Summary
Eine magnetische Pinzette Einzelmolekül-Plattform, G-Quadruplexe zu manipulieren wird berichtet was ermöglicht das Studium der G4 Stabilität und Verordnung durch verschiedene Proteine.
Abstract
Nicht-kanonische Nukleinsäure-Sekundärstruktur, die G-Quadruplexe (G4) in verschiedenen zellulären Prozessen, wie DNA-Replikation, Transkription, RNS-Verarbeitung und Telomere Dehnung beteiligt sind. Während dieser Prozesse verschiedener Proteine binden und lösen G4 Strukturen, ihre Funktion auszuführen. Da die Funktion des G4 oft auf die Stabilität der gefaltete Struktur abhängt, ist es wichtig zu untersuchen, wie G4-bindende Proteine regulieren die Stabilität des G4. Dieses Werk stellt eine Methode zum manipulieren G4 Einzelmoleküle magnetischen Pinzette, die Studien über die Regulierung der G4-bindende Proteine auf ein einzelnes Molekül der G4 in Echtzeit ermöglicht. Im Allgemeinen ist diese Methode geeignet für ein breites Spektrum von Anwendungen in Studien für Proteine/Liganden Interaktionen und Vorschriften auf verschiedenen DNA- oder RNA-Sekundärstrukturen.
Introduction
Vier-Stranded DNA oder RNA G4 Strukturen spielen wichtige Rollen in viele wichtige biologische Prozesse1. Viele Proteine beteiligt sind G4 Bindung und Verordnung, einschließlich der Telomer-bindende Proteine (Telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, Transkriptionsfaktoren (Nucleolin, PARP1)3, RNA, Proteine (HnRNP A1, Verarbeitung HnRNP A2)4, Helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5und DNA-Replikation im Zusammenhang mit Proteinen (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Proteinbindung kann stabilisieren oder destabilisieren G4 Strukturen; so regelt die nachfolgende biologische Funktionen. Die Stabilität des G4 wurde durch thermische schmelzen mit Ultraviolett (UV) oder kreisförmigen Dichroismus (CD) Methoden7gemessen. Solche Bedingungen sind jedoch nicht physiologischen relevant und sind schwierig, die Auswirkungen der verbindlichen Proteine7anzuwenden.
Die rasante Entwicklung im Einzelmolekül-Manipulation Technologien hat Studien von Falten und entfalten von ein Biomolekül, wie eine DNA oder ein Protein Einzelmolekül-Ebene mit Nanometer-Auflösung in Echtzeit8aktiviert. Rasterkraftmikroskopie (AFM), optische Pinzette und magnetischen Pinzette sind die am häufigsten verwendeten Methoden der Einzelmolekül-Manipulation. Im Vergleich zu AFM und optische Pinzette9, ermöglichen magnetischen Pinzette stabile Messungen der Faltung entfaltet Dynamik eines einzelnen Moleküls über Tage mithilfe einer Anti-Drift-Technik10,11.
Hier ist eine Einzelmolekül-Manipulation-Plattform magnetischen Pinzette, um die Regulierung der G4 Stabilität zu studieren, durch die Bindung von Proteinen gemeldeten12,13. Diese Arbeit beschreibt die grundlegenden Ansätze, einschließlich Probe und Flow-Kanal-Vorbereitung, das Setup der magnetischen Pinzette und die Kraft-Kalibrierung. Die Kraftregelung und die Anti-Drift-Protokolle wie beschrieben in Schritt 3 ermöglichen lange Zeitmessungen unter verschiedenen Kraft Steuerelemente, z. B. konstante Kraft (Kraft Klemme) und konstante laden bewerten (Kraft-Rampe) und Kraft-Sprung Messung. Das Kraft-Kalibrierung-Protokoll in Schritt 4 beschriebenen ermöglicht Kraft Kalibrierung des < 1 µm kurze Anbindehaltung über eine große Kraft reichen bis zu 100 pN, mit einem relativen Fehler innerhalb von 10 %. Ein Beispiel für eine Regulierung der Stabilität der RNA-Helikase zugeordnete AU-reiche Element (RHAU) Helikase (Alias DHX36, G4R1), der spielt entscheidende Rolle bei der Lösung, dass RNA G4 verwendet wird, um die Anwendungen von dieser Plattform13demonstrieren.
