Summary
Vi uttryckte ectopically NR1-subenheten av NMDA-receptorn taggade med grönt fluorescerande protein i mänskliga embryonala celler (HEK293) som antigen att upptäcka autoantikroppar mot NMDA-receptorn i blodet hos patienter med misstänkt med autoimmun encefalit. Denna enkla metod kan vara lämplig vid screening i kliniska inställningar.
Abstract
Närvaron av anti-NMDA-receptorn autoantikroppar kan orsaka olika neuropsykiatriska symtom hos drabbade patienter, kallas anti-NMDA-receptorn autoimmun encefalit. Påvisande av specifika autoantikroppar mot NMDA receptorn i blod eller cerebrospinalvätska (CSF) är nödvändig för korrekt diagnos av detta tillstånd. Den NMDA-receptorn är en ion kanal protein komplex som innehåller fyra subenheter, inklusive två obligatoriska NMDA receptor delenhet 1 (NR1) och en eller två NMDA receptor subenhet 2A (NR2A), NMDA receptor subenhet 2B (NR2B), NMDA receptor subenhet 2C (NR2C), eller NMDA-receptorn subenhet 2D (NR2D). Epitop av anti-NMDA-receptorn autoantikropp rapporterades att närvara på extracellulära N-terminala domänen för den NR1-subenheten av NMDA-receptorn. Målet med denna studie är att utveckla en enkel cell-baserad immunofluorescens-test som kan användas som ett screeningtest för att upptäcka förekomsten av autoantikroppar mot NR1-subenheten av NMDA-receptorn i blodet för att underlätta klinisk och grundläggande forskning av anti-NMDA-receptorn autoimmun encefalit.
Introduction
Anti-NMDA-receptorn autoimmun encefalit är en nyligen erkänd sjukdom-enhet som kan förekomma hos patienter i alla åldrar, och påverkar huvudsakligen kvinnliga patienter1,2. Det är en av de vanligaste diagnostiserade encefalit bland patienter med inledande okänd etiologi av encefalit3. Patienter med anti-NMDA-receptorn encefalit vanligtvis har prodromala symtom på huvudvärk eller feber, följt av snabb utveckling av medvetande nivå förändring och en mängd akuta neuropsykiatriska symtom, inklusive agitation, irritabilitet , ångest, sömnlöshet, hallucinationer, vanföreställningar, aggression, bisarra beteenden, rörelse avvikelser, autonom dysreglering och beslag attacker4,5. Tidig sorterkännande av detta villkor och snabb behandling med immunterapi är viktiga för ett bättre resultat och även fullständig återhämtning i drabbade patienter6. Det föreslås därför att anti-NMDA-receptorn autoimmun encefalit bör betraktas som en viktig differentialdiagnos av patienter med akut eller nydebuterade psykotiska drag7,8.
Förutom kliniska funktioner är upptäckt av autoantikroppar mot NMDA receptorn i blodet eller CSF nödvändig för korrekt diagnos av anti-NMDA-receptorn autoimmun encefalit9. De flesta av de immunologiska testerna upptäcka anti-NMDA-receptorn autoantikroppar finns några forskning laboratorier10,11, och det finns endast en kommersiellt tillgänglig cellbaserade immunofluorescens test för screening av anti-NMDA-receptorn autoantikroppar12. Målet med denna studie är att utveckla en enkel in-house cellbaserade immunofluorescens-test som kan användas praktiskt i laboratoriet för att skärmen förekomsten av anti-NMDA-receptorn autoantikroppar att underlätta den kliniska forskningen av anti-NMDA-receptorn autoimmun encefalit. Den NMDA-receptorn är en heterotetramer ion kanal proteinkomplex specifikt uttryckt i hjärnan. Den är gjord av två obligatoriska NR1-subenheter och kombinationen av en eller två subenheter av NR2A, NR2B, NR2C eller NR2D13. En tidigare studie rapporterade att den huvudsakliga epitop riktade av antikroppar var på den extracellulära N-terminala domänen av NR1-subenheten5. Därför i detta protokoll, vi uttrycka mänskliga rekombinant NR1-subenheten proteinet av NMDA-receptorn taggade med grönt fluorescerande protein (GFP) i mänskliga embryonala njurar epitelial cell linje (HEK293), och utveckla en cell-baserad immunofluorescens test att upptäcka klassen IgG anti-NMDA-receptorn autoantikroppar i blodet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien var godkänd av den institutionella i styrelsen av Chang Gung Memorial Hospital på Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).
