Summary
We voeren een in vivo imaging methode met behulp van twee verschillende fluorescente kleurstoffen om dynamische spinale vasculaire wijzigingen na een contusive dwarslaesie bij volwassen Sprague-Dawley ratten te houden.
Abstract
Dwarslaesie (SCI) veroorzaakt aanzienlijke Vasculaire verstoringen op de site van letsel. Vasculaire pathologie treedt op onmiddellijk na SCI en blijft tijdens de fase van acute schade. In feite, endotheliale cellen lijken te zijn de eerste om te sterven na een contusive SCI. De vroege vasculaire gebeurtenissen, met inbegrip van verhoogde doorlaatbaarheid van de bloed-ruggenmerg barrière (BSCB), vasogenic oedeem veroorzaken en bijdragen aan evenementen van de schadelijke secundaire schade veroorzaakt door complexe schade mechanismen. Gericht op de vasculaire verstoring, daarom zou een belangrijke strategie ter beperking van de secundaire schade cascades die aan de histologische en functionele waardeverminderingen na SCI. bijdragen Eerdere studies werden vooral uitgevoerd op postmortem monsters en konden de dynamische wijzigingen van de vasculaire netwerk vast te leggen. In deze studie, hebben we een in vivo duo-kleur twee-foton beeldvorming methode ontwikkeld om te controleren van acute vasculaire dynamische veranderingen na contusive SCI. Deze aanpak maakt het mogelijk opsporen van de bloedstroom, vaartuig diameter en andere vasculaire pathologieën op verschillende plaatsen van de dezelfde rat pre-en post letsel. Globaal, is deze methode biedt een uitstekende plek voor het onderzoeken van vasculaire dynamiek.
Introduction
Traumatische dwarslaesie (SCI) is een gemeenschappelijk verwonding leidt tot aantasting van de motorische, sensorische en autonome functie. Volgens de nationale Spinal Cord Injury statistische Center (NSCISC) in 2016, ongeveer 282,000 personen werden getroffen terwijl 69% van hen voornamelijk als gevolg van verkeersongevallen waren of1valt. Deze patiënten vereisen vaak intensieve zorg; geen effectieve behandeling is echter momenteel beschikbaar. Nieuwe effectieve strategieën naar SCI zijn derhalve dringend noodzakelijk.
SCI is voornamelijk verdeeld in twee fasen: letsel van de primaire en secundaire schade. De primaire schade omvat de fysieke belediging veroorzaakt hemorragische necrose op de site van effect2, gevolgd door een reeks secundaire schade gebeurtenissen, zoals ontsteking, cel apoptosis en demyelinisatie van de resterende axonen, die geleidelijk leiden aan de uitbreiding van de morfologische en functionele tekorten3,,4,,5,6. Bloeding is het eerste zichtbare teken van schade, die een onmiddellijke Vasculaire verstoringen in de acute fase van SCI7,8aangeeft. Een neuroprotectieve strategie ter vermindering van de vroege vasculaire schade herstel van de patiënten kan verbeteren, maar dit vereist een beter begrip van de pathofysiologische mechanismen van vroege na letsel vasculaire gebeurtenissen.
Ondanks eerdere studies verschillende methoden gebruiken voor het bestuderen van ruggenmerg therapieën, blijven significante beperkingen. De meeste gedeelde nadeel is monstes alleen postmortem, bijvoorbeeld waterstof klaring9, autoradiografie10, microangiogram8, vasculaire corrosie afgietsels11en immunohistochemistry12 ,,13. Maar Laser Doppler flowmetrie noninvasive real-time bewaking van ruggenmerg bloed stroom14 biedt, is het niet in staat om te onderscheiden tussen de vasculaire systemen en vasculaire morfologische veranderingen detecteren. Dynamische Contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) is ook noninvasive, maar het lage resolutiebeelden genereert en een dure infrastructuur15vereist.
