एक साधारण कोशिका आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख रक्त में एन मिथाइल-डी-Aspartate (एनएमडीए) रिसेप्टर के खिलाफ Autoantibody का पता लगाने के लिए
Summary
हम ectopically एनएमडीए रिसेप्टर की NR1 उपइकाई मानव भ्रूण कोशिकाओं में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग (HEK293) प्रतिजन के रूप में व्यक्त करने के लिए एनएमडीए रिसेप्टर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ संदिग्ध रोगियों के रक्त में स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस. इस सरल विधि नैदानिक सेटिंग्स में स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए उपयुक्त हो सकता है ।
Abstract
विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर autoantibody की उपस्थिति प्रभावित रोगियों में विभिन्न neuropsychiatric लक्षण पैदा कर सकता है, विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस. रक्त या मस्तिष्कमेरु द्रव में एनएमडीए रिसेप्टर के खिलाफ विशिष्ट autoantibody का पता लगाने (सीएसएफ) इस हालत का सही निदान के लिए आवश्यक है. एनएमडीए रिसेप्टर एक आयन चैनल प्रोटीन जटिल है कि चार उपइकाईयों में शामिल है, सहित दो अनिवार्य एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई 1 (NR1) और एक या दो एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई 2a (NR2A), एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई 2 बी (NR2B), एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई 2c (NR2C), या एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई 2d (NR2D) । एंटी-एनएमडीए रिसेप्टर autoantibody के epitope को NR1 रिसेप्टर के एनएमडीए उपइकाई के extracellular एन-टर्मिनल डोमेन पर उपस्थित होने की सूचना मिली थी. इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए एक सरल सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख है कि एक स्क्रीनिंग परीक्षण के लिए रक्त में एनएमडीए रिसेप्टर की NR1 उपइकाई के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति का पता लगाने के नैदानिक और बुनियादी अनुसंधान की सुविधा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित करने के लिए है विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस.
Introduction
विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस एक नव मांयता प्राप्त रोग इकाई है कि सभी उंर के रोगियों में हो सकता है, और मुख्य रूप से महिला रोगियों को प्रभावित करता है1,2। यह इन्सेफेलाइटिस3के प्रारंभिक अज्ञात एटियलजि के साथ रोगियों के बीच सबसे अक्सर निदान इन्सेफेलाइटिस में से एक है । विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर इन्सेफेलाइटिस के साथ प्रभावित रोगियों आमतौर पर एक सिर दर्द या बुखार के prodromal लक्षण है, चेतना के स्तर को बदलने के त्वरित विकास और तीव्र neuropsychiatric लक्षण की एक किस्म के द्वारा पीछा किया, सहित आंदोलन, चिड़चिड़ापन , चिंता, अनिद्रा, मतिभ्रम, भ्रम, आक्रामकता, विचित्र व्यवहार, आंदोलन विषमता, स्वायत्त dysregulation, और बरामदगी हमलों4,5. इस हालत और immunotherapy के साथ समय पर उपचार के प्रारंभिक मांयता एक बेहतर परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है और भी प्रभावित रोगियों में पूर्ण वसूली6। इसलिए, यह सुझाव दिया है कि विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस तीव्र या नई शुरुआत मानसिक सुविधाओं के साथ पेश रोगियों के एक महत्वपूर्ण विभेदक निदान के रूप में माना जाना चाहिए7,8.
नैदानिक सुविधाओं के अलावा, रक्त या सीएसएफ में एनएमडीए रिसेप्टर के खिलाफ autoantibody का पता लगाने विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस के सही निदान के लिए आवश्यक है9. प्रतिरक्षा परीक्षण के अधिकांश विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर autoantibody का पता लगाने के लिए कुछ अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं10,11, और वहाँ केवल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल-स्क्रीनिंग के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख आधारित है विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर12एंटीबॉडी. इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए एक सरल घर में सेल-आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख है कि आसानी से प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा सकता विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर के नैदानिक अनुसंधान की सुविधा के लिए विकसित करने के लिए है स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस । एनएमडीए रिसेप्टर एक heterotetramer आयन चैनल प्रोटीन जटिल विशेष रूप से मस्तिष्क में व्यक्त की है. यह दो अनिवार्य NR1 उपइकाईयों से बना है, और NR2A, NR2B, NR2C, या NR2D13के एक या दो उपइकाईयों का संयोजन है । एक पिछले अध्ययन ने बताया कि मुख्य epitope एंटीबॉडी द्वारा लक्षित NR1 उपइकाई5के extracellular एन टर्मिनल डोमेन पर था. इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, हम मानव भ्रूण गुर्दे की उपकला कोशिका लाइन (HEK293) में ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ टैग एनएमडीए रिसेप्टर की मानवीय संयोजक NR1-यूनिट प्रोटीन व्यक्त करते हैं, और एक सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का पता लगाने के लिए विकसित विरोधी के आईजीजी वर्ग एनएमडीए रिसेप्टर रक्त में एंटीबॉडी.
Protocol
Representative Results
Discussion
वहां कई सेल आधारित प्रतिरक्षा परख रहे है एनएमडीए रिसेप्टर के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए स्क्रीन पर रहते है सेल सहित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख11, फिक्स्ड सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चांग गुंग मेडिकल फाउंडेशन (ग्रांट नंबर CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632, और CMRPG3E0633) ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
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