Summary
Deze studie uitgevoerd hele genoom sequencing p.a. van mutaties in genen antischimmel medicamenteuse resistentie bij Candida glabratatoekennen. C. glabrata isolaten resistent tegen echinocandins, azoles en 5-flucytosine, werden sequenced ter illustratie van de methodologie. De profielen van de gevoeligheid van de isolaten gecorreleerd met aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde mutatie patronen in de genen.
Abstract
Candida glabrata kan snel het verwerven van mutaties die leiden resistentie tegen geneesmiddelen, met name voor azoles en echinocandins tot. Identificatie van de genetische mutaties is essentieel, aangezien weerstand gedetecteerd in vitro vaak kunnen worden gecorreleerd met klinische mislukking. We hebben onderzocht de haalbaarheid van het gebruik van hele genoom sequencing (WGS) voor genoom-brede analyse van antischimmel medicamenteuse resistentie bij C. glabrata. Het doel was torecognize randvoorwaarden en belemmeringen bij de uitvoering WGS en meten van de effectiviteit ervan. Dit document schetst de belangrijkste kwaliteitscontrole controlepunten en de essentiële componenten van WGS methodologie worden ingevoerd voor het onderzoeken van genetische tellers geassocieerd met verminderde gevoeligheid aan schimmelwerende agentia. Zij schat ook de nauwkeurigheid van de data-analyse en turn-around-tijd van testen.
Fenotypische gevoeligheid van 12 klinische en één ATCC stam van C. glabrata werd bepaald door antischimmel gevoeligheid testen. Deze opgenomen drie isoleren paren, van drie patiënten, die stijging van de drug minimale inhiberende concentraties ontwikkeld. In twee paren, de tweede isoleren van elke weerstand paar ontwikkeld tot echinocandins. Het tweede isolaat van het derde paar ontwikkeld weerstand tegen 5-flucytosine. De resterende bestaat uit gevoelig en azole resistente isolaten. Enkele nucleotidepolymorfisme (SNPs) in genen gekoppeld aan echinocandin, azole en 5-flucytosine weerstand werden bevestigd in resistente isolaten via WGS met behulp van de volgende generatie sequencing. Non-synoniem SNPs in antischimmel resistentie genen zoals FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 en FCY2 werden geïdentificeerd. Globaal, een gemiddelde van 98% van de WGS leest van C. glabrata isolaten toegewezen aan het genoom van de verwijzing met ongeveer 75-fold Lees diepte dekking. De doorlooptijd en de kosten vergelijkbaar waren met Sanger sequencing.
Kortom, was WGS van C. glabrata haalbaar in klinisch significante genmutaties die betrokken zijn bij weerstand tegen verschillende antischimmel drug klassen zonder de noodzaak voor meerdere PCR/DNA sequencing reacties onthullen. Dit is een positieve stap richting van WGS vermogen in het klinisch laboratorium voor simultane detectie van antischimmel weerstand toekenning vervangingen.
Introduction
Candida glabrata is een steeds vaker voorkomende ziekteverwekker met belang als een soort dat virusachtig weerstand aan het azoles alsmede recenter, aan de echinocandins1,2,3. In tegenstelling tot de diploïde C. albicans, kan het haploïde genoom van C. glabrata laat het verwerven van mutaties en multi drugweerstand gemakkelijker te ontwikkelen. Co weerstand aan beide klassen drug is ook gemeld4. Vandaar, vroege evaluatie van antischimmel gevoeligheid en detectie van resistentie in C. glabrata is cruciaal voor de juiste, gerichte therapie zo goed zoals in de context van antischimmel rentmeesterschap te beperken van bestuurders van antimicrobiële resistentie1 , 5 , 6. vaststelling van een efficiënte workflow te snel detecteren de aanwezigheid van confirmatieve mutaties gekoppeld aan weerstand biomarkers in resistente isolaten zal ook helpen om te verbeteren voorschrijven besluiten en klinische resultaten.
Schimmeldodende gevoeligheid wordt meestal beoordeeld door het meten van minimale remmende concentratie (MIC) die is gedefinieerd als de laagste concentratie van de drug die in een aanzienlijke daling van de groei van micro-organismen in vergelijking met die van een drugsvrije groei resulteert controle. De klinische en laboratorium Standards Institute (CLSI), Europees Comité op antimicrobiële gevoeligheid testen (EUCAST) hebben gestandaardiseerd gevoeligheid testmethoden om MIC bepaling meer accurate en consistente7, 8. Het nut van antischimmel MIC blijft echter beperkt vooral voor de echinocandins, in het bijzonder met betrekking tot de interlaboratorium vergelijkingen waar verschillende methodologieën en voorwaarden zijn gebruikte9. Er is ook onzeker correlatie van microfoons met reactie op de behandeling van de echinocandin en onvermogen om zich te onderscheiden van WT (of gevoelig) isolaten van die herbergen FKS mutaties (echinocandin-resistente stammen)10,11. Ondanks de beschikbaarheid van confirmatieve single-gen PCRs en Sanger sequencing van antischimmel-resistentie-markers, realisatie van resultaten is vaak vertraagd wegens gebrek aan simultane detectie van meerdere resistentie-merkers-5,12. Vandaar, gelijktijdige detectie van mutaties weerstand-overdracht op verschillende locaties in het genoom, ingeschakeld door hele genoom sequencing gebaseerde analyse, biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de huidige aanpak.
Hele genoom sequencing (WGS) is met succes uitgevoerd voor het bijhouden van de toezending van de ziekte tijdens uitbraken, alsmede een aanpak voor genoom-brede risico beoordeling en drug weerstand testen in bacteriën en virussen13. Recente vooruitgang in de technologie van nucleïnezuur sequencing hebben geboekt de hele genoom sequencing (WGS) van ziekteverwekkers in een klinisch bruikbare turn-around-tijd zowel technisch en economisch haalbare. DNA sequencing biedt belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden van pathogen identificatie en karakterisering van werkzaamheden in loondienst in microbiologie laboratoria14,15,16. Ten eerste biedt het een universele oplossing met hoge capaciteit, snelheid en kwaliteit. Sequentie kan worden toegepast op elk van micro-organismen en kan schaalvoordelen op lokaal of regionaal laboratoria. Ten tweede, het produceert de gegevens 'toekomstbestendig' vatbaar voor vergelijkingen op nationaal en internationaal niveau. Tot slot, het potentiële nut van WGS in de geneeskunde is uitgebreid door de snelle groei van openbare databanken met referentie genomen, die kunnen worden gekoppeld aan de equivalente databanken die aanvullende metagegevens voor klinische en epidemiologische17 bevatten ,18.
