流感血凝素特异抗体诱导的 Fc 介导效应函数的一种评估方法

Summary

我们描述了一种方法来衡量 Fc 介导的效应函数的活化作用的抗体, 针对流感病毒血凝素。这种检测也可以适应评估单克隆抗体或多克隆血清靶向其他病毒表面糖蛋白, 以诱导 Fc 介导的免疫能力。

Abstract

抗体通过其抗原结合域和 Fc 区域, 在耦合病毒病原体的先天和适应性免疫应答中起着至关重要的作用。在这里, 我们描述如何测量 Fc 效应函数的活化作用的单克隆抗体靶向流感病毒血凝素与使用基因工程的 Jurkat 细胞系表达活化型 1 Fc FcγR. 使用此方法,免疫球蛋白所赋予的特定 Fc-FcγR 相互作用的贡献可以通过体外测定来确定。

Introduction

季节性流感疫苗提供的免疫传统上是通过血凝抑制 (HI) 检测方法¹来评估的, 它测量了针对血凝素受体结合部位的抗体的存在。这些高活性抗体可以赋予杀菌免疫, 但在其保护范围内一般是狭窄的, 只对少数几株流感病毒提供免疫力。广泛反应性单克隆抗体的分离和鉴定血凝素 (HA) 表明, 普遍流感疫苗的发展范围内可^达2, 3, 4,^5,6,7,8. 普遍流感疫苗的主要目标之一是对流感病毒的保守区域⁽⁹、¹⁰、^{11、12 )}产生强烈的抗体应答。^,13,14

Protocol

本手稿中所做的实验是按照伊坎医学院的《道德和法规规范》进行的。

1. 通过转染或感染来表达流感病毒血凝素

染:

1. 平板人胚胎肾脏 (HEK 293T) 细胞密度为 2 x 10⁴细胞/在白色组织培养中处理96井板, 让它在4个°C 孵化器 (与 37 CO_5%) 坐在 2 h。
2. 染细胞与 100 ng DNA 编码的病毒血凝素和 0.2 ul 的转染试剂每井在 50 ul 的总容量。
   注: 质粒和 transfectant 试剂均在1x 最小必需培养基中稀释, 降低血清培养基。
3. 在37个°C 孵化器中孵化出 5% CO₂为18小时的模板后, 删除转染介质。

2. 感染

1. 板 A549 或 Madin 达犬肾细胞密度为 2 x 10⁴细胞/以及在白色组织培养处理96井板和增长至少 18 h 在37个°C 孵化器与 5% CO₂。
2. 在37个°C 孵化器与 5% CO₂

Results

我们证明, 一个茎特定的单克隆, 6F12, 但不是头部特异的单克隆, PY102, 能够激活主要的自然杀伤细胞植入 CD107a 和干扰素γ¹⁹。为了模拟茎特异性抗体激活原发性 NK 细胞的能力, 我们表明, 一个茎特异性的单克隆抗体, 6F12, 可以有力地激活修饰的 Jurkat 细胞, 表达小鼠 FcγRIV 14 倍。另一方面, 头部特定的单克隆抗体, PY102 和对照 IgG 不 (图 2)²⁸。

为了调查感染的多样性 (Jurkat) 是否会影响表达小鼠 FcγRIV 的细胞的诱导, 我们感染 MDCK 细胞 X31 (重组流感病毒表达血凝素和神经氨酸酶/红 Kong/1/68 (H3N2)病毒与 A/波多黎各 Rico/8/34 (甲型h1n1 流感) 的内部段), 其教学语言为3、1或0.33。二十四小时后, Jurkat 细胞表达小鼠 FcγRIV 和单克隆9H10 被添加到受感染的 MDCK 细胞。在

Discussion

此处描述的方法允许用户测量 HA 特定单克隆抗体与小鼠 FcγRIV 的接触能力。靶抗原、流感病毒血凝素, 在病毒感染或质粒 DNA 转染后在细胞表面表达。这项试验还可以与其他 FcγRs (人类或小鼠) 结合使用不同的表面表达的病毒蛋白。此外, 我们使用血清样本来评估抗体的能力, 在多克隆的情况下, 以诱发 Fc 效应函数 (数据未显示), 这可能提供更多的相关信息, 当研究感染诱发的适应性免疫反应或接种.我们还推测, 该检测可以被修改, 以测量抗体的诱导识别内部病毒蛋白直接涂膜的可溶性蛋白。然而, 这种方法还没有经过严格的测试。

抗体依赖效应函数的诱导可能受多种因素的影响, 包括但不限于效应器目标比 (每井增加的效应细胞数), 使用的抗体浓度, 潜伏期之间的孵化时间效应因子和靶细胞, 以及在检测缓冲区中使用的低 IgG 血清浓度。

从历史上看, 检测抗体依赖性细胞细胞毒性活性的标准检测方法包括来自捐赠者的主要自然杀伤细胞。FcγR 的参与和细胞内通路的活化通常由激活标记 CD107a 和/或干扰素γ

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 细胞	ATCC	CCL-185	腺癌组人肺泡基底上皮细胞
HEK 293T 细胞	ATCC	CRL-3216	人胚胎肾细胞
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019	转染试剂
1X Opti-MEM 减血清培养基	ThermoFisher Scientific	51985-034
经白色组织培养处理的 96 孔板	Corning， Inc.	3917	检测板
10X MEM	Gibco	11430-030
表达小鼠 Jurkat 细胞 FcgRIV	Promega	M1201	试剂盒包括细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 和低 IgG 血清
人 FcgRIIIa 的 Jurkat 细胞	Promega	G7010	试剂盒包括细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 和低 IgG 血清
表达人 FcgRIIa	Promega	G9901	包括细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 和低 IgG 血清
光度计	BioTek	Synergy H1 多功能酶标仪	发光酶标仪
Bio-Glo 荧光素酶检测仪	Promega	G7940	包含荧光素酶测定缓冲液和荧光素酶测定底
Madin Darby 犬肾细胞	ATCC	CCL-34	犬肾细胞