Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en god model til at studere cytoskeletale og intracellulære transport. Her, beskriver jeg en protokol for in vivo optagelse og analyse af cytoskeletale og intraflagellar transport i C. elegans.
Abstract
Cytoskeletale transport og intraflagellar transport (IFT) er afgørende for axon og cilia morfogenese og funktion. Kinesin superfamilien proteiner og dynein er molekylære motorer, der regulerer anterograd og retrograd transport, henholdsvis. Disse motorer bruger mikrotubulus netværk som skinner. Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en kraftfuld model organisme at studere cytoskeletale transport og IFT i vivo. Her, jeg beskriver en protokol for at observere cytoskeletale transport og IFT i levende C. elegans. Transporteret gods kan visualiseres ved at tagge cargo proteiner ved hjælp af fluorescerende proteiner som grøn fluorescerende proteiner (NGL). C. elegans er gennemsigtig og normal god landbrugspraksis-tagged cargo proteiner kan udtrykkes i specifikke celler under celle-specifikke initiativtagere. Levende orme kan der fastsættes af microbeads på 10% agarosegel uden drab eller bedøve orme. Disse betingelser kan cargo bevægelse direkte observeret i axoner og cilia af levende C. elegans uden dissektion. Denne metode kan anvendes til observation af enhver last molekyle i celler ved at ændre target proteiner og/eller de celler, de kommer til udtryk i. Mest grundlæggende proteiner som molekylære motorer og adapter proteiner, der er involveret i cytoskeletale transport og IFT er bevaret i C. elegans. Sammenlignet med andre modelorganismer, kan mutanter opnås og vedligeholdes nemmere i C. elegans. Kombinere denne metode med forskellige C. elegans mutanter kan afklare de molekylære mekanismer af cytoskeletale transport og IFT.
Introduction
Levende celle imaging er et vigtigt redskab til at analysere intracellulær transport. I neuronal cellebiologi er analyser af cytoskeletale transport med levende celle imaging afgørende for at forstå neuronal funktion og morfogenese1. Defekter i cytoskeletale transport ligge til grund for flere neurodegenerative lidelser2. Kinesin superfamilien proteiner og dynein cytoskeletale transport anterogradely og gennemføre retrogradely, henholdsvis1,2.
Cilia er en anden cellulære rum hvori mikrotubulus netværk og handel med maskiner er højt udviklet3. Protein syntese maskiner er ikke lokaliseret i cilia, hvilket betyder, at ciliaere proteiner skal transporteres fra cytoplasmaet til cilia tips. Cilia-specifikke kinesin og dynein, kaldet kinesin-2 og cytoplasmatisk dynein-2, henholdsvis, transport komponenter i cilia4, i et fænomen kaldet intraflagellar transport (IFT)5. Værdiforringelse af IFT forårsager et spektrum af sygdomme kaldet ciliopathies6. Således, analyse af IFT mekanismen levende celle imaging er forpligtet til at forstå grundlæggende mekanismer af ciliaere dannelse og patogenese.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en god model til at studere cytoskeletale transport og IFT7,8,9. For at overholde IFT, har Chlamydomonas været udbredt som en model organisme5,6. Som Chlamydomonas er en encellet organisme, ville forholdet mellem IFT med aldrende, neuronal funktion og adfærd være vanskeligt at analysere. Desuden er væsentlige genetiske teknikker som CRISPR/Cas9 ikke anvendt til Chlamydomonas. I højere modelorganismer, såsom mus og Drosophila, forårsager afbrydelse af cytoskeletale transport og IFT ofte dødbringende fænotyper fordi cytoskeletale transport og IFT er afgørende for morfogenese og homeostase af dyr 10, 11. I forbindelse med mus, er cellekultur og Transfektion normalt nødvendigt at observere cytoskeletale transport og IFT, som kræver mange færdigheder og omfattende tid12,13. Derudover kan en masse vigtige fysiologiske kontekst gå tabt i kulturperler celler og cellelinjer. Fordi nervesystemet ikke er afgørende for overlevelse af orme, C. elegans mutanter hvor cytoskeletale transport eller IFT afbrydes ofte ikke dødelig7,9,14. Cytoskeletale transport og IFT kan være direkte observeret i vivo uden dissektion fordi C. elegans er gennemsigtige, og det er derfor nemt at overholde normal god landbrugspraksis-tagged markører.