Recente studies hebben aangetoond dat het nut van WGS voor identificatie van antischimmel-resistentie-markers van klinische isolaten van Candida spp. 10 , 19 , 20. Dit is vooral te wijten aan de beschikbaarheid van hoge-doorvoer benchtop sequencers, gevestigde bioinformatics pijpleidingen en afnemende kosten van sequencing21,22. Het voordeel van schimmel WGS over Sanger rangschikken is dat WGS sequentiebepaling van meerdere genomen op een enkele vlucht toestaat. Bovendien kan WGS van Candida genomen nieuwe mutaties in drug targets te identificeren, genetische evolutie en opkomst van klinisch relevante sequentie-types20,22,23bijhouden. Bovenal in gevallen van intrinsieke multidrug resistentie kan WGS helpen bij de vroegtijdige opsporing van resistentie-toekenning mutaties voorafgaand aan behandeling selectie22,24.
Hier, onderzochten we de haalbaarheid van screening WGS ingeschakelde voor mutaties geassocieerd met resistentie tot verschillende klassen van antischimmel agenten. Presenteren we een methode voor de uitvoering van WGS van eindgebruikers en diagnostische mycologie laboratorium perspectieven. Wij opgenomen in deze analyse drie paren gekweekt uit drie aparte klinische gevallen in welke in vitro weerstand tegen de echinocandins en 5-flucytosine ontwikkeld na verloop van tijd na antifungale behandeling isoleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Er was geen ethische goedkeuring vereist voor deze studie.
1. subcultuur en entmateriaal voorbereiding Candida glabrata
- Selecteer een paneel van C.glabrata isolaten worden bestudeerd, waaronder ten minste één C. glabrata American Type Culture collectie (ATCC) met bekende gevoeligheid patroon ook moeten.
- Subcultuur een isolaat door het aanraken van een enkele kolonie met behulp van een steriele wegwerp plastic lus en strepen op een Sabouraud van dextrose agar (SDA) plaat8.
- Incubeer de SDA plaat voor 24-48 h bij 35 ° C voor reincultuur van isolaat met goede groei.
2. Samenstellingvan antischimmel gevoeligheid
- Gebruik een steriele wegwerp plastic lus te halen van 4-5 kolonies van ongeveer 1 mm doorsnede uit een vers subcultured C. glabrata isoleren op SDA plaat. Resuspendeer in 3 mL steriel gedistilleerd water. Meng goed door zachte pipetteren met het oog op een uniforme schorsing.
- De celdichtheid aan 0.5 McFarland die gelijk is aan 1 x 10,6 tot en met 5 x 106 cellen/mL met behulp van een densitometer 8aanpassen.
- Gevoeligheid te testen met behulp van commerciële assay (zie tabel van materialen en reagentia) op alle C. glabrata isoleert volgens de instructies van de fabrikant. Interpreteren van de gevoeligheid van isolaten gebaseerd op resulterende microfoons van antischimmel geneesmiddelen volgens de richtlijnen van de CLSI en voor te bereiden verslag (tabel 1)8.
3. genomic DNA-extractie voor het rangschikken
- Resuspendeer een entoog van kolonies van een vers geteelde SDA plaat in 300 µL van 50 mM EDTA in een 1,5 mL-buis.
- Voeg 40 µL van zymolyase (10 mg/mL) de schorsing, en zachtjes Pipetteer 5 keer tot schorsing uniform is.
- Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 1-2 uur te verteren de celwand. Koel bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Centrifugeer de schorsing bij 14.000 × g gedurende 2 minuten en verwijder daarna voorzichtig de bovendrijvende substantie.
- Uittreksel genomic DNA DNA extractie kit richtlijnen (zie tabel van materialen).
- Resuspendeer geëxtraheerd DNA pellet in 50 µL van 10 mM Tris Buffer (7,5-8,5 pH) in plaats van de buffer van de elutie geleverd in de kit.
- Controleer de zuiverheid van DNA door meting van de extinctie (Saint) op 260/280 nm25.
4. genomic DNA kwantificering
- Bereiden van een 1 x Tris EDTA (TE) buffer waarin de assay kit op basis van richtsnoeren van de fabrikant voor de fluorescentie-assay (zie tabel van materialen).
- Verdun het DNA-monster door toevoeging van 2 µL aan 98 µL 1 x TE assay buffer (eindvolume van 100 µL, verdunning factor 1:50) in een wegwerpbord 96 goed. Deze verdunning stap kan worden uitgevoerd ofwel handmatig met behulp van een meerkanaalspipet of door geautomatiseerde vloeistof verwerken werkstation.
- Het bereik van de normen voor te bereiden door verdunning van de lambda DNA (100 µg/mL) waarin de fluorescentie assay kit (tabel 2) en omvatten voor meting samen met monsters.
- Voeg 100 µL van de fluorescente kleurstof aan 100 µL verdund DNA-monsters en -normen voor de reactie. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Het meten van de fluorescentie van alle monsters op basis van richtsnoeren van de fabrikant.
- Uitzetten van de standaard curve met behulp van de fluorescentie-lezingen en bereken de oorspronkelijke concentratie van de DNA-monsters.
- Bepaal de hoeveelheid DNA en 10 mM Tris buffer (pH 8) moet worden toegevoegd aan het aanpassen van de DNA-concentratie op 0,2 ng/µL.
- Het uitvoeren van de DNA-verdunningen met behulp van geautomatiseerde vloeistof verwerken werkstation. Deze stap kan ook worden bereikt door handmatige pipetteren.
5. DNA bibliotheek voorbereiding
Opmerking: Bibliotheek voorbereiding en rangschikkend werden uitgevoerd na fabrikant protocollen en richtlijnen van de vennootschap (Figuur 1A) (zie tabel van materialen).
- Tagmentation en PCR versterking
- Label een nieuwe 96-Wells hard-shell dunne wand plaat.
- Voeg 5 µL van gekwantificeerde input DNA op 0,2 ng/µL (1 ng in totaal) op elke steekproef goed uit de plaat.
- 10 µL van tagmentation buffer en 5 µL van versterking buffer toevoegen aan elke goed met DNA en zachtjes Pipetteer te mengen. Het zegel van de plaat met een zelfklevende plaat zegel.
- Plaats de plaat in een thermische cycler en voer het volgende programma van PCR: 55 ° C gedurende 5 minuten, en houd bij 10 ° C. Wanneer het monster 10 ° C bereikt, onmiddellijk gaan neutraliseren.
- 5 µL van neutralisatie buffer toevoegen aan de plaat te neutraliseren van de reactie van amplicon en zachtjes Pipetteer mix. Afdichting van de plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg toe 15 µL van het PCR mastermix om de monsters te indexeren.
- Gebruik een doos van index primer buizen beschikbaar voor een installatie van 96-wells-plaat formaat zodat elk monster een unieke combinatie van indexen op basis van indexsjabloon (tabel 3 wordt).
- De index primer buisjes in het rek plaat index (Figuur 1B) met behulp van de in de sjabloon op tabel 3 aangegeven volgorde rangschikken en de positie van de indexen op de sjabloon opnemen.
- Plaats de tagmentation plaat met toegevoegde PCR mastermix op het rek plaat index met de buizen van de index in volgorde.
- Index primer 1 buizen op verticale indeling en index primer 2 buizen in horizontale regeling op het rek index plaatsen Met behulp van een meerkanaalspipet, voeg 5 µL index inleidingen aan elk monster.