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Protocol
1. Vorbereitung der G4 DNA Einzelmolekül-Stretching
- Prepare 5 '-Thiol beschriftet und 5 '-Biotin beschriftet DsDNA Griffe durch PCR mit DDNA Polymerase auf einen Lambda-Phagen DNA Schablone mit 5 '-Thiol und 5 '-Biotin Primer 14 ( Abbildung 1). Beide DsDNA-Griffe haben hohen GC-Gehalt (> 60 %), um DNA zu verhindern schmelzen wenn DNA zu hohen Kräften oder während DNA Überdehnung stattfindet Übergang 15.
- Reinigen PCR-Produkte mit BstXI Restriktionsenzym laut Hersteller eine kommerzielle Reinigung Kit und verdauen ' s Protokoll.
- Verbinden G4 bilden SsDNA und Flanke SsDNA und DsDNA Griffe mit T4 DNA-Ligase laut Hersteller ' s-Protokoll. Die aufgespaltenen Produkt durch Gel-Extraktion mithilfe eines gewerblichen Reinigung-Kits nach Angaben des Herstellers zu reinigen ' s Protokoll.
2. Vorbereitung des Strömungskanals
- Deckglas Reinigung und Oberflächen Funktionalisierung
- Ort unten Deckgläsern (#1.5, 22 mm × 32 mm) und oberen Deckgläsern (#1.5, 20 x 20 mm) in Abdeckung Glas Gläser (jedes Glas fasst 7 Stück Deckgläsern, Färbung das Volumen beträgt ~ 20 mL). Spülen Sie die Deckgläsern in den Gläsern mit destilliertem Wasser 2-5 Mal.
- Add ~ 20 mL Reinigungslösung 5-40 % in jedes Glas und legen Sie dann in ein Ultraschall Reinigungsbad für 30 min. Spülen mit destilliertem Wasser für > 10 Mal um die Reinigungsmittel zu entfernen.
- Deckgläsern in die Gläser im Ofen trocknen (~ 150 ° C; Vorsicht, heiß), oder durch N 2 Gas. Speichern Sie die getrockneten Top Deckgläsern in einem Trockenschrank.
- Einsatz Plasma (O 2 Gas) zu die Deckgläsern in der Dose für 10 min reinigen. Bereiten Sie während 10 min, 20 mL von 1 % (3-Aminopropyl) Triethoxysilane (APTES) Lösung in Methanol (Vorsicht, giftig/entzündlich). Verwenden eine chemischen Dampfhaube APTES Methanol auflösen.
Hinweis: Vermeiden Sie Feuchtigkeit bei der Lagerung APTES Lösung. Alten APTES verursacht oft Problem in Oberfläche Funktionalisierung von Deckgläsern. - Unmittelbar nach dem Plasma Reinigung, fügen Sie alle die 1 % APTES Lösung in die Gläser und inkubieren Sie für 1 h. Gießen Sie den Abfall in die Abfallflasche spezifisch für 1 % APTES Methanol. Führen Sie die Schritte im Zusammenhang mit Methanol in der Dunstabzugshaube für brennbare Chemikalien.
- Spülen Sie die Gläser einmal mit Methanol und > 10 Mal mit destilliertem Wasser und dann trocknen von Ofen (~ 150 ° C; Vorsicht, heiß). Speichern der APTES-beschichtete Unterseite Deckgläsern für bis zu zwei Wochen bei Nichtgebrauch in einem Trockenschrank.
Hinweis: Nach jedem Teilschritt aus 2.1.1 bis 2.1.4 der Reinigungsprozess kann angehalten werden vor dem nächsten Schritt.
- Montage des Strömungskanals
- bereiten Sie zwei " Abstandshalter ", d.h., Parafilm oder doppelseitige Klebeband (~ 4 mm × 20 mm) für jeden Kanal. Legen Sie die zwei Stücke von Abstandhaltern auf einem unteren Deckgläschen entlang der langen Kante. Das Distanzstück, bilden eine Durchflusszelle dazwischen ein Top Deckglas auflegen (~ 10 mm × 20 mm Bereich, Figur 2A , B).