Hoewel in vivo imaging met behulp van 2-foton laser scanning microscopie (2 P-LSM) is ontwikkeld voor het bestuderen van de vasodynamics in de cortex16,17,18, een beperkt aantal studies hebben aangetoonde vasculaire wijzigingen na een SCI. Tang et al. hebben veranderingen in de bloedstroom aan de rand van de site van de laesie in een hemisection model19, maar imaging getoond nadat een contusive letsel is moeilijker om twee redenen. Eerst, zou een traditionele optische glas over de schade-site niet houden van de mechanische impact en blijven functioneren voor imaging. Tweede, het weglekken van tracer in het parenchym wegens bloeding creëert problemen met na letsel beeldvorming.
Hier presenteren we een nieuwe duo-kleur beeldvorming methode, waarmee de dezelfde individuele vaartuigen op pre- en post letsel tijdstippen imaging. Daarnaast geeft het een temporele-ruimtelijke Profiel van vasculaire dynamische veranderingen na een contusive SCI. Het heeft ook het potentieel voor imaging op meerdere na blessuretijd punten. Dit protocol kan rechtstreeks worden toegepast op transgene dieren te bestuderen neurovasculaire interactie.
Protocol
Alle chirurgische en dierlijke omgang werden uitgevoerd zoals goedgekeurd onder de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (National Research Council) en de richtlijnen van de Indiana University School van geneeskunde institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. chirurgische voorbereiding
- Steriliseren alle chirurgische hulpmiddelen met inbegrip van de stabilisator van de wervelkolom. Reinig de chirurgische tabel en alle omliggende gebied met 70% ethanol. Voor de voorbereiding van de niet-survival chirurgische ingreep, plaatst u een schone chirurgische pad op de bovenkant van een 37 ° C verwarming pad.
- Gebruik de zes weken oude Sprague-Dawley (SD) rat voor deze studie. Weeg- en anesthetize van de rat met een intraperitoneale injectie van ketamine (87,7 mg/kg) en xylazine (12.3 mg/kg) mengsel. Goede fase van anesthesie bevestigen wanneer het dier ophoudt te reageren op een prikkel van Teen snuifje. Subcutaan injecteren 0.01-0,05 mg/kg buprenorfine en 5mg/kg Carprofen voorafgaand aan de operatie.
- Scheren van de rat in 2 gebieden: het gebied van de cervicale wervelkolom op de rug en de nek regio aan de kant van de borst. De gebieden van de huid met betadine chirurgische scrub en doekjes van 70% alcohol swab. Toepassing oog zalf om te voorkomen dat droge ogen tijdens de operatie. Plaats het dier in een liggende positie op de schone chirurgische pad.
2. externe halsslagader catheterisatie
- Zoek de externe halsslagader door het vinden van het punt van de pols in de buurt van het sleutelbeen en knippen met een schaar van de kleine voorjaar te maken van een verticale insnijding ter plaatse, die de Kruis-punt van 3 anatomische punten: caudal ramus van juiste onderkaak, grotere tuberculum van opperarmbeen en manubrium (figuur 1A). Isoleren van het vaartuig met behulp van voorjaar schaar en fijne pincet. Bind het distale uiteinde met 1 steriele chirurgische hechtdraad lijn (Figuur 1 c)20.
- Bereiden een 1 mL spuit gevuld met zoutoplossing en verbonden met een speciale katheter is gemaakt van een 21-gauge naald (figuur 1B). Maken een kleine snede met behulp van een paar micro schaar op het vaartuig en schuif de katheter in het schip.
- Beveilig de naald door koppelverkoop van zowel het proximale en distale einde (Figuur 1 c). De gespecialiseerde katheter is gemaakt van een naald 21-gauge. De platte tip slijpen en lassen met een tip van een ander 21-gauge naald afgesneden stuk 2-mm. Dit kan voorkomen dat de katheter uit uitglijden buiten.
Opmerking: Een kleine hoeveelheid bloed stroomt in de naald wordt aangegeven dat de naald een bloedvat met succes is ingevoerd.
- Beveilig de naald door koppelverkoop van zowel het proximale en distale einde (Figuur 1 c). De gespecialiseerde katheter is gemaakt van een naald 21-gauge. De platte tip slijpen en lassen met een tip van een ander 21-gauge naald afgesneden stuk 2-mm. Dit kan voorkomen dat de katheter uit uitglijden buiten.
