Summary
Antistoff-baserte narkotika har revolusjonert behandling for akutt. I tillegg til å ha direkte virkninger på konkrete mål, kan antistoffer aktivere makrofager å bli anti-inflammatorisk. Denne protokollen beskriver hvordan anti-inflammatorisk macrophage aktivisering kan vurderes i vitro, bruke musen benmarg makrofager og i vivo, bruker peritoneal makrofager.
Abstract
Makrofager er phagocytic medfødte immunceller, som starte immunreaksjoner mot patogener og bidra til healing og vev hvile. Makrofager er like viktig i å slå av inflammatoriske svar. Vi har vist at makrofager stimulert med intravenøs immunglobulin (IVIg) kan produsere store mengder anti-inflammatorisk cytokin, interleukin 10 (IL-10) og lave nivåer av pro-inflammatoriske cytokiner svar på bakteriell lipopolysaccharides ( LPS). IVIg er et polyvalent antistoff, hovedsakelig immunglobulin Gs (IgGs), samlet fra plasma av mer enn 1000 blodgivere. Det brukes til å supplere antistoffer hos pasienter med immun mankoen eller undertrykke immunreaksjoner hos pasienter med autoimmune eller inflammatoriske tilstander. Infliximab, en terapeutisk anti-svulst necrosis faktor alpha (TNFα) antistoff, har også vært vist å aktivere makrofager å produsere IL-10 Svar på inflammatorisk stimuli. IVIg og andre antistoff-baserte biologiske kan testes for å finne deres effekter på macrophage aktivisering. Dette dokumentet beskriver metodene for avledning, stimulering og vurdering av murine benmarg makrofager aktiveres av antistoffer i vitro og murine peritoneal makrofager aktiveres med antistoffer i vivo. Til slutt, viser vi bruk av vestlige blotting for å finne ut bidrag av bestemt celle signalnettverk trasé til anti-inflammatorisk macrophage aktivitet. Disse protokollene kan brukes med genmodifiserte mus, for å fastslå effekten av en bestemt protein(s) på anti-inflammatorisk macrophage aktivisering. Disse teknikkene kan også brukes til å vurdere om bestemte biologiske kan handle ved å endre makrofager til en IL-10-produserende antiinflammatoriske aktivisering situasjon som reduserer inflammatorisk svar i vivo. Dette kan gi informasjon om rollen til macrophage aktivering i effekten av biologiske under sykdom modeller i mus og gi innsikt i en potensiell ny virkningsmekanisme i mennesker. Derimot kan dette forsiktig mot bruk av spesifikke antistoffer-baserte biologiske å behandle smittsomme sykdommer, spesielt hvis makrofager spille en viktig rolle i vert forsvar mot at infeksjon.
Introduction
Makrofager er medfødte immunceller, som spiller flere roller i immunforsvaret infeksjon eller skade. Makrofager er ansvarlig for igangsetting en immunrespons på infeksjon eller vev skade stoppe inflammatorisk respons og fremmer healing respons1. Eksempler på de tre beste studerte macrophage aktivisering statene er: 1) makrofager behandles med interferon-gamma (IFNγ) og bakteriell lipopolysakkarid (LPS), utpekt M (IFNγ + LPS), som bidrar til betennelsesreaksjon; 2) makrofager stimulert med interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), som er forbundet med healing respons; 3) makrofager stimulert med immun komplekser (IC) og LPS, M (IC + LPS), som har muligheten til å deaktivere betennelsesreaksjon2,3. M (IC + LPS) er atskilt fra M(IL-4) sårheling makrofager og uttrykke ikke enzym arginase (Arg-1) eller FIZZ14. Beste indikator for disse anti-inflammatorisk makrofager er deres cytokin produksjon5. Makrofager har flere roller i å opprettholde helse, men også bidra til inflammatoriske sykdommer og kreft3. Derfor er makrofager en nøkkel terapeutisk mål for behandling av en rekke sykdommer. Det er viktig å undersøke effekten av antistoffer på deres aktivisering begrunne å utvikle macrophage-baserte behandlinger for sykdom.