1. beredning av NR1-GFP uttryck plasmiden
- Blanda 10 ng av NR1-GFP plasmid med 100 µL av Escherichia coli behöriga celler stam DH5α i en steril 1,5 mL Centrifugera röret, Pipettera blandningen försiktigt upp och ner 4 - 6 gånger, och Inkubera röret på is i 20 min.
- Inkubera röret vid 42 ° C i 1 min i ett vattenbad, ta bort röret från vattenbadet, tillsätt 1 mL lysogeny buljong (LB) medium i röret och Inkubera röret vid 37 ° C i en inkubator med skakningar för 1 h.
- Sprida 50 µL av blandningen på en LB agarplatta som innehåller ampicillin (0,1 mg/mL) och inkubera LB agarplattan vid 37 ° C i en inkubator över natten.
- Plocka en enda koloni från övernattning LB agarplattan med hjälp av en steril spets, och snurra spetsen i en i en bakterieodling tub innehållande 5 mL LB medium och ampicillin (0,1 mg/mL). Inkubera röret vid 37 ° C i en inkubator med skakningar under natten.
- Alikvotens 3 mL övernattning bakteriella kulturen i en 500 mL-mätkolv som innehåller 250 mL steril LB medium och ampicillin (0,1 mg/mL). Inkubera kolven vid 37 ° C under skakning. Kontrollera regelbundet optiska tätheten (OD) av den bakteriella kulturen vid våglängd på 600 nm med en spektrometer tills OD600 når 0,6-1,0.
Obs: Blanda väl 800 µL av övernattning bakteriella kulturen med 200 µL glycerol att förbereda glycerol beståndet och lagra glycerol beståndet under-80 ° C för framtida bruk. - Förbereda NR1-GFP uttryck plasmid från 250 mL bakteriella kulturen
- Samla in cellerna genom centrifugering vid 6000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten bakterier i 10 mL resuspension buffert innehållande RNase A; Vortex grundligt tills ingen klump ses.
- Lägga till 10 mL lyseringsbuffert i bakteriesuspensionen försiktigt vänd blandningen 4 - 6 gånger och inkubera den lysate i rumstemperatur (RT) i 5 min.
- Tillsätt 10 mL före kyld nederbörd buffert till den lysate, vänd försiktigt blandningen 4 - 6 gånger.
- Häll den lysate in i pipan av en filterpatron med locket på; vänta 10 min vid RT.
- Ta bort locket från patronen outlet munstycket, infoga en kolv i kassetten och tryck försiktigt kolven. Samla de filtrerade lysate i en 50 mL tub.
- Tillsätt 2,5 mL egenutvecklade buffert från tillverkaren att de filtrerade lysate, blanda blandningen genom att vända tuben cirka 10 gånger och inkubera blandningen på is i 30 min.
- Applicera den filtrerade lysate blandningen till en filter-kolumn som var före jämviktas med 10 mL Jämviktstiden buffert. Låt kolonnen rinna av gravitationen.
- Tvätta kolonnen med 30 mL tvättbuffert två gånger, sedan eluera DNA från kolumnen med 15 mL eluering buffert.
- Lägga till 10,5 mL (0.7 volymer) isopropanol eluerade DNA bufferten, blanda väl och centrifugera blandningen vid 20 000 x g under 30 minuter vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten noggrant, tvätta DNA pelleten med 5 mL endotoxinfria 70% etanol en gång och centrifugera vid 20 000 x g i 10 min.
- Dekantera supernatanten, torka pelleten i 5-10 min i en kemisk huva och lös pelleten i 300-500 µL av endotoxinfria buffert.
- Bestämma plasmid koncentration genom att mäta upptaget av lösningen vid UV-260/280 nm med en spektrofotometer.
Obs: Förbereda uttryck plasmiden GFP använder samma protokoll.
2. transfection av HEK293 celler med NR1-GFP uttryck Plasmid
- Alikvotens 200 µL 2% gelatin lösning till varje väl av en 48-väl kultur plattan och inkubera plattan vid 37 ° C i minst 30 min.
- Aspirera gelatin lösningen från väl, och seed 5 x 104 HEK293 cellerna i 200 µL cellodlingsmedium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) i varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C i en fuktad inkubator levereras med 5% CO2 över natten.
Obs: Cellerna räknades med hjälp av en hemocytometer. - Nästa dag, ersätta förbrukade odlingssubstratet med 200 µL av färskt odlingssubstrat som innehåller 10% FBS per brunn.
- För varje enskilt väl, Förbered lösning A genom att blanda 100 ng av NR1-tGFP plasmid med 20 µL odlingsmedium och lösning B genom att blanda 0,8 µL transfection reagens med 20 µL odlingsmedium. Multiplicera antalet brunnar som behövs för att bereda den totala volymen för varje experiment.