3. spine Stabilization en C5-C7 laminectomie
- Plaats het dier in een horizontale positie. De huid langs de middellijn snijden met een mes van de scalpel No. 15 op het gewenste niveau van het spinale. Ontleden de spier lagen van de 5th 7th cervicale wervels (C5-C7) bilateraal de laterale facetten (figuur 2A)21bloot te stellen.
Opmerking: Zoek de tweede thoracale wervel (T2) door het vinden van de piek tussen de scapulae. Tellen omhoog van de wervel T2 te vinden de C7 wervel21,22,23,24. - Het stabiliseren van de wervelkolom van de rat met behulp van een gemodificeerde stabiliserende apparaat. Maak een gleuf aan beide zijden van het laterale Vertebrale bot. Schuif de roestvrij stalen armen onder de blootgestelde transverse proces facetten en draai de schroeven om stabiliteit (figuur 2B).
- Verwijder voorzichtig de C5-C7 laminae (laminectomie, figuur 2C).
- Plaats een kleine hoeveelheid zoutoplossing doordrenkte gelfoam bovenop de blootgestelde dura mater te houden gehydrateerd (figuur 2D).
4. installatie van twee-foton (2P) Imaging venster
- De kleine stukjes spullen van gelfoam in de kloof tussen spieren en botten van de wervel, ook spullen van een dunne lijn van gelfoam tussen het ruggenmerg en vertebrale beenderen en vervolgens gebruik van weefsel Lijm lijm voor het afdichten van de omgeving van spier-bot. Wacht 5 minuten voor volledige droogheid (figuur 2E).
Opmerking: Deze stap wordt voorkomen effectief dat toekomstige bloeden in het venster en leakiness van onderdompeling oplossingen. - 4% agar met ddH2O in een magnetron bereiden. Nadat de agar volledig is opgelost, wachten tot het weer een tastbaar temperatuur. Vul een steriele injectiespuit 1 mL met agar oplossing en het pijp op de rand van het venster om te bouwen van een muur (2E figuur). De oplossing snel stolt en blijft flexibel om de lens of de doelstelling om vrij te bewegen.
- Als u klaar bent voor imaging, verwijder de gelfoam en plaats immersie vloeistof in het venster voor 2P imaging (figuur 2F). Breng het gestabiliseerde dier in de donkere kamer van 2-foton microscoop en plaats het venster 2P imaging direct onder de lens. Lager de lens zorgvuldig in het imaging venster.
5. injectie van eerste fluorescente kleurstof en basislijn Imaging
- Bereiden van 0,5 mL Rhodamine B isothiocyanaat-Dextran (4 mg/mL gemiddeld molecuulgewicht ~ 70kDa) in een zoutoplossing. Vul een steriele injectiespuit 1 mL met de oplossing en de spuit verbinden de eerder geïnstalleerde katheter.
Opmerking: Het voorbereiden van de fluorescente kleurstof oplossing voordat gebruik wordt aanbevolen. - De eerste kleurstof door zeer langzaam het indrukken van de spuit te injecteren (figuur 3B). Gebruik eerst het oculair te identificeren op het gebied van belang. Gebruiken een last gekoppeld apparaat (CCD) camera voor het verkrijgen van een helder-veld beeld van de oppervlakte bloedvat patronen bij lagere vergroting als een mijlpaal afbeelding. Overschakelen naar de scanmodus laser en open vervolgens de 2P denkbaar software voor het verzamelen van beide afbeeldingen en lijn-scan gegevens.
- Selecteer de juiste 2P laser excitatie golflengte, kracht en fluorescerende kanalen (rood voor eerste kleurstof) te koppelen aan de fluorophores gebruikt in het verbeelde weefsel, en vervolgens uitvoeren in vivo imaging (3E figuur). Houd het dier op een verwarming pad tijdens het hele proces.
6. C7 Contusive letsel met behulp van LISA apparaat
- Het uitvoeren van een C7 middellijn kneuzingen letsel met behulp van een apparaat van de Louisville letsel systeem apparaat (LISA) volgens een eerder gangbaar protocol25,26.
- Kortom, plaats het dier in het werkgebied van de LISA na kalibratie.