Fokus for denne utredningen er om bruk av murine benmarg avledet makrofager (BMDMs) og peritoneal makrofager å teste effekten av antistoff narkotika på inflammatorisk svar i vitro og i vivo. Nylig har det vært flere undersøkelser viser effekten av antistoffer macrophage aktivisering6,7,8. Makrofager co aktiveres med immun komplekser, som antistoffer kompleksbundet med et antigen og LPS, en normalt inflammatorisk stimulans, produsere svært høye nivåer av anti-inflammatorisk cytokin, IL-10 og svært lave nivåer av pro-inflammatoriske cytokin, interleukin 12 (IL-12)9. I tillegg, infliximab, et monoklonalt antistoff mot TNFα, har blitt funnet for å arbeide, delvis ved å fremkalle anti-inflammatorisk makrofager gjennom sin fragment crystallizable (Fc) region7. Vi har rapportert at IVIg + LPS føre anti-inflammatorisk macrophage aktivisering som ligner M (IC + LPS), hvor co stimulert makrofager produsere store mengder IL-10 og små mengder av pro-inflammatoriske cytokin delenhet Interleukin 12 eller 23 p40 ( Il-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) og TNF8. IVIg er et stoff består av polyklonale antistoffer, hovedsakelig IgG, som har blitt samlet fra blodet av mer enn 1000 givere10. Den brukes til å behandle en rekke immunologiske sykdommer, som idiopatisk thrombocytopenic purpura og kronisk demyeliniserende Polynevropati, men dens virkningsmekanismen er ikke helt forstått11. Effekten av antistoff basert narkotika på macrophage aktivisering kan vurderes ved hjelp av metodene beskrevet heri.
Effekten av bestemte biologiske på macrophage aktivisering kan testes i BMDMs og peritoneal makrofager. Med disse macrophage kilder tillater vurdering av primære celler. Innledende testing av antistoffer på kulturperler primære celler krever mindre tid og investering penge enn andre tidkrevende og kostbar sykdom modeller. Sprøytebruk i en sunn musen i vivo, og isolere cellene og analysere dem ex vivo, kan en finne ut hvis studier er garantert for å vurdere om behandling med biologiske påvirker macrophage aktivering i sykdom modeller.
Noen studier teste effekten av biologiske terapier på macrophage aktivisering i vitro og i vivo direkte, gir våre teknikker en fordel over alternative teknikker. Gjeldende teknikker involvere testing biologiske stoffet effekter på mikset-celle populasjoner i vitro, for eksempel effekten av infliximab i en blandet lymfocytt reaksjon (MLR) eller IVIg på menneskelig makrofager i perifert blod mononukleære celler, hvor effekten ikke kan tilskrives en bestemt celle type7,12. Bruke BMDMs og peritoneal makrofager er en fordel over bruker linjer, for eksempel RAW264.7 celler som ikke produserer den pro-inflammatoriske cytokin, IL-12, som svar på LPS8,13. Teste effekten av et antistoff-baserte narkotika på macrophage svar ex vivo har fordeler fordi cytokin svar kan direkte tilskrives makrofager, snarere enn inferring macrophage svar ved å måle serum cytokin nivåer14 . BMDMs og peritoneal makrofager kan være avledet og isolert fra genmodifiserte mus å fastslå den spesifikke-rollen til en protein i anti-inflammatorisk macrophage aktivisering. For eksempel vi har brukt Il10 mangelfull(- / -) BMDMs å vise at IVIg-indusert reduksjon av pro-inflammatoriske cytokiner produksjonen er delvis avhengig av IL-10-8. Stoffets virkningsmekanismen kan undersøkes med vestlige blotting, der rollen spesifikke proteiner og signalnettverk hendelser kan bestemmes. Kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR) kan utføres på BMDMs eller peritoneal makrofager å vise mønstre av genuttrykk som følge av antistoff aktivisering. Sykdom modeller i mus kan gi informasjon om den potensielle effekten av antistoff-baserte biologiske terapier modeller for sykdommer som inflammatorisk tarm sykdom, revmatoid artritt og kreft15,16, 17. men teknikkene her vil gi informasjon om virkningsmekanismen av disse biologiske ved å bestemme om de induserer anti-inflammatorisk macrophage aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of British Columbia.
1. benmarg Macrophage avledning og Aktivisering med antistoffer
- Utføre euthanasia bruker CO2 kvelning.
- Sted musen i induksjon kammer. Euthanize mus med 5% isoflurane anestesi, 60-90 r, til immobile og pustende er dyp og langsom.
- Slå av isoflurane anestesi og administrere 6-8 L/min CO2 til musen har sluttet å puste. La musen med CO2 på i minst 5 min. Kontroller at det er ikke lenger en hjerteslaget eller åndedrett. Utføre en cervical forvridning slik død.
Merk: 8-12 uker gammel mus gir høyest avkastning av makrofager.
- Spray musen Ben med 70% etanol, og pin dem med armer og Ben utstrakt i supine posisjon over et skum bord. Med saks og tang til å holde huden, gjør et grunt kutt (0,2 cm) fjerne i hud og pels fra overflaten av hver av bakbena.
