एंटीबॉडी आधारित दवाओं भड़काऊ रोगों के उपचार के लिए क्रांति की है । विशिष्ट लक्ष्यों पर प्रत्यक्ष प्रभाव होने के अलावा, एंटीबॉडी विरोधी भड़काऊ बनने के लिए मैक्रोफेज सक्रिय कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे विरोधी भड़काऊ macrophage सक्रियण इन विट्रो में मूल्यांकन किया जा सकता है, माउस अस्थि मज्जा मैक्रोफेज का उपयोग कर, और vivo में, पेरिटोनियल मैक्रोफेज का उपयोग कर ।
मैक्रोफेज phagocytic जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं है, जो रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को आरंभ करने और चिकित्सा और ऊतक reवेश्यावृत्ति के लिए योगदान कर रहे हैं । मैक्रोफेज भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को बंद करने में समान रूप से महत्वपूर्ण हैं । हमें पता चला है कि नसों में immunoglobulin (IVIg) के साथ उत्तेजित मैक्रोफेज विरोधी भड़काऊ cytokine की उच्च मात्रा का उत्पादन कर सकते हैं, interleukin 10 (IL-10), और बैक्टीरियल साइटोकिंस के जवाब में समर्थक भड़काऊ lipopolysaccharides के निम्न स्तर ( एलपीएस) । IVIg एक polyvalent एंटीबॉडी है, मुख्यतः immunoglobulin जी एस (IgGs), १,००० से अधिक रक्त दाताओं के प्लाज्मा से परित । यह प्रतिरक्षा की कमी के साथ रोगियों में एंटीबॉडी के पूरक या स्व-प्रतिरक्षित या भड़काऊ स्थितियों के साथ रोगियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को दबाने के लिए प्रयोग किया जाता है । Infliximab, एक चिकित्सीय विरोधी ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) एंटीबॉडी, भी मैक्रोफेज को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है IL-10 भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में उत्पादन । IVIg और अन्य एंटीबॉडी आधारित macrophage सक्रियण पर उनके प्रभाव का निर्धारण करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है । इस कागज व्युत्पत्ति, उत्तेजना के लिए तरीकों का वर्णन है, और murine अस्थि मज्जा का आकलन इन विट्रो में एंटीबॉडी द्वारा सक्रिय मैक्रोफेज और murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज vivo मेंएंटीबॉडी के साथ सक्रिय है । अंत में, हम पश्चिमी सोख्ता के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए विशिष्ट कोशिका विरोधी भड़काऊ macrophage गतिविधि के लिए संकेत मार्ग का योगदान निर्धारित करते हैं । इन प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, विरोधी भड़काऊ macrophage सक्रियण पर एक विशिष्ट प्रोटीन (ओं) के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए । इन तकनीकों का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है कि क्या विशिष्ट मैक्रोफेज एक IL-10-उत्पादन विरोधी भड़काऊ सक्रियकरण राज्य है कि vivo मेंभड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम कर देता है बदलने के द्वारा कार्य कर सकते हैं । यह चूहों में रोग मॉडल के दौरान macrophage सक्रियण की प्रभावकारिता में सक्रियकरण की भूमिका के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, और लोगों में कार्रवाई की एक संभावित नए तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । इसके विपरीत, इस विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग के खिलाफ सावधानी मई आधारित है संक्रामक रोग के इलाज के लिए, विशेष रूप से अगर मैक्रोफेज कि संक्रमण के खिलाफ मेजबान रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ।