- Oude caps van index buizen vervangen door nieuwe caps om te voorkomen dat kruisverontreiniging tussen indexen.
- Afdichting van de plaat met behulp van duidelijke 96-wells-plaat sealers en uitvoeren van de tweede PCR als volgt: 95 ° C gedurende 30 s, 12 cycli van 95 ° C voor 10 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 5 minuten.
- PCR Schoonmaakbeurt
- Transfer van het PCR-product voor PCR-Schoonmaakbeurt, van de tagmentation plaat op een diep-well bord (zie tabel van materialen).
- Vortex de commerciële magnetische kralen-oplossing (zie tabel van materialen) op basis van de aanwijzingen van de fabrikant en 30 µL van parels naar elke PCR product uit diepe-well plaat toe te voegen.
- Schud de plaat op een microplate shaker bij 1800 t/min gedurende 2 minuten en zonder schudden gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Plaats de plaat op een magnetische staan gedurende 2 minuten totdat het supernatans heeft uitgeschakeld.
- Verwijder het supernatant zorgvuldig met de plaat nog steeds op de magnetische stand.
- Voeg 200 µL van vers bereide 80% ethanol met de plaat op de magnetische stand.
- Incubeer de plaat op de magnetische stand voor 30 s en zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant zonder verstoring van de kralen.
- Herhaal nogmaals stap van het wassen en laat de kralen te drogen voor 15 min. verwijderen overtollige ethanol, indien van toepassing.
- Verwijderen de plaat uit de magnetische stand en voeg 52.5 µL van resuspensie buffer aan de kralen.
- Schud de plaat op een microplate shaker bij 1800 t/min gedurende 2 minuten en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten zonder schudden.
- Plaats van de plaat op de magnetische stand en laat de bovendrijvende substantie om te wissen.
- Met behulp van een meerkanaalspipet, zorgvuldig overbrengen 50 µL van het supernatans van de cleanup-plaat een nieuwe hard-shell plaat.
- Bibliotheek normalisatie
- Ontdooi bibliotheek normalisatie reagentia volgens richtlijnen van de fabrikant (zie tabel van materialen).
- Breng 20 µL van het supernatant van de cleanup plaat aan een nieuwe plaat van de diep-well.
- Voeg 45 µL van magnetische kraal schorsing en verzegel de plaat met een plaat sealer.
- Schud de plaat op een microplate shaker bij 1800 rpm voor 30 min. Deze incubatietijd is essentieel en mag niet worden overschreden.
- Plaats de plaat op een magnetische staan gedurende 2 minuten en bevestigen dat het supernatant (Figuur 1B) heeft goedgekeurd.
- Verwijderen en verwijder het supernatant in een passende gevaarlijk afval container met de plaat nog steeds op de magnetische stand.
- Verwijderen de plaat uit de magnetische standaard en wassen van de kralen met 45 µL was buffer.
- Schud de plaat met was buffer op een microplate shaker bij 1800 t/min gedurende 5 minuten.
- Plaats plaat op magnetische stand voor 2 min en negeren supernatant wanneer duidelijk blijkt.
- Verwijderen de plaat uit de magnetische standaard en herhaal het wassen met wash buffer weer.
- Verwijder de plaat uit de magnetische stand en Voeg 30 µL van 0,1 N NaOH.
- De plaat met 0,1 N NaOH schudden in een roteerapparaat microplate bij 1800 t/min gedurende 5 minuten en plaats de plaat op de magnetische stand gedurende 2 minuten, of totdat de vloeistof helder is.
- Voeg 30 µL van elutie buffer toe aan elk putje van een nieuwe 96-Wells hard-shell dunne wand definitieve genormaliseerde bibliotheek plaat.
- Breng 30 µL van supernatant van normalisatie plaat aan definitieve genormaliseerde bibliotheek plaat te maken eindvolume 60 µL. De bibliotheken zijn nu klaar om te worden gesequentieerd.
- Bepaling van DNA bibliotheek concentratie door qPCR
- Ontdooi de mastermix, primers en normen waarin de qPCR kit volgens richtlijnen van de fabrikant (zie tabel van materialen).
- Combineer de PCR reagens mastermix en primer geleverd in de kit van de qPCR volgens de instructies van de fabrikant en aliquots kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C.
- Om te bepalen van de concentratie van de bibliotheek DNA, maken een verdunning van 1/8000 van de DNA-bibliotheken met behulp van 10 mM Tris buffer (pH 8) door het uitvoeren van een 1:100 verdunning (1,5 µL DNA bibliotheek aan 148.5 µL Tris buffer) gevolgd door een verdunning van 1:80 (2 µL van 1:100 aan 158 µL Tris buffer).
- Schud de plaat verdunning op 700 rpm voor minstens 1 min en vervolgens Centrifugeer bij 14000 × g voor 1 min.
- Bereid 20 µL van uiteindelijke PCR reactie door het mengen van 4 µL van verdunde DNA bibliotheek of DNA normen en 16 µL van mastermix.
- Uitvoeren van PCR volgende fabrikant instellingen in thermocycler: 95 ° C gedurende 5 min, 35 cycli van 95 ° C gedurende 30 s en 60 ° C voor 45 s, en definitieve 65 ° C tot 95 ° C gedurende smelt kromme analyse.
- De Ct-waarden van de DNA voorbeeldbibliotheken en de normen van de qPCR thermocycler verkrijgen.
- Een standaard curve genereren van de waarde van de Ct van de normen (Figuur 2). Het bovenste en onderste QC-bereik definiëren door ± 3 cycli van het gemiddelde. Bijvoorbeeld, als het gemiddelde Ct waarde 13 cycli is dan het QC-bereik tussen 16 en 10 cycli.
- De bibliotheek van de individuele en de gemiddelde concentraties (ALC) van de standaard curve en Ct waarden bepalen.
- Bepalen hoeveelheid totale gepoolde bibliotheken (PAL) moet worden gebruikt op basis van de berekening hieronder voor het laatste rangschikken, gezien het feit dat doel bibliotheek concentratie tussen 1,4 - 1.8 pM.
Opmerking: Gemiddelde concentratie van de bibliotheek verkregen qPCR = ALC; Total gepoolde bibliotheken (PAL) = ALC / 2; Gedenatureerd PAL (DAL) = PAL * 0.666
Afhankelijk van het volume van DAL die is gemengd met buffer, is de concentratie van de bibliotheek worden toegevoegd aan de stroom-cel. Bijvoorbeeld, als 65 µL van de bibliotheek wordt toegevoegd aan 835 µL van buffer, vervolgens van deze verdunning (Dil 1) 195 wordt toegevoegd aan een totaal volume van 1300 µL: (65/900) * dnPAL = Dil1
Dil1 * (195/1300) = eindconcentratie (dient tussen 1,4 - 1.8 pM)
6. bibliotheek bundelen en de initiatiefnemende Sequencing in Benchtop Sequencer
- Ontdooi reagens cartridge volgens de richtlijnen van de fabrikant. Neem een nieuwe cel van de stroom van het pakket van 4 ° C-opslag en breng aan kamertemperatuur atleast 30 minuten voorafgaand aan het rangschikken. Nemen buffer cartridge en prechill volgorde buffer vóór gebruik (zie tabel van materialen).