Merk: Utføre denne fremgangsmåten og alle vev kultur manipulasjoner i sterilt hette. - Trim for å synliggjøre tibias og femurs. Fjern tibias og femurs, ved å kutte av bein og muskler bare under hofteleddet og over anklene. Klippe så mye muskel av som mulig.
- Spray bein med 70% etanol og vente 1 min å fordampe, deretter plassere dem i 6 godt plate av bein flush medium (Iscoves endret Dulbecco's medium (IMDM), 10% fosterets bovin serum (FBS)).
- Trim endene av bein ved å kutte 0,1 cm av bein av ankel og toppen av femur slik at bein hulrommet er utsatt. Kontroller at margen er synlig og en 26 gauge nål kan plasseres i bein hulrom.
- Klippe bein og muskler å skille tibias og femurs fra kneet leddene. Sett inn en 26 gauge nål knyttet til 10 mL sprøyte inn i hulrommet. Tømme benmargen i en 50 mL konisk rør med 5 mL av bein flush medium. Tømme to tibias og to femurs, fra ett museklikk, i hver 50 mL tube.
- Pipetter opp og ned flere ganger eller vortex margen i sakte fart å forsiktig spre klumper. Strenger av benmarg skal deles opp i små (mindre enn 0,5 mm) prikker av benmarg. Fyll konisk røret til 50 mL med bein flush medium. Pipetter innholdet av koniske røret til en 75 cm2 vev kultur behandlet kolbe, og ruge på 37 ° C, 5% CO2 1t.
Merk: Eldre makrofager og mesenchymal celler blir tilhenger til flasken og kastes, mens det ønskede blodkreft progenitors fortsatt suspensjon. - Pipetter mediet med blodkreft stamfedre i en 50 mL konisk rør. Sentrifuge røret på 300 x g ved romtemperatur for 5 min. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 5 mL macrophage koloni stimulerende faktor (MCSF) kultur medium (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penicillin/streptomycin og 150 μM monothioglycerol (MTG)).
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer18. Legge til medium resuspend cellene til en konsentrasjon på 0,5 x 106 celler/mL, 1,5 x 107 celler/kolbe i 30 mL av medium, og Pipetter forsiktig opp og ned. Pipetter 30 mL av suspensjon i en ny 75 cm2 vev kultur behandlet kolbe.
- På dag 4 og dag 7 etter første kultur i trinn 1,9, kontroller at cellene er tilhenger og litt forgrenet bruker en invertert fase kontrast lyse feltet mikroskop. Kast mediet som inneholder ikke-tilhenger cellene. Vask cellene med IMDM én gang og legge til 30 mL av MCSF kultur medium.
- Når cellene er modne dag 10 (> 95% positiv for F4/80 og Mac-1), kontroller igjen at cellene er tilhenger og litt.
- Plate celler for stimulations, fjerne kultur medium fra flasken og legge til 8 mL av enzymet gratis, EDTA-basert celle dissosiasjon buffer (Tabell for materiale). Inkuber celler for 5 min på 37 ° C, 5% CO2.
- Skrap celler forsiktig, med en liten mengde trykk, bruker sterilt celle skraper. Sjekk i mikroskopet som celler har løsrevet fra overflaten kolbe. Pipetter dissosiert celler i et 50 mL konisk rør. Skyll flasken 3 ganger 5 mL av IMDM og basseng skylling løsning med cellene som ble høstet. Sentrifuge cellene på 300 x g ved romtemperatur for 5 min.
- Resuspend celle pellet i 3 mL MCSF kultur medium per 50 mL konisk rør. Telle levedyktig celler ved hjelp av en hemocytometer18. Resuspend celler i en konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL og plate 100 μL av cellen suspensjon (1 x 105 celler/vel) per brønn av en 96-brønns vev kultur behandlet, flat bunnplaten.
Merk: Bein fra ett museklikk vil generere nok celler 100 brønner. Eventuelt 1 mL av celler kan være belagt i en 6-vel plate (vev kultur behandlet, flat bunn). Et større antall celler (1 x 106 celler) kan være nyttig for western blot analyser. - Når tilhenger, stimulere to og tre eksemplarer brønner hver med 10 ng/mL av LP-plater i IMDM, 30 mg/mL av IVIg, eller IVIg + LPS. Doser av LPS eller IVIg kan være titreres for å optimalisere svar. La to og tre eksemplarer brønner som unstimulated kontroller. Inkuber dem 24 h (37 ° C, 5% CO2).
