Summary
מחקר זה מיושם רצף הגנום כולו עבור ניתוח של מוטציות בגנים היוועצות תרופתיים פטרת, קנדידה glabrata. Glabrata ג מבודד עמידים echinocandins, azoles ו- 5-flucytosine, היו רציף כדי להמחיש את המתודולוגיה. הרגישות פרופילים של מבודד בקורלציה עם נוכחות או היעדרות של המוטציה דפוסי בגנים.
Abstract
קנדידה glabrata יכול לרכוש במהירות מוטציות שגורמות עמידות לתרופות, במיוחד אל azoles ואל echinocandins. זיהוי של מוטציות גנטיות חיוני, כמו ההתנגדות זוהה במבחנה ניתן לעיתים קרובות בקורלציה עם כשלון קליני. בדקנו את הכדאיות של שימוש רצף הגנום כולו (WGS) לניתוח ברמת הגנום של עמידות לתרופות נגד פטריות ב- glabrata ג. המטרה הייתה torecognize נחותות ומחסומים ביישום WGS ומדידת יעילותו. מאמר זה מתאר את בקרת איכות מפתח מחסומים ואת מרכיבים חיוניים של מתודולוגיה WGS לחקור גנטיים המשויכים הרגישות מופחתת סוכני פטריות. זה גם מעריך את הדיוק של ניתוח נתונים, סיבוב סביב הזמן של בדיקות.
הרגישות פנוטיפי של 12 קליני, בקרת האוויר אחד, מזן glabrata ג נקבע באמצעות בדיקות רגישות נגד פטריות. שלושת אלה כלולים לבודד זוגות, של שלושה מטופלים, שהתפתח עלייה בריכוזים מעכבות המינימלי סמים. ב שני זוגות, השני בודד של כל זוג פיתח עמידות echinocandins. בידוד השני בזוג השלישי פיתח עמידות 5-flucytosine. הנותרים מורכבת רגישים ועמיד azole מבודד. פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) גנים הקשורים echinocandin, azole והתנגדות 5-flucytosine היו אישר מבודד עמיד דרך WGS באמצעות רצף הדור הבא. SNPs Non-נרדף בהתנגדות פטריות זוהו גנים כגון FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 , FCY2 . בסך הכל, ממוצע של 98% הקריאות WGS של glabrata ג מבודד למפות את הגנום הפניה עם כיסוי על 75-fold עומק קריאה. משך העבודה והעלות היו דומות סנגר רצף.
לסיכום, WGS של glabrata ג היה ריאלי בגילוי משמעות קלינית מוטציות מעורב ההתנגדות סמים פטריות שונות שיעורים ללא צורך מרובים PCR/DNA רצף תגובות. זה מייצג צעד חיובי לקראת הקמת WGS יכולת במעבדה קלינית לגילוי סימולטני של החלפות ומעניקה עמידות נגד פטריות.
Introduction
קנדידה glabrata הוא הפתוגן יותר ויותר המערכת נתקלה עם חשיבות כמו זן תערוכות ההתנגדות של azoles וכן לאחרונה,2,1,echinocandins3. בניגוד דיפלואידי אלביקנס ג, הגנום הפלואידי של glabrata ג עשוי לאפשר לו לרכוש מוטציות ולפתח עמידות לתרופות מרובות בקלות רבה יותר. ההתנגדות שותף עד שתי הכיתות סמים היה גם דיווח על4. לפיכך, הערכה מוקדמת של פטריות רגישות וזיהוי של עמידות לתרופות ב glabrata ג הוא קריטי עבור גם טיפול נכון, יישוב כמו ההקשר של סדרנות פטריות להגביל את מנהלי ההתקנים של עמידות מיקרוביאלית1 , 5 , 6. הקמת זרימת עבודה יעילה במהירות לזהות הנוכחות של מוטציות מאשרות מקושר סמנים ההתנגדות מבודד עמיד יהיה גם עזרה לשיפור יגרור החלטות התוצאות הקליניות.