7. injectie van tweede fluorescente kleurstof en na letsel Imaging
- 0,5 mL fluoresceïne isothiocyanaat-dextran (4 mg/mL, gemiddeld molecuulgewicht ~ 70 kDa) in een zoutoplossing bereiden dezelfde zoals in 5.1. Vul de oplossing in een 1-mL steriele injectiespuit en verbinden met de eerder geïnstalleerde katheter.
- Overdracht van de gestabiliseerde dierlijke terug binnen de 2P Microscoop donkere kamer en herstellen via een image eenzelfde ruimte met het rode kanaal voor de eerste kleurstof en het groene kanaal voor de tweede kleurstof (cijfers 3D & G).
- Aan het einde van beeldvorming, laat de rat van het spinale stabilisatie-apparaat en schoon de agar muur.
8. dierlijke offer
- Na imaging, offeren de rat na de transcardial perfusie protocol27. Verzamelen van de monsters van het ruggenmerg en corrigeren in 4% PFA.
9. offlinegegevens analyse: Kwantificering van schip Diameters
- De afbeeldingsbestanden overbrengen in een workstation voor off-line analyse.
- ImageJ openen en selecteer "file" en kies vervolgens eerder ruwe gegevens opgeslagen en open de bijbehorende enkel installatiekopiebestand dat (figuur 4B).
- Kalibreer de afbeelding door het selecteren van "Analyseren" gevolgd door "Set schaal" (figuur 4C). De waarde in "Afstand in pixels" geplaatst wordt berekend met behulp van de vergelijking weergegeven in figuur 4A. De kalibratie van de optische lens 2-foton bepaalt de standaardwaarde in de vergelijking. De waarde van "opticalZoom" wordt aangetroffen in Excel Extensible Markup Languagefile (XML-bestand) die zijn gekoppeld aan de enkel installatiekopiebestand dat (figuur 4B).
- Tekenen van een lijn die loodrecht op de lengteas van het vaartuig (Figuur 4 d1 & E1) en selecteer "Analyseren" gevolgd door "Maatregel". De meting van de diameter van het vaartuig wordt weergegeven in het resultaatvenster (Figuur 4 d2 & E2). Herhaal 3 keer over het schip naar het verwerven van de gemiddelde waarde.
10. offline Data-analyse: Kwantificering van rode bloed cellen (RBC) snelheid
- De lijn-scan bestanden overbrengen naar het werkstation voor analyse.
- Start de ImageJ-software en selecteer "file" en kies vervolgens onbewerkte gegevens eerder hebt opgeslagen en alle bijbehorende lijn-scan bestanden met de extensie naam ".ome" openen.
- Open "Afbeelding" en selecteer "Stapels" gevolgd door "Afbeeldingen stapelen". Alle OME bestanden converteren naar een enkele afbeelding stapel TIFF-bestand.
- Start van Matlab software en klik op "Open", selecteer "LSPIV_parallel.m"-codebestand. Opmerking: Matlab code voor LS-PIV kan worden gedownload op https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18
- Selecteer in de volgende orders: "Run" > "Map wijzigen" > "slagader". Kies de afbeelding stapel TIFF-bestand gegenereerd in 10.3.
- Typ "Y" en druk op Enter.
- Plaatst een cursor aan de linker- en rechterkant van de afbeelding respectievelijk, en het programma wordt gestart voor het verwerken van de gegevens.
- Aan het eind van het programma, voer 2 waarden voor het berekenen van de definitieve lezen: "de conversiewaarde van de pixel_meter", en "scan-tijd conversiewaarde". Beide kunnen worden gevonden in het XML-bestand dat is gekoppeld met lijn-scan gegevens. De uiteindelijke waarde wordt uitgedrukt als het gemiddelde en de standaarddeviatie van de snelheid in de eenheden van millimeter per seconde (mm/s).
