Summary
نحن نقدم في فيفو التصوير أسلوب استخدام الأصباغ الفلورية مختلفة اثنين إلى تعقب تغييرات الأوعية الدموية العمود الفقري الديناميكي بعد إصابة حبل الشوكي كونتوسيفي في الفئران سبراغ داولي الكبار.
Abstract
إصابات النخاع الشوكي (علوم) يسبب اضطرابا والأوعية الدموية في الموقع الإصابة. أمراض الأوعية الدموية يحدث فورا بعد الخيال ويستمر طوال مرحلة الإصابة الحادة. وفي الواقع، تظهر خلايا بطانية لتكون الأول من يموت بعد عشر كونتوسيفي الحث على ذمة فاسوجينيك أحداث الأوعية الدموية المبكر، بما في ذلك زيادة نفاذية الحاجز الحبل الشوكي الدم (بسكب)، وتسهم في أحداث الضرر الثانوي ضارة بسبب آليات الإصابات المعقدة. تستهدف عرقلة الأوعية الدموية، ولذلك، يمكن أن تكون استراتيجية رئيسية للحد من الضرر الثانوي الشلالات التي تسهم في ضعف في غذائها والوظيفية بعد عشر دراسات سابقة أجريت في معظمها على عينات تشريح الجثة وغير قادر على التقاط التغيرات الدينامية لشبكة الأوعية الدموية. في هذه الدراسة، وقد وضعنا في فيفو ديو-لون اثنين-فوتون تصوير وسيلة لرصد التغيرات الدينامية الأوعية الدموية الحاد بعد عشر كونتوسيفي يسمح هذا النهج للكشف عن تدفق الدم وقطر السفينة، وأمراض الأوعية الدموية الأخرى في مواقع مختلفة من الفئران نفس ما قبل وما بعد الإصابة. وبوجه عام، يوفر هذا الأسلوب مكاناً ممتازا للتحقيق في ديناميات الأوعية الدموية.
Introduction
إصابات النخاع الشوكي الرضية (علوم) إصابة مشتركة مما يؤدي إلى الأضرار بالوظيفة الحركية والحسية والمتمتعة بالحكم الذاتي. وفقا للوطنية النخاع الشوكي إصابة الإحصائية مركز (نسسيسك) في عام 2016، حوالي 282,000 شخص تأثرت بينما 69% منهم كانت أساسا بسبب حوادث المرور أو يقع1. هؤلاء المرضى غالباً ما تتطلب العناية المركزة؛ لا يوجد علاج فعال غير متوفرة حاليا. ولذلك، هناك حاجة ماسة استراتيجيات فعالة جديدة نحو الخيال.
الخيال العلمي وينقسم أساسا إلى مرحلتين: الإصابة الأولية والإصابة الثانوية. الضرر الأساسي يشمل الإهانة المادية يسبب نخر النزفية في موقع الأثر2، تليها سلسلة من أحداث الضرر الثانوي، مثل التهاب واستموات الخلايا وديمييلينيشن من محاور عصبية المتبقية، أن يقود تدريجيا للتوسع في العجز المورفولوجية والوظيفية3،4،،من56. نزف هو أول بادرة تظهر الإصابة، مما يدل اضطراب الأوعية الدموية فورا في المرحلة الحادة من علوم7،8. محصن استراتيجية تهدف إلى الحد من الأضرار والأوعية الدموية المبكر يمكن تحسين استرداد المرضى، ولكن هذا يتطلب فهم أفضل للآلية الفيزيولوجية المرضية للأحداث الأوعية الدموية بعد الإصابة المبكرة.
وعلى الرغم من الدراسات السابقة باستخدام أساليب مختلفة لدراسة المفرج الحبل الشوكي، تظل القيود الهامة. عيب مشترك آخر يدرس فقط عينات تشريح الجثة، وعلى سبيل المثال، إزالة الهيدروجين9و autoradiography10، ميكروانجيوجرام8، وتآكل الأوعية الدموية يلقي11وإيمونوهيستوتشيميستري12 ،13. على الرغم من أن يوفر الليزر دوبلر Flowmetry موسع في الوقت الحقيقي رصد تدفق الدم الحبل الشوكي14، أنه غير قادر على التفريق بين نظم الأوعية الدموية والكشف عن التغيرات المورفولوجية الأوعية الدموية. الرنين المغناطيسي الحيوي تعزيز التباين (DCE-التصوير بالرنين المغناطيسي) أيضا موسع، ولكن يقوم بإنشاء صور ذات دقة منخفضة ويتطلب عامل تكلفة البنية التحتية15.