הרגישות פטריות מוערך בדרך כלל על ידי מדידת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) אשר מוגדר את ריכוז התרופה הנמוך, שמביאה לירידה משמעותית בצמיחה של מיקרואורגניזם לעומת זה של גידול ללא סמים שליטה. קלינית, מכון תקנים מעבדה (CLSI) ואת הוועדה האירופית-מיקרוביאלית הרגישות בדיקות (EUCAST) יש סטנדרטית הרגישות בדיקות בשיטות כדי להפוך מיקרופון נחישות יותר מדויקים ועקביים7, 8. עם זאת, השירות של מיקרופון פטריות נותר מוגבל במיוחד עבור echinocandins, בפרט לגבי השוואות inter-laboratory היכן מתודולוגיות שונות ותנאים נמצאים בשימוש9. יש גם קורלציה לא בטוח של מיקרופונים עם תגובה לטיפול echinocandin, יכולת להבחין WT (או רגישים) מבודד מאלה מחסה FKS מוטציות (זנים עמידים echinocandin)10,11. למרות הזמינות של מותני יחיד-גן מאשרות ו סנגר רצף של סמני עמידות נגד פטריות, מימוש התוצאות לעיתים קרובות מתעכבת בשל חוסר זיהוי בו זמנית של מספר ההתנגדות סמני5,12. לפיכך, זיהוי בו-זמניות של היוועצות ההתנגדות מוטציות במיקומים שונים בגנום, מופעל על-ידי ניתוח המבוסס על רצף הגנום כולו, מציעה יתרונות רבים על פני לגישות.
הגנום כולו רצף (WGS) יושמה בהצלחה כדי לעקוב אחר העברת המחלה בעת התפרצויות, כמו גם גישה עבור הסיכון הגנום כולו הערכת סמים והתנגדות בדיקות חיידקים ווירוסים13. ההתקדמות בטכנולוגיית רצפי חומצות גרעין הפכו את רצף הגנום כולו (WGS) של פתוגנים קלינית שבידיך התור-מסביב-זמן ריאלי הן מבחינה טכנית והן מבחינה כלכלית. רצפי DNA מציע יתרונות חשובים על פני שיטות אחרות של פתוגן זיהוי ואפיון המועסקים ב מיקרוביולוגיה מעבדות14,15,16. ראשית, הוא מספק פתרון אוניברסלי עם תפוקה גבוהה, מהירות ואיכות. רצף ניתן להחיל על כל מיקרואורגניזמים ומאפשר לגודל במעבדות מקומיים או אזוריים. שנית, הוא מייצר נתונים בתבנית 'העתיד-הוכחה' לבצע השוואה ברמות לאומיים ובינלאומיים. בסופו של דבר, השירות פוטנציאל של WGS ברפואה כבר בתוספת מאת צמיחתם המהירה של בסיסי נתונים ציבורי המכיל הפניה הגנום, אשר יכולה להיות קשורה מסדי נתונים שווה ערך להכיל מטה-נתונים קליניים ואפידמיולוגיים נוספים17 ,18.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את התועלת של WGS לזיהוי סמנים עמידות נגד פטריות מ מבודד קליני של קנדידה spp. 10 , 19 , 20. זאת בעיקר בשל הזמינות של תפוקה גבוהה benchtop סקוונסרים, ביואינפורמטיקה הוקמה צינורות, הפחתת העלות של רצף21,22. היתרון של WGS פטרייתי על סנגר רצף הוא WGS מאפשר רצף של הגנום מרובים בריצה יחיד. בנוסף, WGS של קנדידה הגנום יכול לזהות מוטציות הרומן סמים מטרות, לעקוב אחר ההתפתחות הגנטית, הופעתה של רצף הרלוונטית קלינית-סוגים20,22,23. והכי חשוב, במקרים של התנגדות multidrug מהותי, WGS יכול לסייע בזיהוי מוקדם של מוטציות היוועצות התנגדות לפני טיפול הבחירה22,24.
. בדקנו את הכדאיות של התומכים ב- WGS הקרנה של מוטציות הקשורות תרופתיים לסוגים שונים של סוכני פטריות. אנו מציגים מתודולוגיה ליישום WGS של משתמש הקצה ופרספקטיבות מעבדה מיקולוגיה אבחון. אנו כלולים בניתוח זה לבודד שלושה זוגות תרבותי של שלושה מקרים קליניים נפרדות אשר במבחנה ההתנגדות echinocandins ו- 5-flucytosine שפותחו לאורך זמן בעקבות טיפול נגד פטריות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אין אישור מוסרי היה נדרש עבור מחקר זה.