- Förbereda lösning C genom att blanda lösning A och lösning B och inkubera blandningen på RT för 20-30 min.
- Alikvotens 40 µL lösning C till varje brunn innehållande de HEK293 cellerna, snurra plattan försiktigt och inkubera plattan vid 37 ° C i en fuktad inkubator levereras med 5% CO2 över natten.
- Kontrollera uttrycket av NR1-GFP rekombinant protein i de mottagande cellerna under fluorescerande Mikroskop med 40 X-200 X förstoring (excitation/utsläpp: 482/502 nm), och gå vidare till cellbaserade immunofluorescens analysen.
Obs: Transfect uttryck plasmiden GFP i HEK293 celler använder samma protokoll.
3. cellbaserade immunofluorescens Assay
- Aspirera använt medlet från brunnarna, sedan tvätta varje brunn med 200 µL av fosfat buffrad saltlösning (PBS) tre gånger.
- Tillsätt 200 µL av 4% PARAFORMALDEHYD lösning till varje brunn; Inkubera plattan på RT för 15 min.
- Aspirera PARAFORMALDEHYD lösningen från brunnarna och tvätta varje brunn med 200 µL av PBS tre gånger.
- Tillsätt 200 µL 10% lättmjölk i PBST (0,1% Tween-20 i PBS) lösning till varje brunn, och inkubera plattan på RT för 1 h med milda skakningar.
- Aspirera 10% skumma mjölken i PBST lösning från brunnen och sedan Tvätta brunnarna med 200 µL PBST en gång.
- Inkubera brunnarna med utspädda plasma (1: 100 i PBST) som den primära antikroppen med varsam skakning på RT för 1 h.
Obs: Plasma framställs av blod från patienter som misstänks ha autoimmun encefalit. - Sug upp den utspädda plasman från brunnarna och tvätta varje brunn med 200 µL PBST tre gånger.
- Tillsätt 200 µL av geten anti-humant IgG konjugerat med Alexa Fluor 594 (1:1, 000 utspädning i PBST) till varje brunn och inkubera kultur plattan på RT med milda skakningar för 1 h.
- Aspirera den get anti-humant IgG konjugerat med Alexa Fluor 594 lösningen och tvätta varje brunn med 200 µL PBST tre gånger.
- Tillsätt 100 µL glycerol lösning (50% glycerol i PBS och 1:100,000 av 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI)) till varje brunn.
- Observera och bild cellerna i fluorescerande Mikroskop med en 10 X okular, och 4 X, 10 X och 20 X mål.
Obs: Använda rätt filter för varje färgämne: för NR1-GFP (excitation/utsläpp = 482/502 nm), för Alexa Fluor 594 (excitation/utsläpp = 561/594 nm), för DAPI (excitation/utsläpp = 358/461 nm). Genomföra den negativa kontrollen använder de HEK-celler som uttrycker GFP på samma sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I genomsnitt kunde vi hämta 200-300 µg endotoxinfria uttryck plasmid NR1-GFP och god Jordbrukarsed från 250 mL bakterieodling följa procedurerna som beskrivs i avsnitt 1 i protokollet. Ett belopp på 100 ng/brunn av uttrycket plasmiden användes för transfection HEK293 celler odlade i 48-väl plattan som beskrivs i avsnitt 2 i protokollet. 24-30 h efter transfection, cellerna uttryckte den NR1-GFP och god Jordbrukarsed rekombinanta proteiner kunde detekteras under fluorescerande Mikroskop. Figur 1A visar bilden av vara värdcellerna som uttrycker den NR1-GFP, medan figur 1 d visar de celler som uttrycker GFP. Grön signal kan användas som en kvalitetskontrollanten analysens: cirka 30% av cellerna hade gröna signaler under fluorescerande mikroskopet. Figur 1A och 1 D visar bilden av vara värdcellerna som uttrycker den NR1-GFP. Grön signal kan användas som en kvalitetskontrollanten analysens: cirka 30% av cellerna hade gröna signaler under fluorescerande mikroskopet. De celler som uttrycker NR1-GFP användes för att undersöka förekomsten av anti-NMDA-receptorn autoantikroppar i humanplasma provet.