Der er flere protokoller til at immobilisere C. elegans, som ved hjælp af en mikrofluid enhed15, Agarosen puder med anæstesi16eller microbeads17. Optagelse af anæstesi kan hæmme de menneskehandel begivenheder i neuroner15. En klar ulempe ved metoden mikrofluid-enhed er at forberede en mikrofluid enhed ikke er altid let. I stedet, immobilisering af Agarosen puder og microbeads er en praktisk og nem måde at udføre tid bortfalder imaging i C. elegans. Her, jeg beskriver denne grundlæggende protokol for at immobilisere C. elegans og visualisere cytoskeletale transport IFT og vivo i C. elegans. Sammenlignet med de andre metoder, metoden beskrevet her kræver ikke særligt udstyr og er meget billigere og nemmere at udføre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvetilberedning
- Generer en transgene C. elegans stamme af interesse ved hjælp af transgene metoder 18. Alternativt, få passende stammer fra Caenorhabditis genetik Center (CGC). For at visualisere cytoskeletale transport af synaptic vesikel prækursorer, bruge transgene linje wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. At observere IFT, opnå transgene linje mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Disse stammer er brugt i denne protokol.
Bemærk: Enten extrachromosomal array, genomisk integration eller endda normal god landbrugspraksis knock-i værker. For at reducere baggrund signaler, bruge celle-specifikke initiativtagere, snarere end pan-neuronal initiativtagere.
Bemærk: Vedligeholdelse af orme er beskrevet i andre protokoller 20. Stammer blev opretholdt på græsplæner af Escherischia coli OP50 feeder på ødelægge vækst medium (NGM) plader (1,7% (w/v) agarosegelelektroforese, 50 mM NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL kolesterol, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 på 60 mm diameter plastic retter) ved 20 ° C. - Grow orme ved 20 ° C på NGM plader til enhver livscyklus fase af orme.
Bemærk: Man kan iagttage både cytoskeletale transport og IFT på ethvert tidspunkt. Sen L4 til ung voksen er en god positiv kontrol fordi flere publikationer har brugt disse faser og visualiseret menneskehandel begivenheder 14 , 21 , 22 , 23.
2. Forberedelse af 10% Agarosen
Bemærk: mange leverandører giver lignende produkter som agar agar pulver og agarosegelelektroforese. Bruge elektroforese grade Agarosen (gel styrke > 1200 g/cm 2). Billige agar pulver virker ikke, fordi den resulterende gel ikke er stærk nok til at immobilisere orme.
- Mix 0,4 g Agarosen i 4 mL destilleret vand (DW) i et glasrør (1,5 cm x 10,5 cm). Læg låg på glasrør at undgå fordampning.
- Sætte glasrør på en 95 ° C varme blok til 90 min. Derudover forberede en anden glasrør (1,5 cm x 10,5 cm) fyldt med DW og holde det på 95 ° C. sætte en Pasteur afpipetteres i 95 ° C DW ( fig. 1 A). En masse små bobler ses i Agarosen tube og løsningen skal være grumset. Lad det indtil løsningen bliver klar. Derefter blandes ved pipettering op og ned indtil Agarosen løsning bliver homogen.
Bemærk: Mikrobølgeovn kan ikke bruges til at forberede 10% Agarosen løsning når lavet af DW og agarosegelelektroforese. Små bobler forårsaget af mikrobølger forhindre Agarosen smelter. Dog kan størknede 10%-agarosegel nemt blive smeltet igen ved hjælp af en mikrobølgeovn. Glasrør, der indeholder 10% agarosegel kan være forberedt i god tid og opbevares ved 4 ° C i mindst 6 måneder. Hvis dermed smelte bestanden ved hjælp af en mikrobølgeovn efter behov og starte fra trin 3 i denne protokol.
Bemærk: Agarosen gradvist mister evnen til at størkne hvis inkuberes ved 95 ° C for lang tid eller efter gentagne størkning og smeltning. Hvis dette sker, forberede nye 10% agarosegelelektroforese.
3. Forberedelse af Agarosen Pad
- ved hjælp af den varmede Pasteur afpipetteres forberedt i trin 2.2, placere 2 dråber 10% Agarosen på en 76 x 22 mm dias.