ورغم أن في فيفو التصوير باستخدام 2-فوتون بالليزر الفحص المجهري (2 ف-LSM) قد وضعت لدراسة فاسوديناميكس بقشرة16،،من1718، لديها عدد محدود من الدراسات أظهرت التغيرات الأوعية الدموية بعد عشر تانغ et al. أظهرت التغيرات في تدفق الدم في الحافة من موقع الآفة في نموذج هيميسيكشن19، ولكن التصوير بعد إصابة كونتوسيفي أكثر صعوبة لسببين. أولاً، لن نافذة ضوئية زجاج تقليدية عبر موقع الإصابة إدامة تأثير الميكانيكية وتبقى وظيفية للتصوير. الثانية، وتسرب الراسم إلى حمة نظراً لنزيف يخلق صعوبة مع تصوير ما بعد الإصابة.
نقدم هنا طريقة تصوير رواية ديو-لون، مما يتيح التصوير نفس السفن الفردية في نقاط زمنية ما قبل وما بعد الإصابة. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يوفر لمحة الزمانية مكانية للتغيرات الدينامية الأوعية الدموية بعد عشر كونتوسيفي كما أن لديها الإمكانات لتصوير في نقاط متعددة في وقت ما بعد الإصابة. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها مباشرة على الحيوانات المحورة وراثيا لدراسة التفاعل نيوروفاسكولار.
Protocol
وأجريت جميع إجراءات معالجة جراحية والحيوانية كما وافقت تحت الدليل للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المجلس القومي للبحوث) والمبادئ التوجيهية "إنديانا جامعة كلية للطب المؤسسية الحيوان الرعاية" والاستخدام اللجنة.
1-إعداد الجراحية
- تعقيم كل الأدوات الجراحية، بما في ذلك استقرار العمود الفقري. تنظيف الطاولة الجراحية وجميع المنطقة المحيطة مع الإيثانول 70%. للتحضير لإجراء العمليات الجراحية غير البقاء على قيد الحياة، ضع وسادة جراحية النظيفة على رأس 37 درجة مئوية تدفئة وسادة.
- استخدام الفئران سبراغ داولي (SD) ستة الأسبوع القديمة لهذه الدراسة. تزن وتخدير الفئران مع حقن داخل الكيتامين (87.7 مغ/كغ) وخليط إكسيلازيني (12.3 مغ/كغ). تؤكد المرحلة المناسبة للتخدير عند الحيوان يتوقف عن الاستجابة لحافز قرصه أخمص القدمين. حقن تحت الجلد 0.01-0.05 مغ/كغ البوبرينورفين و 5 ملغ/كغ والايبوبروفين قبل الجراحة.
- يحلق الفئران في المناطق 2: منطقة عنق الرحم العمود الفقري في الظهر ومنطقة الرقبة من ناحية الثدي. مسحه مناطق الجلد مع فرك الجراحية تدين ومناديل الكحول 70%. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء الجراحة. وضع الحيوان في موقف ضعيف على لوحة العمليات الجراحية نظيفة.
2-قسطرة الوريد خارجي
- تحديد موقع حبل الوريد الخارجي عن طريق إيجاد نقطة نبض قرب الترقوة، وقطع مع زوج من مقص الربيع الصغيرة جعل شق عمودي على الفور، وهو أن عبر النقطة النقاط التشريحية 3: راموس والذيلية للفك السفلي اليمنى، السلية أكبر من عظم العضد وقبضة (الشكل 1A). عزل السفينة باستخدام مقص الربيع والملقط غرامة. التعادل نهاية القاصي مع خط (الشكل 1) خياطة جراحية معقمة 120.