1. תת-תרבות ו inoculum הכנה קנדידה glabrata
- בחר פאנל של מבודד C.glabrata שילמדו אשר גם לכלול לפחות אחד glabrata ג אמריקאי סוג תרבות אוסף (בקרת האוויר) עם דפוס רגישות ידועה.
- תת-תרבות בידוד על-ידי נגיעה שמושבה בודדת באמצעות לולאה פלסטיק חד פעמיות סטריליות והופעת פסים, על גבי דקסטרוז אגר של Sabouraud (SDA) לוח8.
- דגירה לצלחת SDA במשך 24-48 שעות-35 ° C טהור תרבות של בידוד עם גדילה טובה.
2. קביעת הרגישות פטריות
- שימוש לולאה פלסטיק חד פעמי סטרילי לבחור 4-5 מושבות של-1 מ מ קוטר מתוך טרי subcultured glabrata ג לבודד בצלחת SDA. Resuspend ב 3 מ ל מים מזוקקים סטריליים. מערבבים היטב בעזרת pipetting עדין לקבל השעיה אחיד.
- התאם את צפיפות תא ל 0.5 מקפרלנד ששווה ל עונה 1 פרק 106 5 x 106 תאים למ"ל שימוש דחיסות 8.
- לבצע בדיקות רגישות שימוש assay המסחרי (ראה טבלה של חומרים, ריאגנטים) על כל glabrata ג מבודד ההוראות של היצרן. לפרש את הרגישות של מבודד מבוסס על תוצאות מיקרוגרם של תרופות נגד פטריות בהתאם להנחיות CLSI ולהכין דו ח (טבלה 1)8.
3. מיצוי DNA גנומי עבור רצף
- Resuspend loopful של המושבות מצלחת SDA בוגר טרי ב- 300 µL של 50 מ מ EDTA צינור 1.5 מ.
- להוסיף 40 µL של zymolyase (10 mg/mL) ההשעיה של בעדינות pipet 5 פעמים עד ההשעיה יהיה אחיד.
- דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 h לעכל את דופן התא. מגניב בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- Centrifuge את המתלים ב 14,000 × g למשך 2 דקות, לאחר מכן הסר בזהירות את תגובת שיקוע.
- תמצית הדנ א בעקבות ה-DNA החילוץ ערכת הנחיות (ראה טבלה של חומרים).
- Resuspend חילצה צניפה דנ א ב 50 µL 10 מ מ טריס מאגר (pH 7.5-8.5) במקום המאגר • תנאי המסופק בערכה.
- בדוק את הטוהר של ה-DNA על ידי מדידה של צפיפות אופטית (וייפר)-260/280 ננומטר25.
4. כימות דנ א גנומי
- להכין 1 x טריס EDTA (TE) מאגר המסופק בערכה assay בהתבסס על הנחיות היצרן וזמינותו קרינה פלואורסצנטית (ראה טבלה של חומרים).
- לדלל את דגימת ה-DNA על-ידי הוספת 2 µL µL 98 1 x טה assay מאגר (סופי נפח של 100 µL, גורם לדילול 1:50) בצלחת חד פעמית טוב 96. שלב דילול זה יכול להתבצע באופן ידני באמצעות פיפטה רב-ערוצי או על-ידי אוטומטיים נוזל טיפול תחנת עבודה.
- הכן את המגוון לסטנדרטים באמצעות דילול של למדא דנ א (100 µg/mL) המסופק בערכה assay קרינה פלואורסצנטית (טבלה 2) וכוללים למדידה יחד עם דוגמאות.
- להוסיף 100 µL של הפלורסנט ל 100 µL מדולל דגימות די אן איי של תקנים עבור התגובה. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
- למדוד את זריחה של כל הדגימות בהתאם להנחיות היצרן.
- התווה את עקומת רגיל באמצעות קרינה פלואורסצנטית המקראות ולחשב את הריכוז המקורי של דגימות ה-DNA.
- קבע את עוצמת הקול של ה-DNA ומאגר טריס 10 מ מ (pH 8) שיש להוסיף כדי להתאים את ריכוז הדנ א כדי 0.2 ng/µL.