Representative Results
De methode is in staat om te controleren in vivo dynamische spinale vasculaire veranderingen in individuele vaartuigen pre- en post-traumatische SCI. Ten eerste, een katheter wordt geïnstalleerd via de externe halsslagader toegang voor latere fluorescente kleurstof injecties (figuur 1A-C, Figuur 3). In de tweede stap, wordt een gespecialiseerde apparatuur gebruikt voor het stabiliseren van de blootgestelde C5-C7 (Figuur 1 d-F, figuur 2A-B). Deze stabilisatie stap kunt elimineren ademhaling artefacten en gestage imaging bieden. Na laminectomie (figuur 2C) is de volgende stap de installatie van 2 P imaging venster over C5-C7 (figuur 2D-F). Minimaliseren van perifere weefsel rond de spinale imaging venster bloeden is van cruciaal belang voor succesvolle vasculaire imaging. De volgende stap is om te injecteren rhodamine-dextran fluorescente kleurstof (rood) via de eerder genoemde katheter met landmark en de kaart de vasculaire netwerk als de basislijn (figuur 3A-B, E). Na C7 middellijn contusive letsel met matige Ernst, FITC-dextran (groen) wordt ingevoerd op de gewenste post blessuretijd punten (figuur 3A & D). De schoonheid van de duo-kleur-methode is dat men kan nog steeds het detecteren van de vasculaire structuur met behulp van de tweede kleurstof, wanneer de eerste kleurstof reeds uit in parenchym vanwege blessure (Figuur 3 g gelekt).
Tijdens de vergadering van beeldvorming is het raadzaam om te houden van het dier op een verwarming pad om core lichaamstemperatuur na de inductie van de anesthesie.
Onze duo-kleur methode, kan de diameter en rode bloedcellen snelheid (de snelheid van de RBC) van individuele vaartuigen worden gemeten en berekend. Voor diameter, kan men ImageJ gebruiken voor het meten van het schip op zijn grootste diameter voor 3 herhalingen na kalibratie (Figuur 4). Voor snelheid, worden lijn-scan beelden gemeten met behulp van Matlab programma (MATLAB R2013a) voor het berekenen van de RBC snelheid (Figuur 5)18. Op basis van de morfologie, stroomsnelheid van bloed en de diameter van het vaartuig, de schepen kunnen worden ingedeeld in 2 categorieën: slagader en ader (zie tabel 1).
Figuur 1 . Halsslagader catheterisatie en wervelkolom stabilisatie.
(A) een schematische tekening voor het lokaliseren van de externe halsslagader. (B) de gespecialiseerde katheter is gemaakt van een naald 21-gauge. De tip was grond plat en gelaste met een stuk van 2 millimeter tip van een ander 21-gauge naald afgesneden. (C) een schematisch diagram van catheterisatie. De distale einde is afgebonden eerst, gevolgd door de proximale katheter stabilisatie, eindigend met de bevestiging van de naald samen met het schip (vaartuig afbinding, blauwe pijlpunten). (D) een beeld van de gemodificeerde wervelkolom stabilisator. Een venster van de C5-C7 vóór laminectomie (E) en na laminectomie en contusive SCI (F) wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Schematisch diagram van optische venster installatie stap voor stap.
(A) stap 1: bloot van de wervel door snijden huid en spieren langs de middellijn. (B) stap 2: de stabilisatie van de wervelkolom. (C) stap 3: laminectomie. (D) stap 4: behouden van het vocht van het ruggenmerg door het plaatsen van een stuk van zoutoplossing doordrenkte gelfoam. (E) stap 5: afdichting van de gaten met steriele gelfoam en vetbond. Na het drogen, is een laagje agar muur gebouwd op de rand van het venster. (F) stap 6: als u klaar bent voor imaging, verwijderen de gelfoam en plaats immersie vloeistof binnen 2 P imaging venster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . De in vivo duo-kleur methode procedure stapsgewijze.
De hele procedure bestaat uit 5 stappen (A). Na stap 1 en stap 2, een paar dextran tracers met een grootte van ongeveer 70 KDa zijn geïnjecteerd in de juiste volgorde op het etiket van het ruggenmerg therapieën voor (,B en C) en na contusive SCI (D). (E)-(G) vertegenwoordiger 2P beelden weergeven het ruggenmerg therapieën bij stap 3 tot en met stap 5. Witte pijlen wijzen naar eerste golf rode kleurstof lekkende gebieden (F en G), turquoise pijlpunten weergegeven tweede golf groene kleurstof lekkage (G). Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Verwerving en kwantificering van spinale vaartuig diameters.