- إعداد واحد 1 مل حقنه مليئة بالمياه المالحة ومتصل قسطرة متخصصة من إبرة عيار 21 (الشكل 1B). إجراء شق صغير باستخدام مقص الصغرى على متن السفينة وتنزلق القسطرة في السفينة.
- تأمين الإبرة بربط كلا الدانية والبعيدة النهاية (الشكل 1). المتخصصة القسطرة مصنوع من إبرة قياس 21. طحن الحافة المسطحة واللحام بقطعة 2 مم من الحافة قطع من آخر 21-قياس الإبرة. وهذا يمنع القسطرة من الانزلاق خارج.
ملاحظة: كمية صغيرة من الدم تتدفق الإبرة يشير إلى أن الإبرة دخلت الأوعية الدموية بنجاح.
- تأمين الإبرة بربط كلا الدانية والبعيدة النهاية (الشكل 1). المتخصصة القسطرة مصنوع من إبرة قياس 21. طحن الحافة المسطحة واللحام بقطعة 2 مم من الحافة قطع من آخر 21-قياس الإبرة. وهذا يمنع القسطرة من الانزلاق خارج.
3-العمود الفقري استقرار والصفيحة C5 C7
- وضع الحيوان في موقف معرضة. قطع الجلد على طول خط الوسط مع شفرة المبضع رقم 15 في مستويات العمود الفقري المرجوة. تشريح طبقات العضلات من 5th إلى 7th فقرات عنق الرحم (C7 C5) ثنائيا لفضح الأوجه الجانبية (الشكل 2A)21.
ملاحظة: تحديد فقرة الصدر الثاني (T2) عن طريق إيجاد المصطلحات بين سكابولاي. عد إلى الأعلى من فقرة T2 للعثور على C7 فقرة21،22،،من2324. - استقرار العمود الفقري للفئران باستخدام جهاز تثبيت استقرار معدلة. جعل فتحه على كلا الجانبين من عظم العمود الفقري الجانبي. الشريحة بالأسلحة الفولاذ المقاوم للصدأ تحت جوانب عملية عرضية المكشوفة وتضييق الخناق على تأمين الاستقرار (الشكل 2).
- بعناية إزالة عن C5 C7 (الصفيحة، الشكل 2).
- ضع قطعة صغيرة من المحلول الملحي بالدماء gelfoam فوق الجافية المكشوفة الاحتفاظ بها رطبة (الشكل 2D).
4-تركيب اثنين-فوتون (ف 2) تصوير النافذة
- الأشياء قطعة صغيرة من جيلفوام إلى الفجوة بين العضلات والعظام، والعمود الفقري أيضا الأشياء خط رفيع من جيلفوام بين الحبل الشوكي وعظام العمود الفقري، ثم استخدم الغراء لاصق الأنسجة لختم منطقة العضلات والعظام المحيطة بها. انتظر 5 دقائق لجفاف كامل (الشكل 2E).
ملاحظة: هذه الخطوة يمنع فعلياً نزيف المستقبل في النافذة ويجتازها الحلول الغمر. - إعداد أجار 4% مع ddH2س في فرن ميكروويف. بعد أجار يحل تماما، الانتظار حتى تعود إلى درجة حرارة ملموس. ملء المحاقن معقمة 1 مل مع الحل أجار والأنابيب على حافة النافذة لبناء جدار (الشكل 2E). الحل الذي يتصلب بسرعة ولا تزال مرنة للسماح للعدسة أو الهدف التحرك بحرية.
- عندما تكون جاهزاً للتصوير، إزالة السائل الغمر جيلفوام ومكان داخل النافذة 2 ف التصوير (الشكل 2 واو). نقل الحيوان استقرت داخل غرفة مظلمة مجهر 2-فوتون ووضع الإطار 2 ف التصوير مباشرة تحت العدسة. انخفاض العدسة بعناية في إطار التصوير.