- Wenn Parafilm als Abstandhalter dient, platzieren Sie den Strömungskanal auf eine Heizung (60-120 ° C; Vorsicht, heiß) für 5-10 s drücken Sie sanft die Seiten des oberen Deckglas zwei Deckgläsern mit Parafilm zusammenhalten. Die resultierende Flow-Kanal hat eine Höhe von ~ 100 µm und damit das Volumen des Kanals beträgt ~ 20 µL.
- Dichtung die lange Kante des Kanals mit Silikonkleber um Leckagen zu vermeiden. Silikonkleber verwenden, um eine kleine Senke-ähnliche Struktur auf jede offene Kante des Strömungskanals, dient als ein Eingang und ein Ausgang der Lösung machen.
Hinweis: Die ein- und Ausreise können auch erfolgen durch andere Wege, z.B. durch anhaftenden kleinen Kunststoff-Ringe mit Wachs. - Speichern von Sendern in einem Trockenschrank für bis zu 4 Wochen.
- Leine DNA auf der unteren Fläche des Strömungskanals
- verdünnen die amino-beschichtete Polystyrol-Kügelchen (Durchmesser: 3 µm) von 200 X in destilliertem 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Puffer. Wirbel die Wulst-Lösung und dann in Kanäle fließen. Inkubieren Sie die Wulst-Lösung in Kanälen für ~ 30 min. Entfernen jede ablösen Perlen durch Waschen mit 200 µL 1 X PBS-Puffer.
- Anpassen (Zunahme/Abnahme) der Inkubationszeit einer Flächendichte von 1 bis 5 Perlen pro 50 mm x 50 mm-Bereich zu erreichen. Speichern Sie die Kanäle, hinterlegt mit den Referenz-Perlen für bis zu 3 Tage.
- Verdünnt Sulfosuccinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC) Pulver in 1 X PBS-Lösung (~ 0,5 mg/mL). Vortex die Lösung und dann in den Kanal fließen.
Hinweis: Bereiten Sie frische Sulfo-SMCC-Lösung vor Gebrauch und den Kanal, Hydrolyse des SMCC zu vermeiden sofort hinzufügen. - Inkubation die SMCC-Lösung in den Kanal für 30 min. Entfernen Sie die SMCC-Lösung durch Waschen mit einer großen Menge (1 mL ~ 50 X die Lautstärke des Kanals) 1 X PBS-Lösung.
Hinweis: Waschen Sie die überschüssige SMCC sorgfältig. Dieser Schritt ist sehr wichtig für die Bindung von DNA auf das Deckglas. - DNA Anbindehaltung Verdünnen der Thiol-Biotin gekennzeichnet DNA in 1 X PBS, mit einer daraus resultierenden DNA-Konzentration von ~ 0,3 nM. Pipette vorsichtig mischen Sie die Lösung, die DNA-Lösung in die SMCC-beschichtete Kanal fließen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren (~ 23 ° C).
- Vorsichtig Waschen entfernt freien DNA mit 200 µL des Blockierens Projektmappe mit 1 X PBS mit 10 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und 0,01 % 2-Mercaptoethanol.
- Blockieren die Kanal-Oberfläche durch Inkubation des Kanals in blocking-Lösung (10 mg/mL BSA, 0,01 % 2-Mercaptoethanol) für > 2 h; nach diesem Schritt, der Kanal ist bereit für Experimente. Die vorbereitete Kanal bei 4 ° C gehalten werden kann ~ 1 Tag.
Hinweis: Die Blockierungsschritt ist wichtig zur Reduzierung der unspezifischen Bindung von DNA und magnetische Beads zu den Deckgläsern.
3. Magnetischen Pinzette Setup und Identifizierung der einzelnen DsDNA Tether
- magnetischen Pinzette Setup
- Start der magnetischen Pinzette Steuern Programm. Hier die magnetischen Pinzette durch eine in-house-geschrieben LabVIEW-Programm gesteuert wurden.
- Richten Sie die Magnet-Zentren vor der Montage des Kanals. Ein 4 X Objektiv verwenden, um die X - und y-Achse die Magnete in der optischen Achse des Mikroskops anzupassen.
- Verwenden einen computergesteuerte motorisierte Manipulator zu bewegen die Magneten entlang der Z-Richtung ( Abb. 2A) und legen Sie den Abstand d = 0 (d: Abstand zwischen den Magneten und Deckglas) wenn die Magnete befestigen Ein Deckglas am Mikroskop.