- Bereid een bibliotheek voor besturingselementen door het mengen van 5 µL van bibliotheek (1 nM) en 5 µL van 0,2 N NaOH. Vortex kort en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te denatureren van de bibliotheek voor besturingselementen in enkele strengen.
- Voeg 5 µL van 200 mM Tris-HCl, pH 7 en vortex. Voeg 235 µL prechilled volgorde buffer en meng voorzichtig. Het totale volume is 250 µL met controle bibliotheek eindconcentratie om 20 uur.
- Zwembad DNA bibliotheken door de overdracht van 5 µL van elke sample-bibliotheek te worden van de laatste genormaliseerde bibliotheek plaat sequenced in een enkele laag-bind 1,5 mL-buis.
- Voeg 30 µL van gebundelde bibliotheek en 30 µL van 0,2 N NaOH te denatureren bibliotheken in een andere laag bind buis.
- Vortex de lage-bind tube en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te denatureren bibliotheken in enkele strengen.
- Voeg 30 µL van 200 mM Tris-HCl, pH 7 aan buis met gedenatureerde bibliotheken te neutraliseren reactie.
- Voeg 65 µL van geneutraliseerde gedenatureerde bibliotheken schorsing en 835 µL van vooraf gekoeld volgorde buffer en vortex te goed mengen.
- In de buis van een definitieve lage bind combineren het volgende: 195 µL van geneutraliseerde gedenatureerde Bibliotheken, 1,30 µL van bibliotheek voor besturingselementen en 1103.70 µL van sequencing buffer. Meng goed.
- De definitieve bibliotheek mix (1300 µL) in de aangewezen plek op reagens cartridge laden.
- Set-up de volgorde uitvoeren door het invoeren van gegevens van het project en steekproef in de Sequencer aangewezen website richtlijnen volgt.
- Starten rangschikken volgens richtlijnen. Laad stroom cel, reagens tonercartridge met bibliotheken en buffer cartridge in benchtop sequencer.
- Record chargenummers van alle reagens kits en cartridges gebruikt in de volgorde.
7. gegevens downloaden van Sequencing Website
- Download FASTQ bestanden volgens de instructies van de fabrikant van op de website.
- Voor een goede kwaliteit te controleren worden uitgevoerd dat het percentage Q30 ≥ 75% en cluster dichtheid is tussen 170-280 K/mm2 met optimaal bij 200-210 K/mm2 (tabel 4).
8. sequencing Data-analyse
- FASTQ bestanden in gesequenceerd monsters importeren in data analyse geïntegreerd softwarepakket (zie tabel van materialen).
- Maak een werkstroom sequencing in software door het toevoegen van functies uit lijst namelijk trimmen, toewijzen aan referentie (Selecteer referentie genoom), lokale herschikking en variant analyse (Figuur 3A) met behulp van instellingen vermeld in tabel 5.
- Werkstroom uitvoeren door het selecteren van een monster of een partij van FASTQ voorbeeldbestanden en uitvoerbestanden opslaan in mappen aangewezen monster.
- Genereer een rapport voor volgorde dekking diepte en de toegewezen regio's lijst van structurele varianten in genoom (Figuur 3B).
- Lijst van structurele varianten gebruiken om te zoeken naar niet-synoniem één nucleotidepolymorfisme (SNPs) in genen overdracht van resistentie en virulentie.
- Verslag opstellen door een opsomming van SNP locatie gen en aantal resistente of gevoelig isolaten (tabel 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dertien C. glabrata bestaande uit C. glabrata ATCC 90030 en 12 isolaten van het klinische mycologie referentielaboratorium (isoleert CMRL1 naar CMRL12), Westmead ziekenhuis, Sydney werden bestudeerd (tabel 1). Deze omvatten drie paren van isolaten CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 en CMRL-5/CMRL-6 vóór en na antifungale therapie met geen epidemiologische verbanden ertussen verkregen 24 (tabel 1).
De microfoons werden bepaald met behulp van de CLSI interpretatieve onderbrekingspunt voor negen antischimmel agenten namelijk amfotericine (AMB), Anidulafungin (ANI), Micafungin (MIF), caspofungine (CAS), 5-Flucytosine (5-FC), posaconazol (POS), voriconazol (VRC), itraconazol () ITR) en Fluconazol (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019 en Candida krusei ATCC 6258 werden gebruikt als kwaliteitscontrole stammen. Onder het isoleren paar, CMRL-1 en CMRL-2, was de tweede isoleren CMRL-2 tegen caspofungine (MIC-8 vs. 0.12 mg/L, tabel 1). CMRL-2 had ook gelijkaardige evenredig toeneemt in de microfoons voor anidulafungin en micafungin (≥ 0,5 mg/L) wat resulteert in in vitro weerstand tegen alle drie echinocandins24. Evenzo had isolaat CMRL-4 echinocandin weerstand dan die van isolaat CMRL-3 (tabel 1) ontwikkeld. Tussen het derde paar, isoleren CMRL-6 had een 5-flucytosine MIC (> 64 vs. 0.06 mg/L)24. Beide deze isoleren paren werden gevoelig/wild-type (WT) aan andere schimmelwerende agentia getest. Isoleren CMRL-6 en CMRL-12 bleken resistent of niet-WT aan alle azoles. CMRL-7 was resistent tegen fluconazol en niet-WT aan voriconazol (tabel 1). C. glabrata ATCC 90030 en isolaten CMRL-8 tot en met CMRL-11 waren gevoelig voor de ziekte vatbare/WT tot alle antischimmel agenten24.
WGS 13 isolaten werd uitgevoerd met behulp van de benchtop-sequencer. Voor een gemiddelde, een mid uitvoer volgorde uitvoeren, leverde rond 27-40 GB gegevens met een foutenpercentage tussen 0,5-1.4%. Het gemiddelde percentage Q30 verkregen was meestal ongeveer 80-85%. De flow-cluster celdichtheid (K/mm2) varieerde van 200-250 (tabel 4). De ruwe sequencedata uit deze studie zijn nedergelegd bij NCBI volgorde lezen archief (SRA) het project onder nummer PRJNA310057. 98% van sequencing leest toegewezen aan het C. glabrata referentie genoom (stam CBS138) door middel van analyse in geïntegreerde data-analysesoftware. De gemiddelde Lees diepte dekking was 75 x met gemiddelde lengte van 143-bp. structurele variant detectie geïdentificeerde meer dan 50, 000 SNPs per isolaat lezen. In het bijzonder bij het analyseren van de paren van de stam CMRL1/CMRL-2, totale SNPs gevonden op elk isolaat rond 79,000, voor CMRL-3/CMRL-4 waren, waren het totale aantal SNPs circa 60.000 en voor CMRL-5/CMRL-6, meer dan 56.000 in vergelijking met CBS13824. Het verschil van de SNP in vergelijking tussen isolaten in een paar stam was minder dan 25.