Merk: Nytt belagt celler bør følge vev kultur brønner i 1 time. - Samle celle supernatants i hver brønn i individuelle 1,7 mL microcentrifuge rør og fjerne alle partikler av snurrende 10.000 x g i 5 min.
- Fjern cellen supernatant og unngå å forstyrre pellet. Plass avklart cellen supernatant i et sterilt microcentrifuge rør.
Merk: Cellen supernatants kan være assayed for cytokiner, IL-10 og cytokin underenheten, IL-12 / 23p 40 av enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA) umiddelbart, eller lagret på-80 ° C langsiktig. Følg ELISA protokollen fra kommersielt tilgjengelige kit (Tabell for materiale). Andre pro-inflammatoriske cytokiner kan være assayed, som IL-6 og TNF, som de er også redusert med co behandling med IVIg + LPS stimulering sammenlignet stimulering med LPS alene. Etter stimulering, kan tilhenger celler være forberedt på teknikker som vestlige blotting eller kvantitativ polymerase kjedereaksjon (Q-PCR) 19,20.
2. utfordrende mus i Vivo med IVIg og høsting Peritoneal makrofager
- Veie hver musen.
Merk: For eksempel for en 20 g mus, 500 µL av IVIg kreves.
Merk: Følg fremgangsmåten i sterilt hette.
Merk: Plass nålen nøye musen slik at du ikke injisere PBS i organer, men snarere i peritoneal plass.
Merk: For hver 5 mL væske injisert, ca 3.75 mL gjenopprettes.
Merk: Etter siste injeksjon, kan det være enklere å hente væsken fra de langt venstre og høyre sidene av musen, der væske har samlet. Organer får mindre interferens med nålen på denne plasseringen.
NOTE Makrofager vil være litt større enn de andre peritoneal cellene. Typisk avkastning er 5 x 105 - 1 x 106 makrofager/mus bruke wild type C57BL/6 mus.
Valgfritt: Hvis et stort antall røde blodlegemer i cellen pellet, utføre en lysis trinn for å fjerne dem, med 1 x røde blodlegemer lyseringsbuffer i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Det kan være nødvendig å bassenget celler fra mer enn én mus for et eksperiment hvis bruker tre eksemplarer brønner eller titrating stoffer. For eksempel hvis en mus hadde 5 x 105 makrofager, ville 500 μL plating medium være nødvendig. Det ville være nok celler for 5 brønner, eller 1 eksperiment i duplikat, med en LPS dose.
Merk: Etter stimulering, tilhenger celler kan være forberedt på teknikker som western blot eller PCR.
3. utfordrende mus i Vivo med IVIg + LPS og høsting Peritoneal makrofager
- Veie hver musen. Beregne volumet av IVIg (100 mg/mL lager konsentrasjon) for å gi en siste dose 2.5 g/kg kroppsvekt. Beregne mengden LPS (100 μg/mL lager konsentrasjon i IMDM) for å gi en siste dose 0,2 μg/g kroppsvekt.
Merk: For eksempel for en 20 g mus, 500 µL IVIg lager løsning og 40 μL en 100 μg/mL løsning av LPS kreves. - Tegn den nødvendige mengden av IVIg og LPS sterilt 1 mL sprøyter med en bakteriefri 26 til måle pinne. For kontroll mus som ikke mottar IVIg, kan du erstatte en tilsvarende mengde IVIg med sterilt PBS pH 7.4.
- Scruff musen med én hånd ved flytte huden bak i nakken med tommelen og pekefingeren og holde sin hale og en bakben ben med fingrene gjenværende. Vipp kroppen mot bakken.
- Sted nålen i 30-40° vinkel i forhold til musen er magen, i nedre høyre kvadrant, skråkant, og sett inn 1,5 cm. Sett inn IVIg + LPS, eller PBS + LPS, intraperitoneally som i trinn 2.4.
- Etter 1h, høste peritoneal makrofager ved å utføre trinn 2.5-2.10.
- Nedspinning celler på 300 x g i 5 min på 4 ° C. Fjerne 1 mL gjenopprettede lavage væske og bruk IL-10 og IL-12 / 23p 40 analyser av ELISA i henhold til produsentens instruksjoner eller fryse-80 ° c for fremtidige analyser.
Merk: For å sikre nøyaktig sammenligning mellom behandlingene for lavage væske cytokin analyse, utføre 5 mL flushs av bukhulen 4 ganger for et siste volum på 15 mL. Ikke alle væske gjenopprettes fra hver flush. - Som i trinn 2.11, resuspend og telle levedyktig makrofager.
NOTE Makrofager vil være litt større enn de andre peritoneal cellene.