- Programm der Bewegung des Magneten durch den Manipulator, Kontrolle von Gewalt, einschließlich konstanten Kraft (d.h., Konstante d) zu erreichen und unterschiedliche Zeit Kraft F (t) (d.h. Zeit unterschiedliche d(t )).
- Verwenden helle Lichtquelle Light Emitting Diode (LED) für zurückgestreute Beleuchtung des Wulstes durch das Ziel. Die Perle-Bilder bei einer Abtastrate von 100 Hz zu sammeln, indem Sie ein Ladegerät – gekoppelt (CCD) Kamera. < / lIch >
- Probieren Sie Setup und identifizieren einzelne DsDNA Leine
- Leine Bildung
- sanft fließen in 200 X verdünnt M-280, paramagnetische Perlen in Assay-Lösung (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4 ) in einen Kanal. Inkubieren Sie für 10 min bis die Perlen an Biotin-markierten DNA-Moleküle auf der SMCC-beschichtete Oberfläche durch Thiol-Label Ende immobilisiert binden zu lassen. Vorsichtig Waschen entfernt un-gefesselte Perlen mit 200 µL standard Reaktionslösung.
Hinweis: Der M-280 Perlen zeigen geringere unspezifische Bindung an die Oberfläche im Vergleich zu anderen kommerziellen magnetische Beads wie M-270.
- sanft fließen in 200 X verdünnt M-280, paramagnetische Perlen in Assay-Lösung (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4 ) in einen Kanal. Inkubieren Sie für 10 min bis die Perlen an Biotin-markierten DNA-Moleküle auf der SMCC-beschichtete Oberfläche durch Thiol-Label Ende immobilisiert binden zu lassen. Vorsichtig Waschen entfernt un-gefesselte Perlen mit 200 µL standard Reaktionslösung.
- Montieren Sie den Kanal auf den Mikroskoptisch. Suche nach den Perlen auf der Bodenfläche mit 100 X Öl Immersion Ziel.
- Wählen Sie eine Referenz-Perle auf der Oberfläche und eine bewegliche gefesselte Perle. Die Anfangsbild Bibliotheken der Referenz Wulst und gefesselte Wulst an verschiedenen Unschärfe Flugzeuge zu bauen.
- Kalibrierung des Perlen-Bildes
- vor Experimenten, verwenden Sie eine objektive Piezoaktor erhalten Sie Bilder von Referenz und gefesselte Perlen an verschiedenen Unschärfe Flugzeuge Abstand von 20-50 nm, die als zwei separate Wulst Bild gespeichert werden Bibliotheken und sind jeweils mit der Unschärfe-Abstand ( Abb. 2D) indexiert.
- X, y, Z Positionsbestimmung
- während der Experimente, bestimmen die Position der Schweißnaht in der X-y-Ebene durch die Wulst-Schwerpunkt. Bestimmen Sie die Höhenänderung des tethered Wulstes durch den Vergleich des aktuellen Bildes Wulst mit denen in der Bibliothek gespeichert. Verwenden Sie die Auto-Funktion Korrelationsanalyse der Leistungsspektrum der Fourier-Transformation der Wulst Bilder 16.
- Anti-Drift-Feedback über Referenz Perle
- während der Experimente, verwenden die Piezo, " Schloss " den Abstand zwischen dem Ziel und spezifische Referenz Wulst Bild in der Bibliothek durch eine niedrige Frequenz gespeichert Feedback zu steuern, so dass das Bild stecken Perle die beste Korrelation mit einem bestimmten Bild in der Bibliothek ( Bild 2D) gespeichert hat.
- Festzustellen, ob die Leine durch die Anwendung einer einzigen DsDNA-Molekül ist ~ 65 pN Kraft eines einzigen DsDNA-Molekül zu bestimmen, wenn die Leine durchläuft die charakteristischen DNA Überdehnung Übergang 17 , 18 , 19. Wiederholen Sie den Vorgang, bis ein einzelnes DsDNA-Tether gefunden wird. (Siehe den nächsten Abschnitt Kraft Kalibrierung und DNA Überdehnung Übergang).
