plasma zu entfernen. Ein weiterer entscheidender Schritt bezieht sich auf Erythrozyten lyse, wo eine längere Inkubationszeit der MNC möglicherweise beschädigen könnte. Daher wird empfohlen nicht, diesen Schritt wiederholen, mehr als das doppelte. In der Tat, da das mittlere Streben nach Beschichtung 24 h durchgeführt wird, sind Spuren von Erythrozyten entfernt, da sie nicht-Anhänger sind. Alternative Substrate wie Fibronektin oder Gelatine, können zwar nicht von uns getestet auch nach bestimmten Protokollen verwendet werden für die Erstellung von Zelle Kultur Beschichtungen. Durch den Einsatz von geringfügigen Änderungen bei den ersten Schritten, können Forscher-anhaftende EPC30isolieren.
Zusammenfassend haben wir eine Methode zur Isolierung EPCs aus Nabelschnurblut berichtet. Es ist wichtig zu beachten, dass die EPC nicht Marker wie α-SMA ausdrücken, was darauf hindeutet, dass sie nicht mesenchymalen-ähnlichen Zellen sind. In der Tat, α-SMA dient als ein wichtiger Marker, wenn Sie versuchen, den endothelialen mesenchymalen Übergang (Endo-MT) der EPC zu studieren. Endo-MT ist ein zellulärer Transdifferenzierung Prozess während, den Endothelzellen, verlieren ihre spezifische Marker und um einen Phänotyp mesenchymalen-ähnlichen Zellen verwandeln bekannt sind. Es hat sich gezeigt, dass EPCs können dieser Übergang im Beisein von Wachstumsfaktor-β7 Umwandlung unterziehen und extrazelluläre Membranproteine auf ihre Tissue-Engineering Gerüste8 freigeben kann. Alle diese Beobachtungen weisen darauf hin das Versprechen der EPC für den Einsatz als autologe Zellen Quelle, eine Herzklappe oder anderen Herz-Kreislauf-Tissue-Engineering Konstrukten zu erstellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Dieses Material basiert auf Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation Grant No. CMMI-1452943 und von der University of Arkansas Ehrenhochschule. Wir möchten auch die Arkansas Nabelschnurblutbank für die uns mit Schnur Blut Einheiten zu erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
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