5-الحقن بصبغة الفلورسنت الأولى والتصوير بالأساس
- إعداد 0.5 مل من "ب والرودامين" isothiocyanate-ديكستران (4 مغ/مل متوسط الوزن الجزيئي ~ 70kDa) في المياه المالحة. ملء المحاقن معقمة 1 مل مع الحل والاتصال الحقن بالقسطرة المثبتة مسبقاً.
ملاحظة: إعداد الحل صبغة الفلورسنت قبل أن يوصي باستخدامها. - حقن الصبغة الأولى بالاكتئاب حقنه ببطء شديد (الشكل 3B). أولاً، استخدم العدسة لتحديد مجال الاهتمام. استخدام كاميرا جهاز إلى جانب (CCD) المسؤول للحصول على صورة مشرقة الميدانية لأنماط الأوعية الدموية السطحية في التكبير أقل بصورة بارزة. قم بالتبديل إلى وضع المسح الضوئي الليزر ثم فتح ف 2 برامج لجمع كل الصور التصوير والخط-مسح البيانات.
- حدد الليزر ف 2 السليم الإثارة الطول الموجي، والسلطة والفلورسنت القناة (القناة الحمراء لصبغ الأولى) لمطابقة مع فلوروفوريس المستخدمة في الأنسجة المصورة ثم قم بتنفيذ التصوير في فيفو (الرقم 3E). إبقاء هذا الحيوان على وسادة تدفئة خلال العملية برمتها.
6-C7 "إصابة كونتوسيفي" باستخدام جهاز ليزا
- أداء من إصابة كدمة في خط الوسط C7 استخدام جهاز جهاز نظام إصابة لويزفيل (ليزا) استناداً بروتوكول المحددة سابقا25،26.
- باختصار، وضع الحيوان في مرحلة ليزا بعد المعايرة.
7-الحقن بصبغة الفلورسنت الثانية وتصوير ما بعد الإصابة
- إعداد 0.5 مل من Fluorescein isothiocyanate-ديكستران (4 مغ/مل، ومتوسط الوزن الجزيئي ~ 70 كاتشين) في المحلول الملحي نفسه كما هو الحال في 5.1. ملء الحل في المحاقن معقمة 1 مل والاتصال مع القسطرة المثبتة مسبقاً.
- نقل ظهر الحيوان استقرت داخل غرفة مظلمة المجهر ف 2 وإعادة الصورة نفس المنطقة مع القناة الحمراء للصبغة الأولى وقناة الأخضر للصبغة الثانية (أرقام 3D & ز).
- في نهاية التصوير، الإفراج عن الفئران من جهاز تثبيت العمود الفقري وتنظيف الجدار أجار.
8-الحيوان التضحية
- وبعد التصوير، والتضحية الفئران بعد بروتوكول نضح ترانسكارديال27. جمع عينات النخاع الشوكي وإصلاحها في 4% منهاج عمل بيجين.
9-اتصال بيانات التحليل: القياس الكمي لأقطار السفينة
- تحويل ملفات الصور إلى محطة عمل للتحليل دون اتصال.
- فتح إيماجيج وحدد "ملف" ومن ثم اختر البيانات الخام التي تم حفظها سابقا وفتح ملف الصورة المفردة المرتبطة بها (الشكل 4 باء).
- معايرة الصورة عن طريق تحديد "تحليل" تليها "ضبط مقياس" (الشكل 4). يتم احتساب القيمة التي توضع في "المسافة بالبكسل" باستخدام المعادلة المعروضة في الشكل 4A. معايرة العدسة البصرية 2-فوتون يحدد القيمة الافتراضية في المعادلة. تم العثور على قيمة "أوبتيكالزوم" في Excel للتوسيع توصيف لانجواجيفيلي (ملف XML) المقترنة مع ملف صورة واحدة (الشكل 4 باء).
- رسم خط عمودي على المحور الطويل للسفينة (الشكل 41 & ه1) وحدد "تحليل" تليها "التدبير". يتم عرض بقياس قطر السفينة في إطار النتائج (الشكل 42 & ه2). كرر 3 مرات عبر السفينة للحصول على قيمة المتوسط.