Gebaseerd op het profiel van de gevoeligheid van de isolaten, bekend van weerstand biomarkers werden geselecteerd voor analyse24, met name, FKS1, FKS2 en FKS3 (echinocandin weerstand), FCY1 en FCY2 (5- flucytosine weerstand), en ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 en CgFLR1 (azole weerstand). De genen werden gecontroleerd voor bekende mutaties, en de frequentie van voorvallen van de SNP. Alleen niet-synoniem SNPs in genen met diepte dekking van ≥20 d.w.z. lezen, werden kwalitatief hoogwaardige SNPs (hq-SNPs) specifiek bestudeerd.
Met name werden FKS mutaties geïdentificeerd in het genoom van beide echinocandin-resistente isolaten24. Van de eerste twee paren, de echinocandin resistente isolaten, CMRL-2 harbored een één FKS2 mutatie S629P, en CMRL-4, de FKS2 mutatie S663P (tabel 6). Voor het derde paar, werd een SNP in FCY2 (Ala237Thr) gevonden in zowel CMRL-5 (5-flucytosine gevoelig) en CMRL-6 (resistente) (tabel 6). Echter werden SNPs in FCY2 ook gevonden in andere fenotypische-WT isolaten (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24. Isolaten CMRL-6 en CMRL-12 waren opmerkelijk voor hun pan-azole resistente/niet-WT karakter en had SNPs in zowel CgCDR1 (codering azole efflux-pompen) en CgPDR1 (codering de transcriptiefactor regulering van de efflux-pompen) (tabel 6)26 ,27. De aanwezigheid van mutaties in een ander efflux pomp gen, CgFLR1 opgetreden in beide azole-gevoelig en azole-resistente isolaten26,28. Onderzoek voor SNPs binnen de ERG9 (codering squaleen synthase) bleek mutaties maar er waren geen mutaties geïdentificeerd in ERG1124.
WGS analyse bleek ook meerdere niet-synoniem SNPs in Candida celwand hechting genen namelijk, EPA1, EPA6, PWP2 en PWP5. EPA6 mutaties waren aanwezig in 9/12 isolaten. SNPs in PWP2 en PWP5 waren ook aanwezig in bijna alle isolaten, met uitzondering van isolaten CMRL-1 en CMRL-11-24.
| Isoleren | AMB | ANI | MIF | CAS | 5-FC | POS | VRC | ITR | FLC | Interpretatie van antischimmel gevoeligheid | Waardoor er weerstand geïdentificeerd door WGS | ||
| CMRL-1 | 0,5 | 0.03 | < 0,008 | 0.12 | < 0,06 | 0,5 | 0.12 | 0,25 | 8 | Gevoelig voor alle | - | ||
| CMRL-2 | 0,5 | 1 | 1 | 8 | < 0,06 | 0,25 | 0,06 | 0.12 | 4 | Bestand tegen alle echinocandins alleen | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0,25 | 0,015 | 0,015 | 0.12 | < 0,06 | 1 | 0,25 | 0,5 | 8 | Gevoelig voor alle | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0,06 | 0,5 | 0.12 | 0,25 | 8 | Bestand tegen alle echinocandins alleen | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0.12 | 0,015 | 0.12 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Gevoelig voor alle | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0,06 | 0,015 | 0,06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | Bestand tegen 5-FC en azoles | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0,25 | 0,06 | 0,015 | 0,25 | < 0,06 | 1 | 8 | 0,5 | 256 | Bestand tegen alle azoles alleen | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0,5 | 0.03 | 0,008 | 0,06 | < 0,06 | 0,5 | 0,25 | 0,25 | 4 | Gevoelig voor alle | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0.03 | 0,015 | 0,25 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 1 | 16 | Gevoelig voor alle | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0.03 | < 0,008 | 0,5 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Gevoelig voor alle | - | ||
| CMRL-11 | 0,5 | 0.03 | < 0,008 | 0.03 | < 0,06 | 0,5 | 0,25 | 0,5 | 8 | Gevoelig voor alle | - | ||
| CMRL-12 | 0,5 | 0.03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | Bestand tegen alle azoles alleen | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0.03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 8 | Gevoelig voor alle | - | ||
| Afkortingen: MIC, minimale remmende concentratie; AMB, amfotericine B; ANI, anidulafungin; CAS, caspofungine; FLC, fluconazol; ITR, itraconazol; MIF, micafungin; POS, posaconazol; VRC, voriconazol; 5-FC, 5-flucytosine. | |||||||||||||
Tabel 1. In vitro gevoeligheid van 13 Candida glabrata isoleert met inbegrip van CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 en CMRL-5/CMRL-6 isoleren paren verkregen vóór en na antifungale therapie
| Normen | DNA standaard Volume (l) | 1 X TE buffer | Reagens (l) | Totaal in 96-wells-plaat (l) | Laatste DNA concentratie (ng/mL) |
| Std-Pico 1 | 8 (standaard DNA buis 100 µg/mL) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| Std-Pico 2 | 10 (van Std-Pico 1) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| Std - Pico 3 | 5 (van de Std-Pico 1) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| 4 STD-Pico | 2 (van Std-Pico 1) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| Std-Pico 5 | 10 (Std-Pico 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| Leeg | - | 100 | 100 | 200 | Leeg |
Tabel 2. Protocol voor het opstellen van normen voor standaard Curve generatie voor DNA kwantificering
Figuur 1 . Sequencing Workflow: (A) een overzicht van belangrijke analytische stappen voor de voorbereiding van de bibliotheek en rangschikken op een benchtop sequencer. (B) belangrijke onderdelen zoals het (links naar rechts) voorbereiding DNA bibliotheek indexeren plaat rek voor regeling van indexen tijdens het indexeren en magnetische rack met diep 96-wells-plaat voor magnetische kraal gebaseerd clean-up van DNA bibliotheken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Index Verzameling A |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | Voorbeeld 1 | Voorbeeld 2 | Monster 3 | Monster 4 | Monster 5 | Monster 6 | Monster 7 | Monster 8 | Monster 9 | Monster 10 | Monster 11 | Monster 12 |
| B | S503 | Monster 13 | Monster 14 | Monster 15 | Monster 16 | Monster 17 | Monster 18 | Monster 19 | Monster 20 | Monster 21 | Monster 22 | Monster 23 | Monster 24 |