I cell-baserad immunofluorescens-analysen som beskrivs i avsnitt 3 i protokollet, styra positivt prov (erhållits från en kommersiell källa, se Tabell för material) lades till poolad plasma i 1:10 utspädning enligt den tillverkarens instruktioner. Poolad plasma var beredd från 5 vuxna hannar och 5 vuxna honor. Figur 1B är Alexa Fluor-594 bilden av positivt kontrollprov efter inkubation med celler uttrycket NR1-GFP, medan figur 1E är Alexa Fluor-594 bilden av positivt kontrollprov efter inkubation med celler uttrycket god Jordbrukarsed. Figur 1 c är den sammanlagda bilden av figur 1A och figur 1B: det finns betydande överlappningar av gröna signaler och röda signaler i samma cell, som visar samtidig localizationen av NR1-GFP och antikroppar mot NR1-subenheten av NMDA receptorn (pilar). Ett plasmaprov som visar större än 30% överlappning av gröna och röda signaler kommer att tolkas som positivt i detta fall. Figur 1F är sammanslagna bilden från figur 1 d och figur 1E som fungerar som den negativa kontrollen för figur 1 c. Den svaga röda färgen är bakgrunden fluorescens av Alexa Fluor-594 bilden. Det finns liten överlappning av gröna och röda signaler, som visar ingen bindning av anti-NMDA-receptorn autoantikroppar mot rekombinant protein.
Under etableringen av de experimentella rutiner observerade vi en låg signal-brus-förhållande av Alexa Fluor-594 bilden när de plasma proverna testades. Försökte vi att optimera förhållandet signal-brus genom att bedriva en seriell utspädning av plasma formulär 1:10, 1:50, 1: 100, och 1: 200 och testa olika koncentrationer av Alex Fluor-594 märkt sekundär antikropp från 1: 500 till 1:2, 000. Vi fann att 1: 100 utspädning av plasma och 1:1,000 eller 1:2,000 utspädning av den Alexa Fluor-594 var de optimala förutsättningarna för tolkningen av data.
Figur 1: representativa bilder av cellbaserade immunofluorescens analysen att upptäcka anti-NMDA-receptorn autoantikropp. (A) bild av HEK293 celler som uttrycker NR1-GFP. (B) The Alexa Fluor-594 bild tagen från samma fält a efter inkubation med positiv kontrollprovet. Röd signal indikerar bindningen av de anti-NMDA-receptorn autoantikroppar mot den NR1 uttryckt i HEK293 celler. (C) den sammanlagda bilden av A och B. Gul färg visar samtidig localizationen av NR1 (grön signal) och de anti-NMDA-receptorn autoantikroppar (röd signal). Pilarna visar exempel på några framträdande celler visar samtidig lokalisering av NR1-GFP och anti-NMDA receptor autoantikroppar. (D) bilden av HEK293 celler uttrycker NR1-GFP. (E) The Alexa Fluor-594 bild tagen från samma fält d efter inkubation med positiv kontrollprovet. Svag röd signal indikerar bakgrundsljud av Alexa Fluor-594 bild. (F) den sammanlagda bilden av D och E. Denna bild fungerar som en negativ kontroll, eftersom det finns lite gul signal observerats. Negativ kontroll bilden visar den specifika bindningen av den anti-NMDA receptor antikroppar mot den NR1-GFP i analysen. Alla bilder togs under 10 X eye lins och 20 X lins-objektiv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera cellbaserade immunologiska analyser att skärmen förekomsten av autoantikroppar mot NMDA-receptorn som rapporterats i litteraturen, inklusive levande cell-baserad immunofluorescens assay11, fast cellbaserade immunofluorescens assay9 , och flöde flödescytometri-baserade assay14. Levande cell-baserad immunofluorescens analysen bör utföras strax efter beredning av celler som ectopically uttrycker proteinet NR1, medan flödet flödescytometri-baserade analysen kräver speciell utrustning och utbildad personal. En fast cellbaserade immunofluorescens-analys är ett mer praktiskt test som kan utföras för kliniska inställningar. Många studier används därför kommersiella indirekta fast cellbaserade immunofluorescens analysen till skärmen anti-NMDA-receptorn autoantikroppar i serum och CSF exemplar12,15. De kit som används (se tabellen i material) innehåller fasta HEK293 celler som ectopically uttrycker den rekombinanta NR1-subenheten av NMDA-receptorn. Analysen har utvärderats för att har utmärkta prestanda i att upptäcka den anti-NMDA-receptorn IgG-antikroppen i serum och CSF exemplar12. I våra protokoll använde vi samma tillvägagångssätt som rekommenderas av tillverkaren och kit, förutom att vi använder NR1-GFP uttryck plasmid. NR1-GFP proteinet kan användas för att övervaka transfection effektivitet och fördelning av NR1 protein i varje experiment. Det kan därför användas som en kvalitetssäkring av analysen.