- Leine Bildung
4. Magnetischen Pinzette zwingen Kalibrierung
- bestimmen direkt die Kraft (bis zu 100 pN) für lange DNA (48.502 bp λ-DNA) Moleküle mit Wulst Fluktuation durch:
, wobei k B ist die Boltzmann-Konstante, T ist die Temperatur in Kelvin-Skala, δ 2 y ist die Varianz der Wulst Fluktuation in der Richtung senkrecht zu dem Magnetfeld und die Kraft Richtung. In diese Richtung kann die Bewegung des Wulstes beschrieben werden als ein Pendel Fluktuation mit einer Länge von l + R 0, wo l ist die End-to-End Abstand entlang der Kraftrichtung (Verlängerung) der DNA, und R 0 ist der Radius der Perle 10 ( Abb. 3A). - Bestimmen die Eichkurve für Kraft F als Funktion der Magnete zu Wulst Abstand d und F (d) für verschiedene Perlen mit der langen λ-DNA. In der Regel wird der Abstand zwischen Magnet und das Deckglas verwendet, wie die DNA-Tether Länge ignoriert werden kann. Passen die F-d-Kurve von der doppelten exponentiellen Zerfall-Funktion:
, wo die passenden Parameter α1, α2, γ1, γ2 richten sich nach der magnetischen Pinzette und der Parameter C wird durch die heterogene Eigenschaft der magnetischen Beads bestimmt. Durch die Verlagerung der C, F-d-Kurve aus verschiedenen Perlen gewonnen werden kann überlappende 10 ( Abb. 3 b). - Kalibrierung der Parameter C für die einzelnen magnetischen Kügelchen für kurze DNA experimentiert.
- Bestimmung der Kraft, die anhand der Fluktuation erfordert Aufzeichnung der Wulst-Position mit einer Frequenz höher als die Grenzfrequenz:
, wobei γ ist die Drag Koeffizient der Wulst. Für kurze DNA bei hoher Krafteinwirkung es erfordert Aufnahmefrequenz schneller als 100 Hz, also die Kraft kann nicht direkt gemessen werden basierend auf Schwankungen mit der Kamera. Allerdings zwingen der Parameter C ermittelt werden, durch die Messung der Kraft auf einem niedrigen Bereich (< 15 pN) mit Fluktuation und Anpassung der Daten mit einem kalibrierten F-d-Kurve zu den Parameter C 20. - Alternativ für Experimente mit DsDNA, festlegen den Parameter C mit DNA Überdehnung Übergang bei einer Kraft von ~ 65 pN ( Abbildung 3) 21 , 22 , 23 durch die Aufnahme der d-Position an die DsDNA zeigte Erweiterung Sprung (0,6 X Längenzunahme der Kontur Länge). Nach der Festlegung des Parameters C, berechnen die Kraft für die gefesselten Perlen.
- Bestimmung der Kraft, die anhand der Fluktuation erfordert Aufzeichnung der Wulst-Position mit einer Frequenz höher als die Grenzfrequenz:
- Steuern die Raumbelastung durch die Programmierung der Bewegung des Magneten durch die Umkehrfunktion von F (d). Der Magnet sollte die Probe doppelt exponentiell nähern.
Hinweis: Ist der relative Fehler der Kraft, die durch solch eine Hochrechnung Methode bestimmt ~ 10 % und wird hauptsächlich durch die Perle Radius Heterogenität 20.
5. Einzelmolekül-Manipulation der G4 in Anwesenheit und Abwesenheit der verbindlichen Proteine
- Kraft-Rampe experimentiert, nach der Identifizierung der DsDNA-Leine, führen Sie einen Kraftanstieg Scan auf eine Besatzrate von 0,2 pN/s gefolgt von einem Kraft-Ableben Scan auf -0,2 pN/s. Nach jedem stretching Zyklus halten das DNA-Molekül in 1 pN für 30 s erlauben die SsDNA zu G4 umfalten.
- Kraft-Sprung Experimente
- Zyklus der Gewalt zwischen 54 pN für 30 s, unter denen eine gefaltete G4 entfaltet werden könnte, und 1 pN für 60 s, unter denen eine gefaltete G4-15 t entfalten könnte.
- Fließende Proteinlösung
- fließen die Proteinlösung bei ~ 20 pN Kraft zur Befestigung der die Perlen auf dem Deckglas zu vermeiden. DEAH-Box RHAU Helikase, die hohen Spezifität der G4-Struktur zeigte, war verwendeten 24. Die rekombinante Drosophila Melanogaster RHAU (DmRHAU) Helikase wurde in Escherichia coli ausgedrückt und gereinigt wie zuvor beschrieben 25. Die G4 abwickeln Tätigkeit des DmRHAU auf ein Tetramolecular G4-DNA Substrat 13 untersucht wurde.