10-اتصال بيانات التحليل: القياس الكمي للدم الحمراء الخلية السرعة (RBC)
- نقل خط-مسح الملفات إلى محطة العمل لتحليل.
- بدء تشغيل البرنامج إيماجيج وحدد "ملف" ومن ثم اختر البيانات الخام التي تم حفظها سابقا وفتح كافة الملفات المقترنة خط المسح الضوئي مع ملحق اسم ".ome".
- فتح "صورة" وحدد "رزمة" تليها "الصور المكدس". تحويل جميع OME الملفات إلى ملف TIFF مكدس صورة واحدة.
- ابدأ تشغيل برنامج Matlab وانقر فوق "فتح"، حدد ملف الرمز "LSPIV_parallel.m". ملاحظة: يمكن تحميل Matlab شفرة ل LS PIV في https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18
- حدد الأوامر التالية: "تشغيل" > "تغيير مجلد" > "الشريان". اختر ملف TIFF المكدس الصورة التي تم إنشاؤها في 10.3.
- اكتب "Y" ثم اضغط Enter.
- ضع مؤشر على اليسار والجانب الأيمن للصورة على التوالي، وبدء تشغيل البرنامج لمعالجة البيانات.
- في نهاية البرنامج، قم بإدخال القيم 2 لحساب القراءة النهائية: "قيمة التحويل pixel_meter"، و "قيمة التحويل وقت المسح الضوئي". يمكن الاطلاع على على حد سواء في ملف XML المقترنة مع بيانات خط المسح الضوئي. يتم التعبير عن القيمة النهائية كالمتوسط والانحراف المعياري للسرعة في وحدات ملليمتر في الثانية (م/ثانية).
Representative Results
الأسلوب قادرة على رصد في فيفو العمود الفقري والأوعية الدموية التغيرات الدينامية في السفن الفردية عشر ما قبل وما بعد الصدمة أولاً، يتم تثبيت قسطرة عن طريق الوريد الخارجي لتوفير الوصول لحقن صبغة الفلورسنت اللاحقة (الشكل 1A-ج، الشكل 3). في الخطوة الثانية، يتم استخدام جهاز متخصصة استقرار المكشوفة C5-C7 (الشكل 1-F، الشكل 2 أ-ب). يمكن القضاء على التحف التنفس هذه الخطوة الاستقرار وتوفير تصوير ثابت. عقب الاستئصال (الشكل 2)، والخطوة التالية هي تركيب 2 ف التصوير نافذة على C5-C7 (الشكل 2D-F). تقليل الأنسجة الطرفية نزيف حول إطار التصوير النخاعي أمر حاسم لنجاح تصوير الأوعية الدموية. الخطوة التالية لحقن صبغة الفلورسنت والرودامين-ديكستران (أحمر) عن طريق القسطرة المشار إليها أعلاه إلى التاريخية وخريطة شبكة الأوعية الدموية كخط الأساس (الشكل 3 أ-ب، ه). بعد C7 خط الوسط إصابة كونتوسيفي بشدة معتدلة، هو عرض فيتك-ديكستران (الأخضر) عند نقطة الإصابة بعد انتهاء الوقت المطلوب (الشكل 3A & د). جمال الأسلوب الثنائي-اللون أن واحداً لا يزال يمكن الكشف عن بنية الأوعية الدموية باستخدام الصبغة الثانية عند الصبغة الأولى فعلا قد تسربت إلى حمة سبب الإصابة (الشكل 3).
خلال جلسة التصوير، فمن المستحسن إبقاء الحيوان على منصة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية بعد تحريض التخدير.
باستخدام الأسلوب الثنائي-لون لنا، يمكن قياسها وحساب سرعة القطر وخلايا الدم الحمراء (RBC السرعة) السفن الفردية. للقطر، يمكن للمرء استخدام إيماجيج لقياس السفينة في قطر أكبر ليكرر 3 بعد المعايرة (الشكل 4). للسرعة، يتم قياس الصور خط المسح الضوئي باستخدام برنامج ماتلاب (MATLAB R2013a) لحساب السرعة (الشكل 5) ربك18. استناداً إلى مورفولوجيا وسرعة تدفق الدم، وسفينة القطر، ويمكن تصنيف السفن إلى فئتين: الشريان والوريد (انظر الجدول 1).