मैक्रोफेज जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं, जो संक्रमण या चोट करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में कई भूमिका निभा रहे हैं । मैक्रोफेज संक्रमण या ऊतक क्षति के लिए एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत के लिए जिंमेदार हैं, भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोकने, और हीलिंग प्रतिक्रिया1को बढ़ावा देने के । तीन बेहतरीन अध्ययन macrophage सक्रियण राज्यों के उदाहरण हैं: 1) मैक्रोफेज इंटरफेरॉन गामा (IFNγ) और बैक्टीरियल lipopolysaccharide (एलपीएस), नामित एम (IFNγ + एलपीएस), जो भड़काऊ प्रतिक्रिया में योगदान के साथ इलाज; 2) मैक्रोफेज interleukin 4 के साथ उत्तेजित (il-4), एम (il-4), जो चिकित्सा प्रतिक्रिया के साथ जुड़े रहे हैं; 3) मैक्रोफेज प्रतिरक्षा परिसरों (आईसी) और एलपीएस, एम (आईसी + एलपीएस) है, जो बंद भड़काऊ प्रतिक्रिया2,3बारी करने की क्षमता है के साथ उत्तेजित । एम (आईसी + एलपीएस) एम (IL-4) घाव भरने मैक्रोफेज से अलग हैं, और एंजाइम arginase (Arg-1) या FIZZ14व्यक्त नहीं करते । इन विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज के लिए सबसे अच्छा मार्कर उनके cytokine उत्पादन है5। मैक्रोफेज स्वास्थ्य को बनाए रखने में कई भूमिकाएं हैं, लेकिन यह भी भड़काऊ रोगों और कैंसर के लिए योगदान3। इस वजह से, मैक्रोफेज रोगों की एक विस्तृत विविधता के उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य हैं । यह उनके सक्रियकरण राज्य पर एंटीबॉडी के प्रभाव की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है रोग के लिए macrophage आधारित उपचार विकसित करना ।
इस कागज का ध्यान murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMDMs) और पेरिटोनियल मैक्रोफेज के उपयोग पर है इन विट्रो में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं पर एंटीबॉडी दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए और vivo में। हाल ही में, वहां कई macrophage सक्रियकरण6,7,8पर एंटीबॉडी के प्रभाव दिखा अध्ययन किया गया है । मैक्रोफेज सह प्रतिरक्षा परिसरों के साथ सक्रिय है, जो एंटीबॉडी एक प्रतिजन के साथ जटिल कर रहे हैं, और एलपीएस, एक सामान्य रूप से भड़काऊ उत्तेजना, विरोधी भड़काऊ cytokine के बहुत उच्च स्तर का उत्पादन, आईएल-10, और समर्थक भड़काऊ cytokine के बहुत निम्न स्तर, interleukin 12 (IL-12)9. इसके अलावा, infliximab, TNFα के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, काम करने के लिए, भाग में पाया गया है, विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज के माध्यम से अपने टुकड़ा सघन (एफसी) क्षेत्र7के माध्यम से उत्प्रेरण । हमने बताया है कि IVIg + एलपीएस विरोधी भड़काऊ macrophage सक्रियण कि एम के समान है (आईसी + एलपीएस), जिसमें सह उत्तेजित मैक्रोफेज की बड़ी मात्रा में उत्पादन के आईएल-10 और कम मात्रा में समर्थक भड़काऊ cytokine उपइकाई Interleukin 12 या 23 p40 ( IL-12/23p40), interleukin-6 (il-6), और TNF8। IVIg एक polyclonal एंटीबॉडी के शामिल दवा है, मुख्य रूप से आईजीजी, जो १,००० से अधिक दाताओं10के खून से परित किया गया है । यह इस तरह के अज्ञातहेतुक थ्रोम्बोसाइटोपेनिक purpura और जीर्ण demyelinating के रूप में प्रतिरक्षा रोगों, की एक विस्तृत विविधता का इलाज किया जाता है, लेकिन कार्रवाई के अपने तंत्र को पूरी तरह से समझ में नहीं है11. macrophage सक्रियण पर एंटीबॉडी आधारित दवाओं के प्रभाव यहां वर्णित तरीकों का उपयोग कर आकलन किया जा सकता है ।
macrophage सक्रियण पर विशिष्ट वितर्कों के प्रभावों का BMDMs और पेरिटोनियल मैक्रोफेज में परीक्षण किया जा सकता है. इन macrophage स्रोतों का उपयोग प्राथमिक कक्षों के मूल्यांकन को अनुमति देता है । संस्कृतिपूर्ण प्राथमिक कोशिकाओं पर एंटीबॉडी के प्रारंभिक परीक्षण कम समय और अन्य समय लेने वाले और महंगे रोग मॉडल की तुलना में मौद्रिक निवेश की आवश्यकता है । vivo मेंएक स्वस्थ माउस में एक दवा इंजेक्शन द्वारा, और कोशिकाओं को अलग करने और उन्हें पूर्व vivoका विश्लेषण, एक अगर अध्ययन के साथ कि क्या उपचार का आकलन करने के लिए वारंट कर सकते हैं कि macrophage सक्रियण रोग मॉडल में प्रभावित करता है.