- Hurtigt dække med en anden 76 x 22 mm 2 dias før Agarosen drop størkner som vist i figur 1 B, og tryk ned på det andet dias at flade Agarosen løsning. Tykkelse skal være 0,5-1 mm.
- Hurtigt skylle Pasteur pipette af pipettering 95 ° C DW op og ned indtil opløsningen Agarosen er vasket ud. Ellers vil pipette blive tilstoppet af agarosegel. Forlade pipette stående i 95 ° C DW.
- Vente på 1 min. Agarosen puden former og bliver overskyet. Skub derefter, dias fra hinanden i hånden ( figur 1 C).
4. Montering af orme
NOTE: selv små mængder af ormen bevægelse forhindre god observation. Levamisol har traditionelt været brugt til at forhindre orm bevægelse på Agarosen pad 24 , 25. Men levamisol hæmmer neuronal receptorer i C. elegans, og derfor kan påvirke menneskehandel begivenheder i neuroner 15. Ved hjælp af polystyren microbeads beskrevet hereis en god alternativ 17.
- Under et stereo mikroskop udstyret med en forskydelig spejl ved gennemlysning, overføre ~ 30 transgene orme give udtryk for de rigtige markører til en ny NGM plade uden bakterier ved hjælp af en platin wire vælge.
Bemærk: En platin wire pick er lavet af platin tråd og Pasteur pipette (5 tommer), og spidsen af platin wiren var fladtrykt. Udarbejdelse af platin wire picks og håndtering af orme med disse er beskrevet i Wormbook (http://www.wormbook.org). - Forlader pladen for 1 min. bakterier automatisk fjernet fra overfladen af orme som orme videre NGM agarosegel uden bakterier.
- Læg en 0,5-1,0 µL dråbe 2,6% 100 nm diameter polystyren microbeads i vand på agar pad ( fig. 1 D). Overfør 10-20 orme fra bakterier-fri NGM plade til microbeads. Drop og spredning ormene ved hjælp af platin wire vælge for at undgå overlapning af ormen organer ( figur 1 E).
- Dækglas 22 x 40 mm 2 ( figur 1 F). Skub forsigtigt til at fjerne luftbobler, men undgå knusning orme. Prøven er nu klar til afbildning.
Bemærk: Fordi ingen anæstesi administreres, orme er fastsat kun ved den friktion kraft genereret af agar pad, polystyren microbeads og coverslip 17. Tilstedeværelsen af feeder bakterier og/eller for meget løsning vil gøre den friktion kraft svagere.
Bemærk: Forskellige størrelser af coverslips (f.eks., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) arbejde. Dog større coverslips kan forhindre fordybelse vand eller olie fra mål linsen siver ud i prøver under observationen.
5. Bemærkning
Bemærk: passende imaging parametre (laser power, gevinst, binning, etc.) vil variere for hver mikroskop system og kamera. Her, en widefield mikroskop udstyret med en roterende disk Konfokal scanner og en digital CCD kamera bruges.
- Indstillet temperaturkontrol af scenen til 20 ° C, eller justere stuetemperatur-20 ° C.
- Sætte eksempeldias på stadiet mikroskop. Bruge 100 x (numerisk blænde = 1,3 eller bedre) mål linse.
- Ser til de områder, der er angivet i figur 2 A (for wyIs251 og cytoskeletale transport) eller figur 2 B (for mnIs17 og IFT) som positive kontroller . Andre områder kan analyseres som godt 22.
- Sæt parametre (CCD gevinst = 200, Binning = 1 eller 2, laser power på 488 nm = 1,0-1,3 mW). Udføre gang lapse optagelse på 4 rammer/s for op til 1 min. Gem filer som mutli-TIFF format.
Bemærk: Hvis normal god landbrugspraksis signaler forsvinde og det er vanskeligt at fortsætte med at overholde GFP::RAB-3 eller OSM-6::GFP for 30 s, laser power er for stærk. I så fald reducere laser power. Omvendt, hvis ingen vesikulære bevægelse registreres, laser power er for svag. I så fald øge laser power. - Iagttage en forskellige orm og Gentag punkt 5.3 og 5.4. Observationer kan vare i op til 20 min, men hver orm skal registreres én gang for at undgå virkningerne af photo skader.