- לבצע את דילולים הדנ א באמצעות נוזל אוטומטיות טיפול תחנת עבודה. שלב זה יכולה להיות מושגת גם על ידי pipetting ידנית.
5. הכנה ספריית דנ א
הערה: ספריית הכנה ורצף בוצעה בעקבות פרוטוקולים והנחיות היצרן שסופקו על-ידי החברה (איור 1א') (ראה טבלה של חומרים).
- הגברה Tagmentation ו- PCR
- תווית hard-shell 96-ובכן דק קיר צלחת חדשה.
- להוסיף 5 µL של כימות קלט DNA ב 0.2 ng/µL (1 ng סה כ) כל מדגם טוב של הצלחת.
- להוסיף 10 µL מאגר tagmentation ו- µL 5 הגברה מאגר כל DNA המכיל טוב, בעדינות פיפטה לערבב. חותם את הצלחת בחותם צלחת דבק.
- למקם את הצלחת הצנטרפוגה תרמי ולהפעיל את התוכנית הבאה של ה-PCR: 55 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, והחזק -10 מעלות צלזיוס. כאשר המדגם מגיע ל- 10 ° C, פנה/י מיד כדי לנטרל.
- הוסף 5 µL ניטרול המאגר הצלחת לנטרל את התגובה אמפליקון ולאחר בעדינות פיפטה מיקס. לאטום את הצלחת, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- הוסף µL 15 אידקס PCR mastermix את הדגימות.
- להשתמש בתיבת של צינורות פריימר האינדקס הזמינים עבור התקנה של צלחת 96-ובכן בפורמט כך כל מדגם מקבל שילוב ייחודי של מדדים המבוססים על תבנית אינדקס (טבלה 3).
- לארגן את השפופרות פריימר אינדקס בארון צלחת אינדקס (איור 1B) באמצעות הסדר מסופקים בתבנית של טבלה 3 ולהקליט את המיקום של המדדים על התבנית.
- המקום לצלחת tagmentation עם mastermix הוסיף PCR על המדף צלחת אינדקס עם הצינורות אינדקס סדר.
- הכניסו הסדר אופקי על המדף אינדקס אינדקס פריימר 1 צינורות הסדר אנכי, אינדקס פריימר 2 צינורות. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף בזהירות µL 5 של אינדקס תחל כל דגימה.
- החלף בקבוקים הישן של צינורות אינדקס כתרים חדשים כדי למנוע זיהום צולב בין מדדי.
- לאטום את הצלחת באמצעות חומרי איטום צלחת 96-ובכן ברור ולבצע את ה-PCR השני כדלקמן: 95 ° C ל 30 s, 12 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 55 ° C ל 30 s, 72 ° C ל 30 s ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- ניקוי ה-PCR
- להעביר את המוצר PCR עבור ה-PCR-ניקוי, בלוח tagmentation צלחת באר (ראה טבלה של חומרים).
- מערבולת הפתרון beads מגנטי מסחרי (ראה טבלה של חומרים) המבוסס על הוראות היצרן ומוסיפים µL 30 של חרוזים כל מוצר ה-PCR בצלחת באר.
- לנער את הצלחת על מטרף microplate-1800 סל"ד למשך 2 דקות, דגירה בטמפרטורת החדר בלי טלטולים למשך 5 דקות.
- מניחים את הצלחת על דוכן מגנטית למשך 2 דקות עד ניקה תגובת שיקוע.
- למחוק את תגובת שיקוע בזהירות עם לוחית עדיין על הדוכן מגנטי.
- להוסיף 200 µL של אתנול 80% טריות עם הלוחית לדוכן מגנטי.
- דגירה את הצלחת על הדוכן מגנטי עבור 30 s ו בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע את החרוזים.
- חזור על השלב לשטוף שוב ולאפשר את החרוזים מילה נהדרת עבור 15 דקות להסיר עודפי אתנול, אם בכלל.
- הסר את הלוחית של הדוכן מגנטי ולהוסיף µL 52.5 מאגר resuspension החרוזים.
- לנער את הצלחת על מטרף microplate-1800 סל"ד למשך 2 דקות, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות מבלי לרעוד.