Na de bereiding, één afbeeldingsbestanden worden verworven onder 2 P microscopie, samen met XML-bestanden van gekalibreerde waarden (B). (A) de vergelijking wordt weergegeven van de berekening van de "pixel per micron" op basis van waarden van de optische zoom. Na kalibratie in ImageJ (C), vaartuig diameters zijn gemeten op 3 punten langs de longitudinale as voordat (D1) en na (E1) letsel. (D2) en (E2) de gemeten waarden weergegeven. (F) kwantificering van schip diameters op basislijn en 30 min na letsel. Schaal bar = 50 µm. gegevens worden weergegeven als bedoel ± SD, *** p < 0.0001, tweezijdige gepaarde t-test.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Verwerving en kwantificering van spinale schip snelheid.
De dossiers van het beeld van de lijn-scan zijn verworven onder 2 P microscopie voor het berekenen van één vaartuig snelheden. (A) een voorbeeld van een geselecteerde vaartuig en de methode te beoordelen bloedvat RBC snelheid. (B) een arteriële voorbeeld van lijn-scan afbeelding en bijbehorend perceel bestand voor berekening van snelheid, evenals een voorbeeld van een ader (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Slagader | Ader | |
| Morfologie | Rechte, gladde, dikke vaatwand | Takken, ruwe randen |
| Stroomsnelheid van bloed | Snel | Traag maar varieert |
| Diameter | 30-80 µm | 100-250 µm |
Tabel 1: Criteria voordeidentificatie van schip typen
Discussion
Een uitdaging voor vasculaire studies na SCI is de technische beperking omdat traditionele technieken grotendeels beperkt tot de vasculaire structuur wijzigingen in postmortem monsters zijn. Deze roman in vivo imaging hierboven beschreven methode kunt dynamische meting van de bloedstroom en bijbehorende parameters (snelheid en vaartuig diameter) met 2 P-LSM in levende ratten. Hierdoor ook herhaalde onderzoek in de dezelfde sets van schepen op verschillende tijdstippen na contusive SCI. Vorige 2-foton microscopie beeldvormingstechnieken niet konden vangen de vasculaire structuren na trauma als gevolg van het weglekken van een enkele tracer. Onze duo-kleur ontwerp maakt dynamische vasculaire imaging voor traumatische modellen. De flexibiliteit van deze methode biedt bovendien een kans voor het genereren van een temporele-ruimtelijke Profiel van acute vasculaire wijzigingen na SCI.
Er zijn verschillende kritische stappen in onze in vivo duo-kleur beeldvorming methode. Ten eerste, het is fundamenteel voor de fysieke stabiliteit van ruggenmerg vóór time-lapse beeldvorming, met name de vermindering van ademhaling beweging artefact. We ontwierpen de vorm van spinale klemmen om de hoogte van de spinale wervel iets tijdens stabilisatie. Dus de beweging van het ruggenmerg correleren aan de ademhaling dier kunnen sterk verminderd (Figuur 1 d-F, 2B). Het is raadzaam om te controleren de stabiliteit van het ruggenmerg vóór het begin van elke imaging sessie. Als het ruggenmerg mislukt om stabiliteit te bereiken, moet de aanpassing plaatsvinden om de uitlijning en de krapte van ruggenmerg klemmen. Tweede, perifere weefsel (bot, spier laag en huid) bloeden in de beeldvorming venster kan het risico van besmetting van de weergave. Voor een goede beeldvorming sessie, moet gelfoam en weefsel Lijm lijm worden toegepast op het omringende weefsel voor doelmatige preventie. Ten derde hebben de fluorescente kleurstoffen die we kiezen een vergelijkbare grootte als albumine (66 kDa), dat de belangrijkste ultrahoog moleculair gewicht bloed plasma-eiwit is. Homeostatische voorwaarden bleven de kleurstoffen grotendeels binnen het schip vergelijkbaar als albumine28. Na de schade, de kleurstoffen doorgegeven via de verstoorde endothelial structuur en gelekt in het parenchym, waardoor een aanzienlijk verhoogde fluorescerende intensiteit in het perifeer gebied van de therapieën (figuur 3F-G). Daarnaast zijn er twee redenen waarom we ervoor externe halsslagader catheterisatie kiezen. Eerst, kan het een consequent toegankelijk route van levering bieden op elk moment van het experiment. Ten tweede, het kan worden gebruikt als een route voor toekomstige behandeling injectie.