| C | S505 | Monster 25 | Monster 26 | Monster 27 | Monster 28 | Monster 29 | Monster 30 | Monster 31 | Monster 32 | Monster 33 | Monster 34 | Monster 35 | Monster 36 |
| D | S506 | Monster 37 | Monster 38 | Monster 39 | Monster 40 | Monster 41 | Monster 42 | Monster 43 | Monster 44 | Monster 45 | Monster 46 | Steekproef 47 | Monster 48 |
| E | S507 | Monster 49 | Monster 50 | Monster 51 | Monster 52 | Monster 53 | Monster 54 | Monster 55 | Monster 56 | Monster 57 | Monster 58 | Monster 59 | Monster 60 |
| F | S508 | Monster 61 | Monster 62 | Monster 63 | Monster 64 | Monster 65 | Monster 66 | Monster 67 | Monster 68 | Monster 69 | Monster 70 | Monster 71 | Monster 72 |
| G | S510 | Monster 73 | Monster 74 | Monster 75 | Monster 76 | Monster 77 | Monster 78 | Monster 79 | Monster 80 | Monster 81 | Monster 82 | Monster 83 | Steekproef 84 |
| H | S511 | Monster 85 | Monster 86 | Monster 87 | Monster 88 | Monster 89 | Monster 90 | Monster 91 | Monster 92 | Monster 93 | Monster 94 | Monster 95 | Monster 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Index Set B | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | Voorbeeld 1 | Voorbeeld 2 | Monster 3 | Monster 4 | Monster 5 | Monster 6 | Monster 7 | Monster 8 | Monster 9 | Monster 10 | Monster 11 | Monster 12 |
| B | S503 | Monster 13 | Monster 14 | Monster 15 | Monster 16 | Monster 17 | Monster 18 | Monster 19 | Monster 20 | Monster 21 | Monster 22 | Monster 23 | Monster 24 |
| C | S505 | Monster 25 | Monster 26 | Monster 27 | Monster 28 | Monster 29 | Monster 30 | Monster 31 | Monster 32 | Monster 33 | Monster 34 | Monster 35 | Monster 36 |
| D | S506 | Monster 37 | Monster 38 | Monster 39 | Monster 40 | Monster 41 | Monster 42 | Monster 43 | Monster 44 | Monster 45 | Monster 46 | Steekproef 47 | Monster 48 |
| E | S507 | Monster 49 | Monster 50 | Monster 51 | Monster 52 | Monster 53 | Monster 54 | Monster 55 | Monster 56 | Monster 57 | Monster 58 | Monster 59 | Monster 60 |
| F | S508 | Monster 61 | Monster 62 | Monster 63 | Monster 64 | Monster 65 | Monster 66 | Monster 67 | Monster 68 | Monster 69 | Monster 70 | Monster 71 | Monster 72 |
| G | S510 | Monster 73 | Monster 74 | Monster 75 | Monster 76 | Monster 77 | Monster 78 | Monster 79 | Monster 80 | Monster 81 | Monster 82 | Monster 83 | Steekproef 84 |
| H | S511 | Monster 85 | Monster 86 | Monster 87 | Monster 88 | Monster 89 | Monster 90 | Monster 91 | Monster 92 | Monster 93 | Monster 94 | Monster 95 | Monster 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Index van verzameling C | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S513 | Voorbeeld 1 | Voorbeeld 2 | Monster 3 | Monster 4 | Monster 5 | Monster 6 | Monster 7 | Monster 8 | Monster 9 | Monster 10 | Monster 11 | Monster 12 |
| B | S515 | Monster 13 | Monster 14 | Monster 15 | Monster 16 | Monster 17 | Monster 18 | Monster 19 | Monster 20 | Monster 21 | Monster 22 | Monster 23 | Monster 24 |
| C | S516 | Monster 25 | Monster 26 | Monster 27 | Monster 28 | Monster 29 | Monster 30 | Monster 31 | Monster 32 | Monster 33 | Monster 34 | Monster 35 | Monster 36 |
| D | S517 | Monster 37 | Monster 38 | Monster 39 | Monster 40 | Monster 41 | Monster 42 | Monster 43 | Monster 44 | Monster 45 | Monster 46 | Steekproef 47 | Monster 48 |
| E | S518 | Monster 49 | Monster 50 | Monster 51 | Monster 52 | Monster 53 | Monster 54 | Monster 55 | Monster 56 | Monster 57 | Monster 58 | Monster 59 | Monster 60 |
| F | S520 | Monster 61 | Monster 62 | Monster 63 | Monster 64 | Monster 65 | Monster 66 | Monster 67 | Monster 68 | Monster 69 | Monster 70 | Monster 71 | Monster 72 |
| G | S521 | Monster 73 | Monster 74 | Monster 75 | Monster 76 | Monster 77 | Monster 78 | Monster 79 | Monster 80 | Monster 81 | Monster 82 | Monster 83 | Steekproef 84 |
| H | S522 | Monster 85 | Monster 86 | Monster 87 | Monster 88 | Monster 89 | Monster 90 | Monster 91 | Monster 92 | Monster 93 | Monster 94 | Monster 95 | Monster 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Index van reeks D | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | Voorbeeld 1 | Voorbeeld 2 | Monster 3 | Monster 4 | Monster 5 | Monster 6 | Monster 7 | Monster 8 | Monster 9 | Monster 10 | Monster 11 | Monster 12 |
| B | S515 | Monster 13 | Monster 14 | Monster 15 | Monster 16 | Monster 17 | Monster 18 | Monster 19 | Monster 20 | Monster 21 | Monster 22 | Monster 23 | Monster 24 |
| C | S516 | Monster 25 | Monster 26 | Monster 27 | Monster 28 | Monster 29 | Monster 30 | Monster 31 | Monster 32 | Monster 33 | Monster 34 | Monster 35 | Monster 36 |
| D | S517 | Monster 37 | Monster 38 | Monster 39 | Monster 40 | Monster 41 | Monster 42 | Monster 43 | Monster 44 | Monster 45 | Monster 46 | Steekproef 47 | Monster 48 |
| E | S518 | Monster 49 | Monster 50 | Monster 51 | Monster 52 | Monster 53 | Monster 54 | Monster 55 | Monster 56 | Monster 57 | Monster 58 | Monster 59 | Monster 60 |
| F | S520 | Monster 61 | Monster 62 | Monster 63 | Monster 64 | Monster 65 | Monster 66 | Monster 67 | Monster 68 | Monster 69 | Monster 70 | Monster 71 | Monster 72 |
| G | S521 | Monster 73 | Monster 74 | Monster 75 | Monster 76 | Monster 77 | Monster 78 | Monster 79 | Monster 80 | Monster 81 | Monster 82 | Monster 83 | Steekproef 84 |
| H | S522 | Monster 85 | Monster 86 | Monster 87 | Monster 88 | Monster 89 | Monster 90 | Monster 91 | Monster 92 | Monster 93 | Monster 94 | Monster 95 | Monster 96 |
Tabel 3. Sjabloon van andere Index regeling
Figuur 2 : Een standaard grafiek gegenereerd met de Ct-waarden van normen. De standaard curve snijpunt en richting waarden gebruiken om te bepalen van de concentratie van de gemiddelde bibliotheek van Ct waarde van monster bibliotheken in duplicaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Statistieken | Standaard waarden | Verkregen waarden (gemiddeld) |