- מקם את הצלחת על הדוכן מגנטי ולאפשר את תגובת שיקוע לנקות.
- באמצעות פיפטה רב-ערוצי, בזהירות להעביר 50 µL של תגובת שיקוע מהצלחת ניקוי צלחת hard-shell חדשה.
- ספריית נורמליזציה
- הפשרת ספריית ריאגנטים הנורמליזציה בהתאם להנחיות היצרן (ראה טבלה של חומרים).
- העברה µL 20 של תגובת שיקוע מהצלחת ניקוי צלחת באר חדשה.
- הוסף µL 45 של ההשעיה מגנטי חרוז, לאטום את הצלחת עם סילר לאיטום צלחת.
- לנער את הצלחת על מטרף microplate-1800 סל"ד למשך 30 דקות. הפעם הדגירה הוא קריטי, לא צריך להיות חריגה.
- מניחים את הצלחת על דוכן מגנטית למשך 2 דקות ואשר תגובת שיקוע ניקה (איור 1B).
- להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע במיכל פסולת מסוכנת המתאים עם לוחית עדיין על הדוכן מגנטי.
- הסר את הלוחית של הדוכן מגנטי ולשטוף את החרוזים עם מאגר לשטוף µL 45.
- נתנער לצלחת עם שטיפת מאגר מטרף microplate-1800 סל"ד למשך 5 דקות.
- מניחים צלחת על מעמד מגנטי עבור 2 דקות ותגובת שיקוע להשליך כשיתחיל ברורה.
- הסר את הלוחית של הדוכן מגנטי וחזור בכביסה באמצעות מאגר לשטוף שוב.
- הסר את הלוחית של הדוכן מגנטי, להוסיף 30 µL של 0.1 N NaOH.
- נתנער לצלחת עם 0.1 N NaOH מטרף microplate-1800 rpm עבור 5 דקות ומניחים את הצלחת על הדוכן מגנטית למשך 2 דקות, או עד שהנוזל הוא ברור.
- להוסיף 30 µL • תנאי מאגר כל טוב של צלחת חדשה של ספריית מנורמל הסופי hard-shell 96-ובכן קיר דק.
- להעביר 30 µL של תגובת שיקוע נורמליזציה צלחת צלחת ספריית מנורמל הסופי כדי להפוך הסופי נפח 60 µL. הספריות מוכנים עכשיו היה לסדרם.
- קביעת ריכוז ספריית ה-DNA על ידי qPCR
- להפשיר את mastermix, תחל ותקני המסופק בערכה qPCR בהתאם להנחיות היצרן (ראה טבלה של חומרים).
- לשלב את ה-PCR ריאגנט mastermix ואת פריימר המסופק בערכה qPCR בעקבות הוראות היצרן, aliquots שניתן לאחסן ב-20 ° C.
- כדי לקבוע ריכוז ספריית ה-DNA, לגרום לדילול 1/8000 של ספריות DNA באמצעות מאגר טריס 10 מ מ (pH 8) על-ידי ביצוע לדילול בטחונות (1.5 µL DNA ספריית למאגר טריס 148.5 µL) ואחריו לדילול 1:80 (2 µL של בטחונות למאגר טריס µL 158).
- לנער את הצלחת דילול ב 700 סל ד לפחות 1 דקות, ואז צנטריפוגה ב 14000 × g עבור 1 דקות.
- הכן µL 20 של תגובת ה-PCR סופית על ידי ערבוב 4 µL של ספריית ה-DNA מדולל או תקני ה-DNA ו 16 µL של mastermix.
- לבצע PCR בעקבות הגדרות היצרן thermocycler: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 35 מחזורי 95 ° C עבור s 30 ו- 60 ° C s 45, ואת סופי-65 ° C עד 95 ° C לניתוח עקומת להמיס.
- השג הערכים Ct של דגימת DNA ספריות, תקני thermocycler qPCR.
- ליצור עיקול רגיל מהערך Ct את הסטנדרטים (איור 2). להגדיר את הטווח QC העליון והתחתון מאת ± 3 מחזורים מהממוצע. לדוגמה, אם ערך Ct הינו 13 מחזורים ואז QC הטווח הוא בין 16 ו- 10 מחזורים.