Valgfritt: Hvis et stort antall røde blodlegemer i cellen pellet, utføre en lysis trinn i henhold til produsentens instruksjoner for å fjerne dem som i trinn 2.11.
Merk: Det kan være nødvendig å bassenget celler fra mer enn én mus til et eksperiment. For eksempel hvis en mus hadde 5 x 105 makrofager, ville 500 μL plating medium være nødvendig.
Merk: Utvalg kan brukes umiddelbart eller frosset og lagret ved-80 ° C for cytokin analyse av ELISA.
Merk: Celler kan være forberedt på teknikker som western blot eller PCR, trinn 1,16-1.17 og 2.14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murine bein margtransplantasjon avledet makrofager kan kultivert fra blodkreft celle forløpere i benmargen aspirates. Benmarg aspirates samlet fra femurs og tibias en C57BL/6 mus vanligvis gi 107 benmarg avledet makrofager, noe som gjør dem til en praktisk kilde til makrofager for eksperimenter. BMDMs kan brukes til å teste antistoff basert narkotika svar da utfordret med en inflammatorisk stimulans i vitro. Figur 1 viser at IVIg merkevare, Gammunex (GX), + LPS øker produksjonen av anti-inflammatorisk cytokin, IL-10, 7-fold forhold til LPS stimulering alene (figur 1A) og reduserer produksjonen av IL-12/23 p 40 (figur 1 B). Figur 1 viser også at forskjellige IVIg preparater utføre annerledes. Selv om de tre forskjellige preparater av IVIg kan redusere IL-12 / 23p 40 betydelig (figur 1B), Octagam (OG) og Gammagard væske (GL), ikke signifikant øke IL-10 produksjon svar på LPS (figur 1 A). OG og GL, kan redusere IL-12/23 p 40 produksjon svar til LPS, men i mindre grad enn GX. Disse resultatene viser at antistoff påvirker benmargen avledet macrophage aktivisering, og at det er forskjeller mellom preparater av samme stoffet som kan forårsake endringer i svar.
BMDMs kan brukes til å teste mekanistisk effekten av IVIg, av vestlige blotting. Makrofager aktiveres med IC + LPS har økt fosforylering av mitogen aktivert protein (kart) kinaser, p38 og Erk1/2, som er ansvarlig for økt IL-10 produksjon21. Resultater i figur 2 viser en typisk western blot å oppdage kart kinase aktivering kreves for IL-10 produksjon av makrofager som er unstimulated, eller har blitt stimulert med LPS, IVIg, eller IVIg + LPS. IVIg stimulering alene eller IVIg + LPS co-stimulering økt aktivering av kart kinaser, Erk1/2, med tidligere og langvarig fosforylering sammenlignet med som sett med LPS alene. Aktivering av p38 oppstått tidligere i makrofager stimulert med IVIg + LPS sammenlignet med de stimulert med LPS alene. Disse resultatene viser at metoder, for eksempel western blotting, kan brukes til å vise celle signalisering effekten av antistoff legemidler på BMDMs. I tillegg til cytokin produksjon, kan kart kinase aktivisering brukes til å vise at anti-inflammatorisk macrophage aktivisering har oppstått.
Modne, vev bosatt makrofager kan også være isolert fra mus å vurdere Svar å IVIg 5.0 x 105 - 1.0 x 106 peritoneal makrofager kan være isolert fra en sunn C57BL/6 musen. I Figur 3øke peritoneal makrofager fra mus injisert med IVIg ikke signifikant IL-10 produksjon i fravær av stimulering i vitro, sammenlignet med PBS injisert mus. Når peritoneal makrofager fra IVIg injisert mus er stimulert med LPS ex vivo, de produserer 6-fold mer IL-10 enn mus injisert med PBS. De produserer ikke, men synlig mengder av IL-12 / 23p 40 når stimulert med LPS ex vivo. Disse resultatene viser at antistoff effekter kan testes på makrofager av sprøytebruk av narkotika i vivo og dyrking celler ex vivo med denne metoden.
Macrophage Svar å antistoffer og provoserende stimuli kan vurderes i vivo. Cytokiner produksjonen kan vurderes i lavage væske, og i supernatants fra ex vivo stimulert peritoneal makrofager. Figur 4 viser anti-inflammatorisk cytokin IL-10 er økt i lavage væske (Figur 4A), peritoneal celler (Figur 4B) og peritoneal makrofager (Figur 4C) når mus blir utfordret med IVIg + LPS sammenlignet med PBS + LPS. Produksjon av pro-inflammatoriske cytokin underenheten, IL-12 / 23p 40, er betydelig redusert i kulturperler peritoneal makrofager, men ikke i lavage væske. Denne metoden tillater undersøkelse av et antistoff stoffets effekt på inflammatorisk svar i vivo som ex vivo.