الشكل 1 . حبل الوريد قسطرة والعمود الفقري لتحقيق الاستقرار.
(أ) تخطيطي الرسم لتحديد موقع حبل الوريد الخارجي. (ب) القسطرة المتخصصة من إبرة قياس 21. وكان التلميح الأرض المسطحة وملحومة مع قطعة من تلميح 2 ملليمتر إلى قطع آخر 21-قياس الإبرة. (ج) الرسم تخطيطي لقسطرة. نهاية القاصي متصلة أولاً، متبوعاً بتثبيت القسطرة الدانية، تنتهي مع ابزيم الإبرة جنبا إلى جنب مع السفينة (ربط السفينة، رؤوس الأسهم الزرقاء). (د) صورة من استقرار العمود الفقري تعديله. يتم عرض إطار C5 C7 قبل الاستئصال (ه) وبعد الاستئصال و علوم كونتوسيفي (F) . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . رسم تخطيطي للألياف البصرية نافذة التثبيت خطوة بخطوة.
(أ) الخطوة 1: فضح الفقرة بقطع الجلد والعضلات على طول خط الوسط. (ب) الخطوة 2: تحقيق الاستقرار في العمود الفقري. (ج) الخطوة 3: الاستئصال. (د) الخطوة 4: الحفاظ على رطوبة النخاع الشوكي عن طريق وضع قطعة من جيلفوام غارقة في المياه المالحة. (ﻫ) الخطوة 5: إغلاق الثغرات مع gelfoam العقيمة وفيتبوند. بعد التجفيف، طبقة من أجار الجدار بنيت على حافة النافذة. (و) خطوة 6: عندما تكون جاهزاً للتصوير، إزالة السائل الغمر جيلفوام ومكان داخل 2 ف التصوير نافذة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . في فيفو ديو-لون الأسلوب الإجراء خطوة بخطوة.
الإجراء بأكمله يتكون من 5 خطوات (A). وبعد الخطوة 1 والخطوة 2، زوج من تتبع ديكستران مع حجم 70 التقريبية كاتشين مدخلة في تسلسل لتسمية المفرج الحبل الشوكي قبل (ب وج) وبعد كونتوسيفي العلوم (د). (E)-(G) ممثل ف 2 صور عرض المفرج الحبل الشوكي في الخطوة 3 إلى الخطوة 5. الأسهم البيضاء تشير إلى صبغ أحمر الفوج الأول تسريب المناطق (F و G)، عرض رؤوس الأسهم الفيروز تسرب الصبغة الخضراء الموجه الثانية (ز). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . اقتناء والتحديد الكمي لأقطار السفينة العمود الفقري.
بعد الإعداد، يتم الحصول على ملفات صورة واحدة تحت المجهر ف 2، جنبا إلى جنب مع ملفات XML لمعايرة قيم (ب). (أ) يعرض المعادلة حساب "بكسل كل ميكرون"، استناداً إلى قيم تكبير بصري. بعد المعايرة في إيماجيج (ج)، يتم قياس أقطار السفينة في 3 نقاط عبر المحور الطولي قبل (د1) وبعد (ه1) الإصابة. (د2) و (ه2) عرض القيم المقاسة. (و) التحديد الكمي لأقطار السفينة في الأساس و 30 دقيقة بعد الإصابة. بار الحجم = 50 ميكرومتر. تظهر البيانات يعني ± التنمية المستدامة، * * * ف < 0.0001، اختبار t المزدوجة الذيل اثنين.الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 . اقتناء والتحديد الكمي لسرعة السفينة العمود الفقري.