- Analysieren die sich entfaltenden Kraft mit einer hauseigenen geschrieben Matlab Programm 14.
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Representative Results
Die Testeinrichtung für die Dehnung eines einzelnen Moleküls G4 ist in Abbildung 4dargestellt. Eine einsträngige G4 bildende Sequenz erstreckte sich zwischen zwei DsDNA Griffe war zwischen einem Deckgläschen und einem paramagnetischen Perle angebunden. Um eine einzelne DsDNA gefesselte Perle zu finden, wurde ein overstretching Assay durchgeführt, durch die Erhöhung der Kraft bei konstanter Belastung. Drei Arten von Messungen dienten oft zur Untersuchung der Faltung und Entfaltung der Biomoleküle: (i) konstante Kraftmessung, (Ii) Kraft-Rampe Mess- und (Iii) Kraft-Sprung-Messung. Aufgrund der extrem langsamen Entfaltung dieser G4-Struktur, das Gleichgewicht, die Falten-Entfaltung Übergang nur für die Zeit in Tagen auftreten könnten also Kraft-Rampe und Kraft-Sprung Messungen dienten zur Charakterisierung der sich entfaltenden Kinetik und Stabilität des G4 Strukturen.
Kraft-Rampe Messungen für G4 Entfaltung in das Vorhandensein oder Fehlen von RHAU Protein:
Abbildung 4 b zeigt typische Kraft-Erweiterung Kurven durch ein Kraftanstieg erhalten Scannen auf eine Besatzrate von 0,2 pN/s gefolgt von einer Kraft-Ableben Scan auf -0,2 pN/s. Nach jedem stretching Zyklus fand das DNA-Molekül in 1 pN für 30 s erlauben SsDNA zu G4 umfalten. Die Erweiterung Sprung im Kraftanstieg Scan angezeigt einen sich entfaltenden Übergang des G4. Wenn Sie eine nicht-G4 bilden Sequenz verwenden, kann die plötzliche Erweiterung Sprung beobachtet werden. Die sich entfaltende Kraftverteilung konnte ermittelt werden, durch die Aufnahme der Kräfte auf die Entfaltung aufgetreten. Die Entfaltung der G4-15 t erhalten bei 0,2 pN/s zeigte eine einzelne Spitze bei Kraftverteilung ~ 52 pN. Jedoch in Anwesenheit von 10 nM RHAU, G4-15 t blieb während der Kraftanstieg Scan für bis zu 60 pN, anzeigende G4 Stabilisierung durch RHAU Bindung gefaltet. Im Beisein von 10 nM RHAU und 1 mM ATP wurde die sich entfaltenden Kraftverteilung auf eine geringere Kraft, bezeichnend für eine ATP-abhängige Destabilisierung des G4 von RHAU verlagert.
Kraft-Sprung Messungen des G4 Entfaltung in das Vorhandensein oder Fehlen von RHAU Protein:
Abbildung 5 zeigt eine repräsentative Spur der Wulst Höhe während vier Kraft-Sprung-Zyklen (Abbildung 5, linken); die Krafteinwirkung auf das Molekül war radelte zwischen 54 pN für 30 s, unter denen eine gefaltete G4 entfaltet werden könnte, und 1 pN für 60 s, unter denen eine gefaltete G4-15 t entfalten konnte. Die durchschnittliche Lebensdauer der gefalteten G4 15 t bei 54 pN war ~ 6,4 s, durch den Einbau der Lebensdauer Histogramm mit einer exponentiellen Zerfall Funktion13geschätzt. Nach fließen in eine Lösung von 10 nM RHAU Helikase ohne ATP, die Erweiterung des kabelgebundenen DNA blieb auf einem gefalteten Niveau während der 30 s Haltezeit bei 54 pN, darauf hinweist, dass die RHAU stark stabilisiert die G4-15 t-Struktur gegen mechanische Entfaltung in der Abwesenheit von ATP. Nach fließt in 10 nM RHAU und 1 mM ATP, war die Erweiterung des gleichen Moleküls direkt nach dem Sprung aus 1 pN zu 54 pN auf der Ebene der aufgeklappten SsDNA, darauf hinweist, dass die RHAU die G4-Struktur in Anwesenheit von ATP destabilisiert.