| Opbrengst | 32,5-50 Gb voor mid-uitgang | 42 Gb voor mid-uitgang |
| 100-130 Gb voor high-output | 120 Gb voor high-output | |
| Percentage Q30 | ≥ 75% | 80% |
| Cluster dichtheid | 170-230 K/mm2, optimaal bij 200 K/mm2 | 210 K/mm2. |
| Clusters passeren van Filters | > 70% | 89.09% |
| Intensiteit door cyclus | Boven 1000 voor elke tegel in flowcell | Boven 1500 voor elke tegel in flowcell |
| Foutenpercentage | Onder 1.5 | 1.4 |
Tabel 4. Statistieken voor een standaard volgorde uitgevoerd in Benchtop Sequencer
Figuur 3 : Rangschikking van de Software van de analyse van de gegevens. (A) u een gewenste workflow met inbegrip van de sequentie trimmen maken, toewijzing aan referentie en kwaliteit gebaseerd variant detectie. Werkstroom uitvoeren door het selecteren van FASTQ voorbeeldbestanden (individu of meerdere monsters in batch). (B) lijst van structurele varianten tonen referentiepunt, dekking, nucleotide verandering en aminozuur verandering verkregen voor de analyse van monster sequenties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| 1. trim sequenties | Instelling gebruikt |
| Trim Bases | Standaardinstellingen |
| Filter op lengte met maximum aantal nucleotide in leest | 1000 |
| Filter op lengte met minimum aantal nucleotide in leest | 50 |
| 2. in kaart brengen leest om te verwijzen naar | |
| Referentie geselecteerd | CBS138 |
| Referentie maskeren met maskeren modus | Geen maskeren |
| Opties toewijzen | Standaardinstellingen |
| 3. lokale herschikking | |
| Uitlijningsinstellingen | Standaardinstellingen |
| 4. kwaliteit gebaseerd Variant detectie | |
| Buurt straal | 5 |
| Minimale kloof en mismatch graaf | 2 |
| Minimale buurt kwaliteit | 15 |
| Centrale minimumkwaliteitsnormen | 20 |
| Lezen van filters | Standaardinstellingen |
| Minimale dekking | 4 |
| Variant minimumfrequentie (%) | 75 |
| Variant filters | Standaardinstellingen |
| Maximale verwachte allelen (ploïdie) | 2 |
| Genetische code | Standaard |
Tabel 5. Werkstroom Parameters en instellingen op de Software
| Structurele Variant Nucleotide positie | Gen | Drugs | Gevonden in Aantal Isolaten |
Resistente isolaten | Gevoelig isolaten | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | CA 'S, ANI, MIF | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | CA 'S, ANI, MIF | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | 0 | CMRL-1, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | FLC, POS, VRC, ITR | 3 | CMRL-6 | CMRL-5, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 5 | CMRL-6, CMRL-12 | CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 4 | CMRL-7 | CMRL-1 CMRL-2, CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
Tabel 6. Verslag van structurele variant positie in genen gekoppeld aan antischimmel resistentie gevonden in het aantal isolaten van C. glabrata
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie bepaald haalbaarheid, geschatte tijdlijnen en nauwkeurigheid van de detectie van resistentie in C. glabrataWGS geleide. De draai rond tijd (TAT) voor de voorbereiding van de bibliotheek en sequentiebepaling was vier dagen van en rapportage over resultaten van de geanalyseerde one-two dagen. Dit vergelijkt met ten minste een vergelijkbaar bedrag TAT voor gevoeligheid testen van cultuur platen en Sanger sequencing met aanzienlijk hoger aantal monsters. Ongeveer 30-90 C. glabrata genomen kunnen worden sequenced gebaseerd op stroom-cel capaciteit, met 80-100% dekking van de sequencing rangschikken. Aangezien de sequencing werd uitgevoerd op een in-house WGS laboratorium setup, de kosten/resourcevereisten in deze studie was gelijk aan de huidige kosten van Sanger sequencing en sonde gebaseerde testen met een geraamde kostprijs van AUD 80-100 per monster. Gevoeligheid van alle isolaten werden vastgesteld door een commerciële assay kit die zijn gelezen visueel met een spiegel van de lezing. Cultuur groei werd aangegeven door verandering in de colorimetrische groei indicator van blauw naar roze. MIC werd gelezen als de eerste blauw goed na een reeks van roze (groei) wells dat wil zeggen, de laagste concentratie van het antimycoticum dat aanzienlijk groei remt. Voor WGS, werden genomic DNA bibliotheken opgesteld op basis van de library voorbereiding kit. Het isoleren bibliotheken werden gekwantificeerd door qPCR. De gekwantificeerde bibliotheken werden samen voor de definitieve volgorde uitvoeren uitgevoerd in de benchtop sequencer samengevoegd.
In onze analyse de aanwezigheid van SNPs in genen overdracht van resistentie bij isolaten gecorreleerd goed met de verhoogde in vitro MIC tegen de drugs. De mutatiesS629P in FKS1 en S663P in FKS2 geïdentificeerd waren duidelijk geassocieerd met resistentie te echinocandins. Beide mutaties zijn bekend om te verlenen de fenotypische weerstand29,30. Gelijktijdige sequentiebepaling van het genoom-brede bleek ook mutaties in de genen die verband houden met 5-flucytosine (gene FCY2) en azole weerstand (CgPDR1, CgCDR1 en CgFLR1) die gekoppeld aan weerstand door activering zijn / overexpressie als efflux pompen26,27,28. Echter, de effecten van mutaties in de genen, gekoppeld aan azole en 5-flucytosine weerstand31 moet worden bevestigd door extra functionele analyseert om te beoordelen in hoeverre het gen expressie. Interessant, werden groot aantal SNPs ook gevonden in de celwand adhesines in alle isolaten32,33. Mutaties in adhesie gen EPA6, die de vorming van de biofilm, codeert opgetreden relatief vaak33. Bovendien, isoleert CMRL-3, CMRL-4 en CMRL-8 dat miste mutaties in azole resistentiegenen had geen gedocumenteerde SNPs in EPA1 en EPA624,34. Echter over het algemeen kon geen specifieke verband tussen de SNPs in adhesines en drug MICs worden gevonden vanwege het lage aantal test isolaten opgenomen.