Bemærk: Orme har været observeret i mindst 20 min. uden betydelige mangler 7 , 27 , 28. Længere observation kan være muligt, men haven ' t blevet testet endnu. Et tydeligt tegn på neuronal død er ændringen af neuronal morfologi såsom neurite hævelse. Som svage normal god landbrugspraksis signaler kan ses i axoner og dendrites i både wyIs251 og mnIs17, kan neurite morfologi let kontrolleres ved bare at kigge på axoner eller dendritter. Neuronal morfologi er vist i figur 2. - Generere filmfiler.
- Åben multi TIFF fil ved hjælp af Fiji software. Gå til filen > åbne marker multi-TIFF fil oplagt taktfast 5.4.
Bemærk: Fiji kan downloades på jttps://fiji.sc. Billede Jørgensen og plugins kan også bruges til at generere kymographs. Hvis gør det, skal du følge de relevante instruktioner for den valgte plugin. - Klik på den " rektangulær markering " knappen ( fig. 3 A, pil) og vælge området af interesse ved at trække et rektangel med en computermus (gul rektangel i fig. 3 A). Gå til Image > stakke > værktøjer > gøre Substacks og vælg den udsnitsnumre, der er inkluderet i filmen. En substack er genereret.
- Aktivere vinduet substack ved at klikke på og gå til billede > Juster > lysstyrke/kontrast. Et vindue til at justere lysstyrken og kontrasten viser. I vinduet, skub øverst bar (Minimum) til højre så at baggrunden signalet forsvinder og andet top bar (maksimum) til venstre så der den bevægelige vesikler og partikler kan ses ganske godt over baggrunden.
- Gå til Image > stakke > tid Stamper. Filmen er optaget på 4 rammer/s i trin 5.4, tidsintervallet er 0,25 s. Således skriver " 0,25 " i intervallet.
- Generere et filmarkiv ved at vælge Gem som > AVI fra menuen filer (film 1 og 2).
Bemærk: Ved hjælp af passende plugins, kan du gemme filen som andre formater som f.eks " mpeg4 " eller " mov " filer.
- Åben multi TIFF fil ved hjælp af Fiji software. Gå til filen > åbne marker multi-TIFF fil oplagt taktfast 5.4.
- Generere kymographs.
- Åbne de oprindelige filmfiler ved hjælp af FIji software igen og Gentag trin 5.6.2 og 5.6.3 at justere lysstyrken og kontrasten.
- Klik " segmenteret linje " ( fig. 3 B, pil). Ved hjælp af musen og trække en segmenteret linje langs den cilia eller axon (gul linje, i fig. 3 B).
- Gå til at analysere > Multi Kymograph > Multi Kymograph ( figur 3 C). Line bredde vindue vises ( figur 3 D). Type " 3 " i Linewidth-vinduet og klik OK ( figur 3 D). Der oprettes
- kymograph vindue. Gem billedet i TIFF eller JPEG format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cytoskeletale transport i DA9 neuron
Ved hjælp af wyIs251 linjen, både anterograd og retrograd cytoskeletale transport af GFP::RAB-3 kan registreres samtidigt i DA9 motor neuron. Den gennemsnitlige hastighed for anterograd og retrograd transport i den proksimale dorsale axon af en DA9 neuron er ca 1,8 og 2,6 μm/s, henholdsvis22. Antallet af bevægelige vesikler handler om 0,03 og 0.018 pr. μm af axon per Sørensen. Således, for en 30 s observation af 10 μm af DA9 axon ved hjælp af en 100 x linse, man kan finde omkring 9 og 5 flytter vesikler i axon (figur 4 og Movie 1). Hvis ingen vesikulære bevægelse kan iagttages, er det muligt, at laser power er for svag. Ud over lange afstande kører, kortrækkende bevægelighed vesikel puljer kan være optaget (film 1). Nogle blærer stoppe ved disse vesikel puljer, mens andre tager afstand fra der7,23. Disse parametre kan overvåges og bruges til at analysere mutant fænotyper.