Figur 1 : Macrophage IL-10 og IL-12 / 23p 40 produksjon svar på co-stimulering med forskjellige merker av IVIg og LPS. C57BL/6 MCSF benmarg avledet makrofager var enten unstimulated (C), eller stimulert med LPS (10 ng/mL), IVIg (30 mg/mL), eller IVIg + LPS. Tre forskjellige merker av IVIg ble testet: Gammunex (GX), Gammagard væske (GL) og Octagam (OG). Macrophage supernatants var samlet 24 timer etter stimulering, og avklart med sentrifugering. ELISAs for IL-10 (A) og IL-12/23 p 40 (B) ble utført. Dataene er for makrofager fra n = 3 uavhengige eksperimenter, med celler fra 1 personlige musen per forsøk, med ELISAs assayed i duplikat. Data er betyr ± SD. *P < 0,05, ** P < 0,001, ***P < 0,0001 for sammenligning mellom LPS stimulering og IVIg + LPS co-stimulering. Enveis analyse av varians (ANOVA) med Tukeys post test for flere sammenligninger ble brukt til statistiske analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Western blot analyse av kart kinase aktivisering i IVIg-aktivert makrofager. MCSF avledet benmarg makrofager var unstimulated eller stimulert med LPS (10 ng/mL), GX IVIg (30 mg/mL), eller GX IVIg + LPS; for 0, 10, 40 eller 120 min. hele cellen lysates (1.0 x 106 makrofager/lane) ble utsatt for natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel gelelektroforese (SDS-side) og vestlig blotting med phospho-spesifikke antistoffer for p38 og ekstracellulære signal-regulert kinase (Erk1/2), samt glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), som en lasting. Resultatene som vises er n = 3 uavhengige eksperimenter, med celler fra 1 personlige musen per forsøk.Densitometry for pp38 og pErk1/2 protein nivå, normalisert til GAPDH, i gjennomsnitt fra 3 uavhengige eksperimenter vises under hvert band. Dette tallet er endret fra Kozicky et al8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : IL-10 produksjon av makrofager fra mus utfordret med IVIg i vivo. 8-uke-gamle C57BL/6 mus ble gitt sterilt PBS (injeksjon kontroll) eller GX IVIg (2.5 g/kg) intraperitoneally. Etter 1 h, mus var euthanized og peritoneal lavages ble utført. Peritoneal makrofager ble isolert hjelp av overholdelse. Makrofager var enten unstimulated (C), eller stimulert med LPS (10 ng/mL). Celle supernatants ble høstet og avklart etter 24 timer for IL-10 ELISAs. Dataene er fra n = 5 individuelle mus per gruppe i 3 uavhengige eksperimenter, med ELISAs assayed i duplikat. Data er betyr ± SD. * P < 0,01 og NS = ikke betydelig. Statistiske analyser ble utført med en toveis VARIANSANALYSE med Sidak's posttest for flere sammenligninger. Dette tallet er endret fra Kozicky et al8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : IL-10 og IL-12 / 23p 40 produksjon fra mus utfordret med IVIg + LPS i vivo. 8-uke-gamle C57BL/6 musene ble injisert intraperitoneally med enten PBS + LPS (0,2 µg/g kroppsvekt), som en kontroll; eller GX IVIg (2.5 g/kg kroppsvekt) + LPS (0,2 µg/g kroppsvekt). Etter 1 h, mus var euthanized og peritoneal lavages ble utført. (A) Clarified lavage væske, (B) avklart betinget supernatants fra peritoneal celler under en 1t macrophage tilslutning trinn, og (C) avklart 24 h peritoneal macrophage (Mφ) supernatants var assayed for IL-10 og IL-12 / 23p 40 med ELISA. Data er betyr ± SD n = 5 mus 3 uavhengige eksperimenter, med ELISAs assayed i duplikat. P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001 og NS = ikke betydelig. Mus injisert med PBS + LPS ble sammenlignet med mus injisert med IVIg + LPS bruker en Student t -test. Dette tallet er endret fra Kozicky et al8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Macrophage aktivisering USA spiller en viktig rolle i begge vev homeostase og sykdom22. Makrofager kan ha forskjellige og overlappende aktivisering stater, avhengig av signaler i deres microenvironment3. De har forskjellige roller i alle faser av inflammatorisk respons: forsvar mot patogener sår helbredelse og vev hvile og har også en tydelig anti-inflammatorisk aktiveringsstatus som er viktig for å slå av inflammatorisk respons2 . Anti-inflammatorisk macrophage aktiveringen krever to eksterne stimuli for makrofager å produsere store mengder anti-inflammatorisk cytokin, IL-10, og lave mengder pro-inflammatoriske cytokiner, slik som IL-1223. Et signal kommer fra antistoffer konstituert gjennom Fc gamma reseptorer, og den andre er en pro-inflammatoriske stimulans, som LPS eller IFNγ24,25. Serum, immun komplekser og anti-TNFα antistoffer, har alle blitt funnet for å indusere høy IL-10-produing antiinflammatoriske aktivisering tilstand i makrofager8,23,25,26. Vår gruppe har tidligere publisert at murine benmarg avledet makrofager og peritoneal makrofager stimulert med IVIg produserer store mengder IL-10 og lite til ingen pro-inflammatoriske IL 12 / 23p 40 svar til LPS8. Vi har også funnet at andre pro-inflammatoriske cytokiner, TNF og IL-6 er også redusert med IVIg i benmargen avledet makrofager8. Metodene som er beskrevet her kan brukes for å teste andre antistoff basert narkotika svar i musen BMDMs og peritoneal makrofager i vitro og i vivo.