De uitvoeringvan WGS in klinische mycologie vereist de implementatie van robuuste kwaliteit managementsysteem. Hoge kwaliteit genomic DNA en kwaliteitscontrole controlepunten die gepaard gaan met elke stap in het experiment is essentieel voor een goed resultaat voor WGS. De zuiverheid van C. glabrata monster DNA ingediende bibliotheek voorbereiding kan worden gevalideerd met behulp van UV-absorptie-methode (absorptie bij 260/280 nm en 260/230 nm25. In onze ervaring, voor C. glabrata DNA de 260/280 naar verwachting binnen het aanbevolen bereik van 1.8-2 en voor 260/230 tussen 2-2.2. Als DNA-fragmenten niet voldoen aan deze kwaliteitseisen, kan extra zuivering door ethanol neerslag worden uitgevoerd. Tagmentation is een essentiële stap toe te voegen unieke bar code sequenties genaamd index inleidingen zo als differentiatie van meerdere monster tijdens sequencing (multiplexing) inschakelen. Vandaar, in het indexeringsproces, extra voorzichtigheid moet worden gelet dat kruisverontreiniging tussen index buizen en monsters vermeden teneinde de uniciteit van de indexen. Normalisatie in sequencing zorgt ervoor dat eventuele verschillen ontstaan in de DNA voorbeeldbibliotheken die bias in sequencing gegevens introduceren misschien wordt geëlimineerd. Een normalisatie stap met behulp van die een kraal op basis-opschonen kunt meestal verwijdering van overtollige bibliotheek fragmenten van DNA en variaties in de grootte van de bibliotheek die zich tijdens de voorbereiding van de bibliotheek voordoen kan. De 30 min incubatie is daarom essentieel voor optimale cluster dichtheid. Cluster-dichtheid die de dichtheid van de klonen clusters van monster bibliotheken gegenereerd door massale amplificatie tijdens de kwaliteit van de gegevens van de invloeden van de sequencing zoals Q30 scores en totale gegevens output is. Terwijl underclustering hoge datakwaliteit geven kan, het zal ook leiden tot lagere gegevens output overwegende dat overclustering lage Q30 scores. De DNA-bibliotheken moeten vrij zijn van magnetische kraal residu tijdens PCR Schoonmaakbeurt en normalisatie als dat interfereren kan met de rangschikking van de kwaliteit van de gegevens. QPCR moet worden uitgevoerd op ten minste een paar representatieve steekproef bibliotheken, waaronder die van een referentiestam als positieve controle (het ATCC stam van C. glabrata in dit geval) van een bepaalde set van indexcijfers. De gemiddelde Ct-waarden moeten tussen 15-18 cycli. Een monster binnen dit bereik wordt beschouwd als aanvaardbaar voor de sequencing-run. Echter, als de Ct-waarden buiten dit bereik de qPCR moet worden herhaald. Monsters kunnen soms mislukken qPCR hetzij als gevolg van lage kwaliteit input DNA of fout tijdens de voorbereiding van de bibliotheek. Op basis van berekeningen van de positieve controle, moet de minimumconcentratie van de bibliotheken die goede sequencedata produceren zal worden vastgesteld. Met behulp van de gemiddelde concentratie van de bibliotheken qPCR is verkregen, kan de omvang van de definitieve bibliotheek worden toegevoegd voor het rangschikken worden berekend. Dit moet de aanbevolen definitieve bibliotheek concentratie tussen 1,4 - 1.8 pM produceren. Voor C. glabrata Bibliotheken, het gevestigde Ct bereik met behulp van het C. glabrata ATCC isolaat was tussen 16-18 cycli met een gemiddelde bibliotheek concentratiebereik van 300-500 uur. De overeenkomstige hoeveelheid gepoolde gedenatureerde DNA bibliotheken was binnen het bereik van 60-65 µL voor een cluster dichtheid bereik tussen 200-250 K/mm2.
De bestanden met reeksen gegevens moeten worden demultiplexed voor verdere analyse. Dit kan worden bereikt door te sorteren in hun respectieve bibliotheken met behulp van hun streepjescodes nadat sequencing heeft plaatsgevonden. Een optionele stap van kwaliteit trimmen van de bestanden FASTQ kan worden uitgevoerd vóór de gegevensanalyse. De volgorde leest van de isolaten van WGS werden geanalyseerd met behulp van een aangepaste werkstroom die is gemaakt in een standaard software-pakket. Hierdoor trimmen van lage kwaliteit luidt en vervolgens toewijzen aan de verwijzing Candida genoom. Het referentie-genoom, CBS138, was van Candida Genome Database (CGD) gedownload en gekoppeld aan de workflow vóór de analyse. De aanwezigheid van DNA wordt herhaald in het genoom van Candida (bijvoorbeeld antistoffen genen hebben DNA herhalingen) kunnen bemoeilijken de uitlijning van korte-lezen sequenties en de roeping van de SNP. Dit kan worden verbeterd door de extra lokale herschikking van toegewezen sequenties. De uitvoer van de werkstroom was een lijst van structurele varianten die geannoteerde genen voorzien van niet-synoniem synoniem SNP posities en dekking. Dit werd gebruikt voor het identificeren van SNPs in de genen van belang en voorbereiding van het verslag uiteindelijk voor de isolaten (tabel 6).
Sommige beperkingen van onze studie en de aanpak moeten worden erkend. Ons verslag is gebaseerd op een klein aantal isolaten en er geen standaard schimmel resistome database voor klinische mycologie is. Hoewel Sanger DNA sequencing momenteel meer toegankelijk aan klinische laboratoria is, het beperkte mogelijkheid om te detecteren gelijktijdig meerdere genmutaties die medicamenteuse resistentie bij Candida spp. verlenen (> 20 FKS mutaties voor echinocandin weerstand alleen). Met de consolidatie van de diensten van de pathologie en afnemende volgorde kosten, de uitvoerbaarheid van het gebruik van WGS over Sanger sequencing, nog zal toenemen. Een belangrijke overweging is echter de eerste laboratorium setup en de uitvoeringskosten WGS instrument en training voor eindgebruikers van laboratoriumpersoneel. Lange termijn kosten zou in wezen omvatten, aanschaf van sequencing reagens kits en accessoires. Extra kosten en een hogere TAT worden verwacht als de WGS instrument niet in-house. De aanwezigheid van herhalen opeenvolgingen van DNA in het genoom kan bovendien de uitlijning van korte-lezen sequenties en de roeping van de SNP compliceren. De beschikbaarheid van kwalitatief hoogwaardige referentie genomen gesequenceerd met behulp van lange-lezen technologieën zal bijdragen tot het handhaven van de kwaliteit van SNP identificatie.
In de toekomst WGS verwachting om verbeteringen in klinische therapie versneld rapportage destijds in Diagnostische instellingen is gemakkelijk toegankelijk en geïnterpreteerd door clinici20,22. Dit kan worden bereikt met de ontwikkeling van curator en actuele WGS antischimmel drug weerstand databanken van de roman en bevestigende mutaties afleiden antischimmel weerstand. Naarmate meer genoom van klinisch relevante gisten van bekende fenotypische drug gevoeligheid beschikbaar voor analyse, dreigen nieuwe markeringen en mechanismen van resistentie tegen schimmeldodende middelen om ontdekt te worden. Deze ontwikkelingen zullen aanzienlijk risico van behandeling storingen als gevolg van de multi-resistentie en drug toxiciteit. Kortom, kunt de volgende generatie sequencing met passende kwaliteit beheerprotocollen genoom-brede detectie van mutaties overdracht van resistentie bij Candida glabrata die kan vergroten fenotypische testen in mycologie laboratoria. De inzichten die geboden door snelle genoom sequentiebepaling van klinisch relevante Candida spp kunnen fundamenteel ons begrip van de mechanismen van resistentie tot verschillende klassen van antischimmel agenten wijzigen en verbeteren van het beheer van patiënten met invasieve schimmelziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen en geen belangenconflict openbaar te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het centrum voor infectieziekten en microbiologie, volksgezondheid. De auteurs hebben niet ontvangen geen andere financiering voor deze studie. De auteurs bedanken Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann en Ranjeeta Menon voor hun deskundig advies en hulp bij het hele genoom sequencing experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