IFT i halen neuroner
Cilia er lokaliseret til spidsen af dendritter i C. elegans (figur 2B). MnIs17 stammen udtryk for normal god landbrugspraksis-tagged OSM-6, en af IFT underenheder29. OSM-6 er udtrykt i både hoved og hale neuroner19. Mens mange hoved cilia er mærket af mnIs17, er kun to cilia tydeligt observeret i halen neuron. Således observere disse cilia er lettere end hovedet cilier (Se også diskussion). OSM-6::GFP er diffuse i neuronal cytoplasmaet som den, der findes i axon, cellen kroppen og dendrit. Men i cilia, OSM-6::GFP er koncentreret til cilier og indarbejdet i at flytte partikler. Længden af PHA og PHB cilia er omkring 6,5 μm. Anterograde IFT er bifasisk 8,9. Hastigheden af anterograd IFT handler om 0,7 og 1,3 μm/s i de midterste og distale dele af cilia, henholdsvis (figur 5 og Movie 2).
Figur 1 : Demonstration af prøveforberedelsen. (A) Hot DW, Pasteur pipette og 10% Agarosen på varme blok. (B og C) Forberedelse af Agarosen puder: en Agarosen pad er dannet mellem dias (B). Den øverste dias er fjernet efter en Agarosen pad former (C). (D) skematisk tegning, der viser hvordan polystyren perle løsning er sat på Agarosen pad. (E) skematisk tegning, der viser, hvordan orm er sat i polystyren perle løsning ved hjælp af en platin wire vælge. (F) A coverslip (22 x 44 mm2) sættes på Agarosen pad. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Imaging område. (A) skematisk tegning af DA9 og VA12 neuroner og et repræsentativt billede af wyIs251. I DA9 neuroner, har de ventrale axon, commissure og proksimale axon ikke modne synapser. Men synaptic vesikel prækursorer transporteres fra cellen kroppen til synapser via disse cytoskeletale regioner. Den region, der skal bemærkes er vist af bokse. (B) skematisk tegning af PHA og PHB neuroner og deres cilia. Den region, der skal bemærkes er vist af bokse. Skalalinjen = 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Generation af film og kymographs ved hjælp af Fiji software. (A) Klik på knappen "Rektangulær markering" (pil) og vælge det område, man gerne vil fokusere på ved at trække et rektangel (gul boks) for at generere substacks. (B) skal du klikke på knappen segmenterede linje (pil) og trække en segmenteret linje langs cilier ved hjælp af en mus (gul linje). (C) skal du vælge "Analyser", "Multi Kymograph" og "Multi Kymograph" til at starte en plugin til at generere kymographs. (S) Input linewidth, klik på "OK" og genererer kymographs (figur 5 og figur 7). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentative kymograph cytoskeletale transportform af synaptiske vesikel prækursorer. GFP::Rab-3 bevægelse er observeret på den proksimale asynaptic region DA9 neuron og kymograph blev genereret med Multi Kymograph af Fiji. Vandrette og lodrette søjler repræsenterer længde og tid, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentative kymograph af IFT. OSM-6::GFP er observeret i PHA og PHB cilier og denne kymograph er genereret fra hændelsen menneskehandel i enten en af dem. Kymograph blev genereret med Multi Kymograph af Fiji. Vandrette og lodrette søjler repræsenterer længde og tid, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: repræsentative film af cytoskeletale transport af synaptic vesikel prækursorer. GFP::Rab-3 bevægelse er observeret på den proksimale asynaptic region DA9 neuron. GFP::Rab-3 er indarbejdet i synaptic vesikel prækursorer og transporteres. Både anterograd og retrograd cytoskeletale transport registreres. Nogle blærer stoppe men genstarte igen. Filmen blev optaget på 4 rammer/s og spiller på 15 frames/s. ScaLe bar = 5 μm. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Movie 2: repræsentative film af IFT. OSM-6::GFP er observeret i PHA og PHB cilia. OSM-6::GFP er indarbejdet i den komplekse IFT og bevæger sig langs cilierne. Filmen blev optaget på 4 rammer/s og spiller på 15 frames/s. skalaen bar = 5 μm. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Begrænsning med hensyn til eksisterende metoder
Metoden beskrevet her er optimeret til at observere hurtig begivenheder såsom cytoskeletale transport og IFT. Således prioriteres immobilisering mere end længere inkubation. Mens vi har kunnet observere menneskehandel begivenheder i mindst 20 min. uden betydelig undertrykkelse af netbårne, denne metode muligvis ikke altid velegnet til at observere langsom begivenheder kræver længere observationer, som axon strækforlængelse og celle migration. For længere observationer, et behov at optimere betingelserne ved at sænke procentdelen af Agarosen (dvs.stigende vand for at undgå udtørring og mindske presset det potentielt forårsager skader). Alternativt, den mikrofluid enhed, der beskrives ovenfor15 eller immobilisering af orme ved hjælp af Agarosen puder og anæstesi kan være mere egnet16 mens bivirkninger bør vurderes nøje.