Det er mange viktige skritt i testing antistoff-baserte therapeutics på musen benmargen og peritoneal makrofager. Opprettholdelse av sterilitet er viktig for hver protokoll. Hvis macrophage kulturer er forurenset med mikroorganismer fra luften, pels eller avføringen Mus, vil makrofagene svare på disse stimuli ved å produsere pro-inflammatoriske cytokiner. Utfører alle eksperimenter i en biosafety CAB, sprøyting musen rikelig med etanol og sikrer integriteten til tarmen under peritoneal flush er avgjørende. Antistoffer må også holdes sterile og lagret i henhold til produsentens instruksjoner. Det kan ikke brukes hvis den forurensede, utløpt eller grumset. Turbiditet vil redusere effekten av stoffet, og kan oppstå hvis stoffet lagres ikke på riktig temperatur eller er lagret for lenge. IVIg kan lagres på 4 ° C og bare brukt før utløpsdatoen er nådd, siden nivåer av IL-10 produksjon kan påvirkes. Vi har også sett at det kan være frosset om 20 ° C med nei bevirke på svar. Ulike masse IVIg føre til lignende eksperimentelle resultater, mens ulike typer IVIg merkevare preparater, som i figur 1, kan forårsake forskjellige svar i makrofager. Essensielle kontrollerer, som unstimulated celler og celler stimulert med antistoff alene, må inkluderes i hver eksperiment å utelukke forurensning av makrofager eller stoffet.
Flere endringer kan gjøres til disse protokollene tilpasse et eksperiment. I ikke-betent staten, kan det være vanskelig å isolere nok peritoneal makrofager for store eksperimenter. Peritoneal makrofager brakt frem ved intraperitoneal injeksjon av thioglycollate (TG). En immunrespons skjer, og etter 4 dager, fremkalte peritoneal makrofager kan være høstet27. De rekrutterte makrofagene kan være mindre modne og representerer ikke bosatt celler, som vi har brukt her, som er viktige hensyn. TG-skapte makrofager kan også internalisert agar fra TG suppen, som kan være en complication, spesielt hvis gjør eksperimenter på fagocytose27. Mus med forskjellig genetisk bakgrunn, C57BL/6 eller BALB/c, kan også brukes for eksperimenter og bli valgt undersøke virkningen av antistoffer macrophage tiltak som vil bli vurdert i sykdom modeller som krever en bestemt genetisk bakgrunn. I tillegg kan genmodifiserte mus, som Il10- / - mus, brukes til å vurdere funksjon av spesifikke proteiner i virkningsmekanismen av et legemiddel, som vi har gjort i vårt eget arbeid8. Ulike inflammatoriske stimuli kan også brukes til å vurdere virkningen av antistoffer på macrophage aktivisering. IFNγ, og vert avledet bompenger som reseptor (TLR) agonister (f.eks hyaluronic acid), har blitt brukt til å aktivere IL-10-produserende makrofager25,28. En viktig faktor er dose av antistoffer. Dosen skal være titreres for å få optimale dosen i kultur og dyreforsøk, som det vil variere mellom antistoffer i tillegg til leverandører. Dosen valgt bør også gjenspeile dosen gitt til mennesker, og vil variere mellom narkotika. IVIg er gitt som en anti-inflammatorisk terapi ved høye doser (25-35 mg/mL eller 2 g/kg kroppsvekt), som gjenspeiler den titrerte doser brukt i disse protokollene29,30.