Hoewel onze in vivo duo-kleur methode vermag verlenen van een nieuwe plek voor traumatische vasculaire beeldvorming studies, moeten sommige waarschuwingen met betrekking tot deze techniek worden aangepakt. Momenteel, deze techniek is ontworpen om te beoordelen van vasculaire veranderingen op 2 punten van de tijd (basislijn en 1 na blessuretijd punt), maar het is mogelijk om over te schakelen op meerdere tijdstippen als extra fluorescente kleurstoffen en kanalen beschikbaar zijn. Hoewel er verschillende studies met behulp van geïmplanteerde glazen venster voor chronische intravital imaging, geen enkel van hen basislijngegevens kunt aan op hetzelfde vaartuig na traumatisch letsel19,29,30, 31,-32. In tegenstelling tot deze studies is onze venster een neen-glazen venster. Dit is handig voor pre- en post letsel beeldvorming, maar het kan zijn uitdagend voor het herstel van het venster voor de lange termijn waarneming. Onze toekomstige onderzoek is bezig met de technische verbetering voor chronische imaging. Het vasculaire systeem is samengesteld uit verschillende typen van schip (slagader, veneuze en capillaire) en zijn allemaal verschillend in aspecten van morfologie en functie. Differentiatie tussen vaartuig typen tijdens imaging kon helpen om pesten uit een duidelijk patroon van vasculaire veranderingen. Het bovenstaande protocol is afhankelijk van de waarnemer die identificatie van de vaartuigen die op basis van morfologie en snelheid; echter kan een slagader-specifieke kleurstof eenvoudig worden toegevoegd aan het geven van een meer definitieve indeling tussen vaartuig typen33.
Deze techniek is niet alleen beperkt tot evaluaties op contusive en andere traumatische modellen, zoals crush letsel en de schade van de straling, maar ook op studies gericht op verstoring van de BSCB, zo goed als vasculaire permeabiliteit verandert. Naast SCI, kan worden gebruikt om de studie van de vasculaire wijzigingen na andere neurodegeneratieve ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en multiple sclerose (MS). Het zou bovendien overdraagbaar aan een transgene diermodel te bestuderen van de dynamische neurovasculaire interactie. Als een krachtige screening tool, konden toekomstige studies gebruiken de beeldvormende techniek die hier beschreven om te beoordelen van de effectiviteit van behandeling voor dwarslaesie.
Kortom, is in vivo duo-kleur methode een betrouwbare, real-time, in vivo benadering hulpmiddel voor beoordelen van dynamische vasculaire veranderingen, die ideaal is voor karakterisering van temporele-ruimtelijke vasculaire profiel en screening voor behandelingen verminderen van secundaire schade na SCI.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, verdienste Review Award I01 BX002356 van het US Department of Veterans Affairs, Craig H Neilsen Stichting 296749, Indiana ruggenmerg en hersenen verwonding Research Foundation ( ISCBIRF) van Indiana State Department of Health (019919), en Mari Hulman George Endowment fondsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
| Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
| Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
| Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
| Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
| Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
| Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
| Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
| Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
| Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
| Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
| Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
| Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
| micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
| 3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
| Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18" | LOOK | 786 | Can be from any vendor |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
| Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
| LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
| PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
| ImageJ | Image analysis software | ||
| Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |
References
- National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. , (2016).
- Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59 (4), 606-619 (2006).
- Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (1), 23-27 (2016).
- Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (10), 1678-1684 (2016).
- Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164 (3), 837-843 (1987).
- Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86 (3), 483-492 (1997).
- Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2 (3), 197-200 (1974).
- Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
- Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32 (2), 260-268 (1993).
- Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103 (1), 34-40 (1989).
- Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24 (3), 492-507 (2007).
- Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27 (4), 403-408 (2005).
- Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22 (3), 332-341 (2009).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4 (2), e22 (2006).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), e38590 (2012).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 84-94 (2002).
- Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
- Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220 (1), 9-22 (2009).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).
- Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