Transfection effektivitet NR1-GFP uttryck plasmid i HEK293 celler är cirka 30% i protokollet presenteras här, vilket är tillräckligt för immunofluorescens analysen. Vi hittade dock att intensiteten hos den gröna fluorescensen inte är jämnt fördelad bland de transfekterade cellerna, vilket tyder på skillnader i effektiviteten av transfection eller uttryck möjligheten för enskilda celler. Varierande uttryck rekombinant NR1-GFP i olika celler orsaka heterogen intensitet när gröna bilden slogs samman med den röda bilden av Alexa Fluor 594. Den get anti-humant IgG konjugerat med Alexa Fluor 594 användes som sekundära antikroppen för att upptäcka förekomsten av mänskliga autoantikropp IgG klass. Vi hittade att ljusstyrkan på Alexa Fluor 594 är relativt svagare än för grönt fluorescerande protein. Försökte vi att optimera signal intensiteten genom att öka koncentrationen av den anti-humant IgG konjugerat med Alex Fluor 594, men bakgrunden ökade också. Därför är den optimala koncentrationen för den anti-humant IgG konjugerat med Alex Fluor 594 1:1,000 i detta laboratorium. Dessutom några plasmaprover hade en signifikant hög bakgrund signal i Alexa Fluor 594 bilden. Olika spädningar av plasma testades och det konstaterades att en minimal spädning 1: 100 är nödvändigt att få en ren bakgrund för de flesta av proverna. Därför rekommenderar vi 1: 100 utspädning av plasma som standard steg i detta protokoll. Jämfört med de andra cellbaserade analyser som kan upptäcka serumprovet i 1:10 och 1:20 utspädning av blod prov11,16, har detta nuvarande protokoll inte tillräckligt känslighet att upptäcka låg titer anti-NMDA-receptorn autoantikroppar, vilket är en begränsning av protokollet.
Det nuvarande protokollet är en fast cellbaserade immunofluorescens analys. Kultur plattan kan lagras i 4 ° C kylskåp efter fixering för senare användning för upp till 1 månad, jämfört med den levande cell-baserad analys som inte kan lagras under lång tid. Men proteinet NR1 kommer denatureras och förlorar sin naturliga konformation under förfarandet för fixering, som kan påverka konformation av den epitop som binder till de anti-NMDA-receptorn autoantikroppar. Vissa studier antog därför levande cell-baserat immunofluorescene11,17. Våra protokoll kan alternativt ändras för att bli en levande cell-baserad immunofluorescens analysen att bevara naturliga konformation av proteinet NR1, om vi Inkubera provet plasma med levande celler först och fixa cellerna senare. Således finns det flexibilitet i protokollet att tillgodose behovet av experimentet.
Den NMDA-receptorn är en heterotetramer komplexa protein bestående av NR1, NR2A, NR2B, NR2C och NR2D. Det nuvarande protokollet var utformad för att upptäcka den IgG klassen av autoantikroppar mot NR1-subenheten av NMDA-receptorn. Protokollet kan också ändras för att upptäcka olika isotyper autoantikroppar, så länge de anti-humant IgG sekundära antikropparna ersätts av andra specifika klassen av sekundära antikroppar. Dessutom kan det nuvarande protokollet ändras för att upptäcka förekomsten av autoantikroppar mot NR2A, NR2B, NR2C och NR2D, om NR1-GFP uttryck plasmiden ersätts med motsvarande uttryck plasmiden, respektive.
I detta protokoll använde vi en plasma prov istället för serum, eftersom vi rutinmässigt samla blodprov med antikoagulantia för olika studier, men protokollet kan gälla serum eller CSF exemplar. Antikroppnivåns på autoantikroppar i plasma kan kvantifieras genom seriell utspädning av provet. I laboratoriet testade vi också den afrikanska green monkey njure fibroblast-liknande cellinje (COS1) som de mottagande cellerna använder samma protokoll. Resultaten är desamma som de som använder HEK293 cellerna, förutom att de COS1 cellerna har en något lägre transfection effektivitet än de HEK293 cellerna.
För att fastställa förekomsten av de anti-NMDA-receptorn autoantikroppar, föreslås det att ytterligare experiment såsom immunohistokemi assay använder gnagare hjärnan vävnader och immuncytokemi använder primära odlade gnagare nervceller vara utfört5 ,9. Det nuvarande protokollet kan därför endast betraktas som ett screening-test. Även om dess experimentella giltighet verifierades med det positiva kontrollprovet i denna studie, känslighet och specificitet av denna analys i kliniska inställningar måste fastställas i framtiden studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Chang Gung medicinska stiftelsen (licensnummer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 och CMRPG3E0633).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