Abbildung 1: Vorbereitung der G4-DNA Einzelmolekül-stretching Experimente.
Die DsDNA-Griffe wurden mittels PCR mit 5'-Thiol und 5'-Biotin Primern zubereitet. PCR-Produkte wurden gereinigt und mit der BstXI Restriktionsenzym verdaut und durch Gel-Extraktion gereinigt wurden. G4 bilden SsDNA, flankieren zwei SsDNA und DsDNA Griff wurden mit T4 DNA-Ligase ligiert. Die aufgespaltenen Produkt wurde durch Gel-Extraktion gereinigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Skizzen von grundlegenden magnetischen Pinzette Apparat.
(A) Skizze einen Strömungskanal mit ein paar Magnete oberhalb und unterhalb Mikroskopie Ziel. (B) Skizze eine montierte Strömungskanal wo die blauen farbigen Rechtecke stellen die oberen und unteren Deckgläsern und grauen elliptische Linien stehen für die ein- und Ausreise des Strömungskanals. (C) Skizze der Krafterzeugung und Kalibrierung des magnetischen Pinzette Setup. (D) Beispiele von Bildern der Referenz Wulst und beweglichen Wulst an verschiedenen de-Fokus Positionen in die Wulst Bild Bibliotheken gespeichert. Die roten Zeichen kennzeichnet das Referenzbild Perle erhalten an einem bestimmten Flugzeug benutzt für die Brennebene Verriegelung de-Fokus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Erzwingen Sie Kalibrierung des magnetischen Pinzette.
(A) Kalibrierung der Kraft mit den Schwankungen der Wulst entlang einer Drehung frei y-Richtung. X-Achse geht in die gleiche Richtung wie das magnetische Feld. Kraft ist entlang der z-Achse und wird durch die Einstellung des Abstandes, d, zwischen dem Permanentmagnet und dem Deckglas gesteuert. (B) Kalibrierung mit einem langen 48.502 bp-DNA. Heterogene magnetischer Wulst-Eigenschaft kann durch einen einzigen Parameter C. beschrieben werden Diese Zahl wurde von10geändert. (C) Kalibrierung des Parameters C eine magnetische Beads angebracht auf eine 2 kb-DNA mit B s Überdehnung Übergang. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Einzelmolekül-Manipulation von einem G4.
(A) Skizze ein stretching single G4-Struktur und die sich entwickelnden Ereignisse zu messen. (B) typische Beispiel für Kraftanstieg (Cyan) und Kraft-Abnahme-Kurve von einem tethered G4. Diese Zahl wurde von12geändert. (C) Kraft-Verlängerung Kurve der G4 in die (grauen) oder Abwesenheit (rosa) RHAU Protein. (D) Unfolding Kraftverteilung des G4 in Abwesenheit (grau) (n = 140) oder das Vorhandensein von RHAU und ATP (rot) (n = 117). Diese Zahl wurde von13geändert. Bitte klicken Sie aufhier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Kraft-Sprung Messungen der G4 Entfaltung.
(A) repräsentative Zeit Spur von der Perle Höhenänderung während Kraft springen Zyklen zwischen 1 pN und 54 pN gemessen ohne DmRHAU, mit 10 nM DmRHAU aber ohne ATP und mit 10 nM DmRHAU und 1 mM ATP, wie in der Abbildung Panel angegeben. (B) repräsentative Zeit Spur von Erweiterung Änderung eines Moleküls G4 (graue Daten) nach dem Sprung zu 54 pN in mehreren Kraft-Sprung-Zyklen, die Daten in (A) entnommen. Die Erweiterungen entsprechend gefaltet (F) und entfaltet G4 (U) sind auch gekennzeichnet; G4 sich entfaltenden Ereignisse sind durch Pfeile angedeutet. Diese Zahl wurde von13geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Einzelmolekül-magnetischen Pinzette wird berichtet, wie beschrieben, eine Plattform für die Untersuchung der mechanischen Stabilität der G4-DNA und die Interaktionen von Proteinen mit G4. Begleiten die Plattform, sind hocheffiziente Protokolle zu finden, G4-DNA Haltegurt und Messung der Faltung entfaltet Dynamik und Stabilität der G4-Struktur mit Nanometer Sonderbeschluss entwickelt. Die Brennebene Verriegelung ermöglicht hochstabile Anti-Drift-Steuerelement, das ist wichtig für die Erkennung eines kleinen Struktur Übergangs wie G4 (Schrittweite ~ 7 nm) und die Wechselwirkungen mit Proteinen in Puffer Austausch Experimente. Diese Plattform wurde vor kurzem zu Studien der Falt- und sich entfaltenden Dynamik der telomeric G4-14 und c-Myc Promoter G412sowie Studien des G4 bindende Protein RHAU Helikase13eingesetzt.