कुछ अध्ययनों के साथ इन विट्रो में macrophage सक्रियण पर जीवविज्ञान चिकित्सा के प्रभाव का परीक्षण और vivo में सीधे, हमारी तकनीक वैकल्पिक तकनीकों पर एक लाभ प्रदान करते हैं । मौजूदा तकनीकों में मिश्रित कोशिका आबादी पर जीवविज्ञान दवा प्रभाव का परीक्षण शामिल है इन विट्रोमें infliximab के प्रभाव के रूप में एक मिश्रित लिम्फोसाइट प्रतिक्रिया (एमएलआर) या परिधीय रक्त मैक्रोफेज कोशिकाओं में मानव mononuclear पर IVIg, जहां प्रभाव किसी विशिष्ट कक्ष प्रकार को7,12के लिए एट्रिब्यूट नहीं किया जा सकता । BMDMs और पेरिटोनियल मैक्रोफेज का उपयोग कर इस तरह के कच्चे 264.7 कोशिकाओं है, जो समर्थक भड़काऊ cytokine, IL-12, एलपीएस8,13के जवाब में उत्पादन नहीं है के रूप में सेल लाइनों, का उपयोग करने पर लाभप्रद है । macrophage प्रतिक्रियाओं पर एक एंटीबॉडी आधारित दवा के प्रभाव का परीक्षण पूर्व vivo लाभ है क्योंकि cytokine प्रतिक्रियाओं को सीधे मैक्रोफेज के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, बजाय macrophage प्रतिक्रियाओं को मापने से सीरम cytokine स्तर14 . BMDMs और पेरिटोनियल मैक्रोफेज और व्युत्पंन किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से अलग विरोधी भड़काऊ macrophage सक्रियण में एक प्रोटीन की विशिष्ट भूमिका निर्धारित करने के लिए । उदाहरण के लिए, हम Il10 आपुर्ति(-/-) BMDMs का उपयोग किया है कि समर्थक भड़काऊ cytokine उत्पादन के IVIg प्रेरित कमी IL-108पर आंशिक रूप से निर्भर है प्रदर्शित करने के लिए । कार्रवाई की एक दवा तंत्र पश्चिमी सोख्ता, जहां विशिष्ट प्रोटीन और संकेतन घटनाओं की भूमिका निर्धारित किया जा सकता है का उपयोग कर जांच की जा सकती है । मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) BMDMs या पेरिटोनियल मैक्रोफेज पर किया जा सकता है जीन अभिव्यक्ति के पैटर्न दिखाने के लिए कि एंटीबॉडी सक्रियण से परिणाम । चूहों में रोग मॉडल भड़काऊ आंत्र रोग, रुमेटी गठिया, और कैंसर की तरह रोगों के लिए मॉडलों में एंटीबॉडी आधारित जैविक उपचारों की संभावित प्रभावकारिता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं15,16, 17. हालांकि, यहां बताई गई तकनीकों से यह पता लगाने के लिए कि वे विरोधी भड़काऊ macrophage गतिविधि पैदा कर इन तर्कों की कार्रवाई के तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान करेगा ।
Macrophage सक्रियण राज्य ऊतक homeostasis और रोग22दोनों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । मैक्रोफेज अलग हो सकता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अतिव्यापी सक्रियकरण राज्यों, उनके microenvironment3में cu…
The authors have nothing to disclose.
लालकृष्ण ब्रिटेन के कोलंबिया विश्वविद्यालय के प्राप्तकर्ता 4 साल फैलोशिप (4YF) स्नातक छात्र पुरस्कार है । L.M.S. के एक कनाडा एसोसिएशन के प्राप्तकर्ता है गैस्ट्रोएंटरोलॉजी/Crohn ‘ s और कोलाइटिस कनाडा/CIHR नए अंवेषक वेतन पुरस्कार और स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए माइकल स्मिथ फाउंडेशन के एक बायोमेडिकल विद्वान है । यह काम कनाडा के रक्त सेवाओं से एक परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित था, कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान के संस्थानों के सहयोग से (अनुदान # CIHR2016-LS) ।
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
Scale | Mettler | PE 3000 |