Bruk av benmarg og peritoneal makrofager har begrensninger. Selv om en forbedring over macrophage cellelinjer, er mus BMDMs fortsatt kunstig avledet celler fra blodkreft forløpere. Testing immun svar for makrofager vitro er et viktig skritt for å forstå antistoff svar, men i vivo eksperimenter må utføres også. Sprøytebruk stimuli i vivo etterfulgt av dyrking celler ex vivo, kan gi mer informasjon for fremtidige studier for å undersøke om antistoff-baserte stoffer kan også aktivere anti-inflammatorisk makrofager i sykdom tilstand. Konklusjoner på hva som skjer i personer som får antistoff-baserte biologiske kan ikke trekkes fra disse eksperimentene. Noen studier blitt publisert for å vurdere effekten av IVIg på menneskelig monocytt avledet makrofager i vitro. En reduksjon i antall IL-6 produsere menneskelige monocytter i vitro er rapportert, når IVIg stimuleres co med LPS sammenlignet stimulering med LPS alene12. IVIg reduserer TNFα og IL-6 produksjon ved stimulering med procalcitonin (PCT) i THP-1 menneskelig monocytic celler31.
Protokoller i notatet har fordeler over eksisterende metoder. Benmarg avledet makrofager og peritoneal makrofager er primære celler, isolert direkte fra mus, heller enn å bli udødeliggjort linjer.Musen macrophage som cellelinjer, for eksempel RAW264.7 celler, produserer ikke pro-inflammatoriske cytokin, IL-12, som svar på LP-plater, som er en viktig cytokin som reguleres av IL-10 som produseres i respons til IVIg8,13. Teste et stoff i vivo med LPS tillater undersøkelse av effekten av stoffet på det lokale peritoneal miljøet gjennom analyse av lavage væske, peritoneal celler og spesielt peritoneal makrofager. Det er en kort sikt, enkel modell som kan gi viktig informasjon for å rettferdiggjøre undersøkelse av ikke-spesifikke effekter av antistoffer på macrophage aktivering i lengre og dyrere dyr modeller av sykdom. Den har en fordel over endotoxemia modeller der den eksperimentelle mål er ofte bare musen overlevelse eller cytokiner i serum14. Overlevelse og serum cytokiner er verdifulle tiltak av immunforsvaret, men de viser ikke bidraget som makrofager kan ha spesielt. Isolere og dyrking av peritoneal makrofager fra en utfordring eksperiment viser en direkte og målbar effekt som antistoff therapeutics kan ha på macrophage funksjon.
Disse metodene har programmer for testing og utforme biologiske terapier. Bruk av antistoffer som therapeutics økt dramatisk de siste årene. Disse behandlingsformer kan imidlertid ha flere ukjente effekter på makrofager som kan gjenkjenne den Fc delen av antistoffer og endre cytokin produksjonen. Anti-TNFα antistoffer, infliximab, har vist seg å indusere IL-10 og undertrykke T celle spredning gjennom sin Fc delen, og som har blitt foreslått som en av dens mekanismer for handlingen7,15,26. Bruker genetisk modeller, kan spesifikke proteiner være involvert i mekanisme hvor disse legemidler som påvirker macrophage aktivisering. Klasser av IgG-antistoffer og forberedelser av antistoffer kan endres for å endre hvordan makrofager påvirkes av biologiske. Våre data indikerer utarbeidelse og/eller lagring av samme antistoff stoffet (IVIg) kan påvirke sin effekt på macrophage aktivisering. Metodene i notatet kan brukes til å utforme behandling som ikke har disse effektene, som kan være avgjørende for å opprettholde immunosurveillance under kreft behandling, hvor anti-inflammatorisk makrofager kan fremme svulst progresjon. Disse teknikkene kan også brukes til å utforme og evaluere stoffer som har disse effektene, hvis ønskelig. For eksempel kan det være gunstig å redusere macrophage inflammatorisk svar og opprette anti-inflammatorisk IL-10-produserende makrofager for å forbedre behandling for inflammatorisk tarm sykdommer eller revmatoid artritt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
L.K. er University of British Columbia 4 års fellesskap (4YF) graduate studentship pris. L.M.S. er mottakeren av en kanadisk sammenslutning av gastroenterologi / Crohns og kolitt Canada / CIHR nye etterforsker lønn prisen og biomedisinsk forsker Michael Smith Foundation for Health Research. Dette arbeidet ble støttet av et prosjekt stipend fra Canadian blod tjenester, i samarbeid med den kanadiske institutter for helseforskning (gi # CIHR2016-LS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