Ein typisches Experiment Fehler ist die unspezifische Bindung von DNA und Perlen auf dem Deckglas oder mehrere DNA binden an magnetischen Kügelchen. Verringerung der unspezifischen Bindung, erstens die Lagerung von Chemikalien wie APTES und SMCC müssen regelmäßig überprüft werden. Zweitens ist es wichtig, wählen einen richtigen Typ magnetische Beads und blockieren die unspezifische Bindung. Mit 10 mg/mL BSA Puffer oder kleine DNA-Oligo, wie Poly T, können um die hydrophobe Oberfläche der Perlen zu blockieren die unspezifische Bindung reduziert. Schließlich kann ein einzelner DNA-Tether leicht aus mehreren DNA Leinen durch die charakteristische DNA Überdehnung Übergang17,18,19unterschieden werden.
Derzeit basiert die Positionsbestimmung der Plattform auf den Wulst bildgebende Analyse, die hat einer begrenzte Ortsauflösung von ~ 2 nm. Darüber hinaus hat es eine begrenzte Sampling-Rate von ~ 100 Hz, vor allem aufgrund begrenzter Erfassungsrate von typischen CCD-Kameras und Korrelationsanalyse der Bilder. Diese Einschränkungen können mittels Totalreflexion Mikroskopie (TIRF) Beleuchtung. Es erzeugt eine dünne Schicht aus evaneszenten Licht, das exponentiell mit der Höhe über der Oberfläche die verwendet werden können, zur Ermittlung der Erweiterung Veränderung der kurzen Molekülen an ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zerfällt, unter Vermeidung Wulst Bildaufnahme und Analyse26 . Eine weitere Einschränkung ist, dass es schwierig, direkt zu visualisieren, die gefesselte Molekül oder Liganden gebunden an das gefesselte Molekül mit Fluoreszenz-Bildgebung in der vertikale Dehnung Design, das durch Dehnung Moleküle in der Brennebene mit überwunden werden können transversalen magnetischen Pinzette27. Schließlich erlaubt das aktuelle Design der Reaktionskanal keine schnelle Lösung Austausch durch die Strömung Störung an das Molekül. Darüber hinaus kann eine große Widerstandskraft bei high-Speed-Flow generiert die Tether "kantig". Diese Einschränkung kann durch Manipulation von Leinen im Inneren platziert an der Unterseite der Kanal28Mikrovertiefungen überwunden werden.
G4, die stabilisierende Substanzen derzeit als mögliche therapeutische Ziele für Krankheiten, einschließlich Krebs gelten, Virus im Zusammenhang mit Krankheiten und Neurodegeneration Krankheiten29,30,31. Das Protokoll kann auf eine breite Palette von G4 verbindliche Proteine2 und kleinen Liganden32angewendet werden. Neben Anwendungen in G4 Studien können diese Plattform als auch die Protokolle, im Prinzip, für Studien von anderen Sekundärstrukturen Nukleinsäuren, DNA und RNA Haarnadeln, Triplex, einschl. i-Motiv33verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Meng Pan für Korrekturlesen Manuskript. Diese Arbeit wird von Singapur Ministerium der Ausbildung akademische Forschung Fonds Stufe 3 (MOE2012-T3-1-001), J.Y unterstützt; der National Research Foundation über das Mechanobiology Institut Singapur, J.Y; der National Research Foundation, des Premierministers Büro, Singapur, unter seinem NRF Investigatorship Programm (NRF Investigatorship Award Nr. 03 / NRFI2016 / NRF, J.Y; die Grundlagenforschung Fonds für den Central-Universitäten (2017KFYXJJ153), H. Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
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