يتم الحصول على ملفات الصور سطر الفحص تحت المجهر ف 2 لحساب سرعات سفينة واحدة. (أ) مثال سفينة المحدد وأسلوب لتقييم سرعة الأوعية الدموية ربك. (ب) مثال الشرياني صورة خط المسح الضوئي وملف الأرض المقابلة لحساب السرعة، فضلا عن مثال الوريد (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الشريان | السياق | |
| مورفولوجيا | جدار الوعاء على التوالي، سلسة، سميكة | الفروع، وحواف خشنة |
| سرعة تدفق الدم | سريع | بطيئة ولكن يختلف |
| قطر | 30-80 ميكرومتر | 100-250 ميكرون |
الجدول 1: معايير تحديد أنواع السفن
Discussion
تحد واحد للدراسات الأوعية الدموية عقب الخيال هو التقادم التقني نظراً لأن التقنيات التقليدية مقيدة إلى حد كبير إلى التغييرات بنية الأوعية الدموية في عينات تشريح الجثة. هذه الرواية في فيفو التصوير الطريقة الموصوفة أعلاه يمكن القياس الحيوي من تدفق الدم والمعلمات ذات الصلة (السرعة وسفينة القطر) باستخدام 2 ف-LSM في الفئران الحية. كما أنه يتيح فحص متكررة في نفس مجموعات من السفن في نقاط زمنية مختلفة بعد عشر كونتوسيفي تقنيات التصوير المجهري 2-فوتون السابقة كانت غير قادر على التقاط هياكل الأوعية الدموية الصدمات النفسية بسبب تسرب التتبع واحد. لدينا تصميم الألوان الثنائي يتيح تصوير الأوعية الدموية الحيوية لنماذج الصدمات. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر مرونة هذا الأسلوب فرصة لإنشاء تشكيل جانبي الزمانية مكانية للتغيرات الوعائية الحادة بعد عشر
هناك عدة خطوات حاسمة في جهودنا في فيفو ديو-التصوير أسلوب لون. أولاً، أنه أمر أساسي لضمان الاستقرار المادي للحبل الشوكي قبل الوقت الفاصل بين التصوير، ولا سيما تخفيض التنفس الحركة قطعة أثرية. لقد قمنا بتصميم شكل المشابك العمود الفقري لزيادة ارتفاع فقرة العمود الفقري قليلاً أثناء التثبيت. وهكذا يمكن أن تكون حركة الحبل الشوكي مضاهاة للحيوان التنفس تقلص إلى حد كبير (الشكل 1-F، 2B). من المستحسن التحقق من استقرار الحبل الشوكي قبل بداية كل دورة التصوير. في حالة فشل النخاع الشوكي لتحقيق الاستقرار، ينبغي التعديل المحاذاة وضيق من المشابك الحبل الشوكي. الأنسجة المحيطية، والثاني (العظام والعضلات طبقة الجلد) نزيف في نافذة التصوير يمكن أن خطر التلوث من طريقة العرض. لجلسة تصوير سلس، ينبغي تطبيق الغراء لاصقة جيلفوام والأنسجة للأنسجة المحيطة للوقاية الفعالة. ثالثا، لقد الأصباغ الفلورية نختار حجم مماثل كالزلال (كاتشين 66)، وهو بروتين بلازما الدم الرئيسية عالية الوزن الجزيئي. تحت شروط التماثل الساكن، أبقى الأصباغ إلى حد كبير داخل السفينة مماثلة كالزلال28. بعد الإصابة، الأصباغ تم تمريرها من خلال هيكل غشائي تعطلت وتسربت إلى حمة، مما تسبب كثافة فلورسنت زيادة كبيرة في منطقة هامشية من المفرج (الرقم 3F-ز). وبالإضافة إلى ذلك، هناك سببان لماذا علينا أن نختار قسطرة الوريد الخارجي. أولاً، يمكن أن توفر طريقا موجوداً دائماً للتسليم في أي وقت من هذه التجربة. وثانيا، يمكن استخدامه كطريق لحقن العلاج مستقبلا.