Kritiske trin i protokollen
For passende observation er markører kritisk. Markører skal indarbejdes i blærer eller partikler og være af tilstrækkelig lysstyrke. Enten extrachromosomal arrays eller integrerede linjer kan bruges. For visualisering af den cytoskeletale transport af synaptic vesikel prækursorer i DA9 neuroner er wyIs251 stammen nyttige7,23. jsIs821 har været brugt til at observere cytoskeletale transport i mechanosensory neuroner i nogle undersøgelser26,27. Når andre neuroner er analyseret, bør synaptic vesikel proteiner udtrykkes i interesseret neuroner ved hjælp af celle specifikke initiativtagere. Disse initiativtagere bør være stærk nok. RAB-3 og SNB-1 er meget udbredt at mærke synaptic vesikel prækursorer22,23,26. For at overholde IFT, skal være mærket komponenter af den komplekse IFT. Som positiv kontrol er mnIs17 stammen et godt valg29. Cilier fra 8 celler (ASE, ASG, ASI, ASL, aske, ASK, ADF, og ADL) er samlet sammen i hovedet (amphid) mens cilia fra 2 celler (PHA og PHB) er samlet i halen (phasmid). Fordi OSM-6::GFP er udtrykt i alle ciliated neuroner i mnIs17, kan det være vanskeligt at analysere IFT detaljeret i hovedet cilia. Men i regionen hale eneste PHA og PHB neuroner er mærket og IFT i hver celle kan let løses. Andre IFT proteiner markeret af fluorescerende proteiner kan bruges til at observere IFT21,28. Hvis man ønsker at analysere hoved neuroner, ville celle-specifikke initiativtagere være nyttig. Mens hovedet cilia har varierende morfologier, kan transport begivenheder være optaget29. Ved at krydse mutanter med disse markører, kan funktioner af eventuelle gener i cytoskeletale transport og IFT blive analyseret i vivo. De parametre, der kan analyseres har været beskrevet i tidligere arbejde22,23,26,27. Normal god landbrugspraksis er det bedste og primære valg. mCherry og tdTomato kan også være brugt22, men mCherry er meget svagere end normal god landbrugspraksis. tdTomato er en tandem dimer og større end monomere fluorescerende proteiner, som undertiden påvirker dynamikken i fusion proteiner30. Derfor, resultaterne skal analyseres og fortolkes forsigtigt, når tdTomato anvendes. mScarlet, en lyse monomere røde fluorescerende proteiner, som for nylig er blevet udviklet, er en alternativ valg31.
Mens spinding disk Konfokal mikroskopi er almindeligt anvendt til at observere cytoskeletale transport og IFT7,21, udstyret er dyrt og kan være vanskelige at få adgang til i nogle forskningsmiljøer. Men disse fænomener kan også registreres og analyseres i C. elegans ved hjælp af standard fluorescerende mikroskoper, hvis udstyret med høj NA linser, fordi C. elegans er en lille og gennemsigtig dyr og let at iagttage.
Fremtidig anvendelse
Af lignende immobilisering metoden beskrevet her, blev IFT observeret på enkelt molekyle opløsning i vivo32. Derudover er blevet udviklet flere typer af super-resolution mikroskopi. Man kan direkte anvende metoderne beskrevet her super-resolution mikroskopisk analyse. I min erfaring, de hurtigt tilstand af Airyscan33 virker meget godt til at analysere IFT. Teoretisk, en roterende disk super-resolution mikroskop (SDSRM) ville være et godt valg som godt34. Afslutningsvis, ved at kombinere mutant biblioteker og disse nye teknikker, metoden beskrevet er her nyttigt for afklare de molekylære mekanismer af cytoskeletale transport og IFT i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at videregive.
Acknowledgments
Forfatteren tak dybt Dr. Asako Sugimoto (Tohoku Universitet) for hendes nyttige diskussion. wyIs251 var en generøs gave fra Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 blev leveret af CGC-udvalg, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 og #16 H 06536 og Daiichi Sankyo foundation, hjernen Science Foundation og Naito Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell's antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