على الرغم من أن لدينا أسلوب لون ديو في فيفو قادرة على توفير مكان رواية للصدمة دراسات تصوير الأوعية الدموية، يجب أن تعالج بعض المحاذير المتعلقة بهذا الأسلوب. حاليا، تم تصميم هذه التقنية تقييم التغيرات الأوعية الدموية في نقاط زمنية 2 (خط الأساس ونقطة واحدة في وقت ما بعد الإصابة)، ولكن من الممكن للتبديل إلى نقاط زمنية متعددة إذا كانت تتوفر صبغات الفلورسنت إضافية والقنوات. على الرغم من أن هناك العديد من الدراسات باستخدام نافذة زجاجية مزروع لتصوير إينترافيتال المزمن، أيا منها يمكن أن توفر معلومات خط الأساس على متن السفينة نفسها بعد الإصابات الرضية19،،من2930، 31،32. وخلافا لهذه الدراسات، ونافذة لدينا نافذة زجاجية لا. يعد هذا ملائماً لتصوير ما قبل وما بعد الإصابة، ولكن قد يكون تحديا لإعادة إرساء إطار للمراقبة طويلة الأجل. ابحاثنا مستقبلا هو العمل على تحسين التقنية لتصوير المزمنة. ويتألف نظام الأوعية الدموية للعديد من أنواع السفن (الشريان والوريد والشعرية) وكل منها يختلف في جوانب مورفولوجيا ووظيفة. يمكن أن يساعد التفرقة بين أنواع السفن أثناء تصوير ندف على نمط واضح من تغييرات الأوعية الدموية. يعتمد البروتوكول أعلاه على المراقب تحديد السفن التي تستند إلى مورفولوجيا والسرعة؛ ومع ذلك، يمكن إضافة صبغة خاصة بالشريان بسهولة إعطاء تصنيف أكثر تحديداً بين سفينة أنواع33.
هذه التقنية المحدودة للأنصبة المقررة على كونتوسيفي ونماذج مؤلمة أخرى، مثل سحق الأذى والضرر الإشعاعي، ليس فقط ولكن أيضا في الدراسات التي تركز على تعطيل بسكب، نفاذية كذلك الأوعية الدموية تغيير. وإلى جانب الخيال، يمكن استخدامه لدراسة التغيرات الأوعية الدموية عقب الأخرى أمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي (المرض) والتصلب المتعدد (MS). وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون التحويل إلى نموذج حيوانات المحورة وراثيا لدراسة التفاعل الديناميكي نيوروفاسكولار. يمكن أن تستخدم الدراسات المستقبلية كأداة فحص قوية، تقنية التصوير الموضحة هنا لتقييم فعالية العلاج لإصابات النخاع الشوكي.
وفي الختام، في فيفو الأسلوب الثنائي-لون هو أداة نهج موثوق بها، في الوقت الحقيقي، في فيفو لتقييم التغيرات الدينامية في الأوعية الدموية، ومثالي لتوصيف الشخصية الأوعية الزمانية المكانية والكشف عن علاجات تقليل الأضرار الثانوية بعد عشر
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها جزئيا NS059622 المعاهد الوطنية للصحة، NS073636، ووزارة الدفاع كدمرب W81XWH-12-1-0562، تستحق الاستعراض جائزة I01 BX002356 من إدارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكي، كريغ ح نيلسون مؤسسة 296749، إنديانا الحبل الشوكي و "مؤسسة البحوث إصابة المخ" ( إيسكبيرف) إنديانا إدارة الدولة في الصحة (019919)، وماري جورج هولمان أموال الهبات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
| Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
| Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
| Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
| Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
| Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
| Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
| Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
| Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
| Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
| Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
| Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
| Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
| micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
| 3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
| Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18" | LOOK | 786 | Can be from any vendor |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
| Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
| LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
| PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
| ImageJ | Image analysis software | ||
| Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |
References
- National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. , (2016).
- Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59 (4), 606-619 (2006).
- Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (1), 23-27 (2016).
- Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (10), 1678-1684 (2016).
- Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164 (3), 837-843 (1987).
- Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86 (3), 483-492 (1997).
- Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2 (3), 197-200 (1974).
- Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
- Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32 (2), 260-268 (1993).
- Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103 (1), 34-40 (1989).
- Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24 (3), 492-507 (2007).
- Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27 (4), 403-408 (2005).
- Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22 (3), 332-341 (2009).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4 (2), e22 (2006).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), e38590 (2012).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 84-94 (2002).
- Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
- Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220 (1), 9-22 (2009).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).
- Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