- לקבוע ריכוז ספריית בודדים, ממוצע (ALC) עיקול רגיל ו Ct ערכים.
- לקבוע את עוצמת הקול של ספריות במאגר הכולל (PAL) כדי לשמש מבוסס על חישוב כדלקמן עבור רצף הסופי בהתחשב בעובדה ריכוז ספריית היעד היא בין 1.4 - 1-8 pM.
הערה: ממוצע ריכוז ספריית המתקבל qPCR = ALC; סה כ במאגר ספריות (PAL) = ALC / 2; . שפגע בסימני PAL (DAL) = חבר * 0.666
בהתאם לנפח של דאל זה מעורבב עם מאגר, נמצא הריכוז של ספריית להוסיף לתא זרימה. לדוגמה, אם µL 65 של ספריית מתווסף µL 835 המאגר, ואז מ זה דילול (דיל 1) 195 מתווסף הנפח הכולל של 1300 µL: (65/900) * dnPAL = Dil1
Dil1 * (195/1300) = ריכוז סופי (צריך להיות בין 1.4 - 1-8 pM)
6. ספריית באגירת ורצף יזום של הרצפים (sequencer) Benchtop
- מחסנית ריאגנט הפשרה בהתאם להנחיות היצרן. להוציא תא זרם חדש מחבילת שלה מתוך 4 ° C אחסון ולהביא לטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות לפני רצף. להוציא מחסנית מאגר ומאגר רצף prechill לפני השימוש (ראה טבלה של חומרים).
- להכין ספריה שליטה על ידי ערבוב 5 µL של הספרייה (1 ננומטר) ו µL 5 של 0.2 N NaOH. מערבולת בקצרה דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי denature הספרייה שליטה לתוך גדילי יחיד.
- להוסיף 5 µL של 200 מ"מ טריס-HCl, pH 7 ו מערבולת. להוסיף מאגר רצף prechilled µL 235 ולערבב בעדינות. אמצעי האחסון הכולל הוא µL 250 עם בקרת ספרייה הריכוז הסופי בגיל 20 pM.
- בריכת ספריות ה-DNA על ידי העברת 5 µL של כל ספריה לדוגמה היה לסדרם מהצלחת ספריית מנורמל הסופי לתוך צינור בודד נמוך-bind 1.5 מ.
- להוסיף 30 µL של ספריית במאגר ו 30 µL של 0.2 N NaOH כדי denature ספריות בצינור bind נמוך אחרת.
- מערבולת הנמוכה-bind צינור, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי denature ספריות לתוך גדילי יחיד.
- להוסיף 30 µL של 200 מ מ טריס-HCl, pH 7 צניעותו עם ספריות שפגע בסימני כדי לנטרל. את התגובה.
- הוסף µL 65 של ספריות שפגע בסימני ינוטרלו השעיה µL 835 של מאגר רצף טרום מקורר, מערבולת לערבב היטב.
- צינור bind נמוך הסופי לשלב הבא: 195 µL של ספריות שפגע בסימני מונטסקייה, 1.30 µL שליטה ספריית ו µL 1103.70 רצף המאגר. מערבבים היטב.
- טען את המיקס הסופי בספריה (1300 µL) במקום המיועד לכך שעל מחסנית ריאגנט.
- הגדרת הרצף המנוהל על ידי הזנת פרטי פרוייקט המדגם של הרצפים (sequencer) המיועד באתר, לאחר הנחיות.
- רצף אתחול בעקבות הנחיות. לטעון תא זרימה, ריאגנט מחסנית עם ספריות, המחסנית מאגר benchtop ברצף.
- לתעד את מספרי אצווה של כל ערכות ריאגנט מכלי הדיו המשמשים את הרצף.
7. הנתונים להוריד מאתר רצף
- להוריד קבצים FASTQ בעקבות הוראות היצרן המופיע באתר.
- באיכות טובה בדיקת זה האחוז Q30 ≥ 75% ואשכול צפיפות היא בין K 170-2802 עם אופטימלית-K 200-210/מ מ2 (טבלה 4).
8. רצף נתונים ניתוח
- לייבא קבצים FASTQ של דגימות ברצף חבילת תוכנה משולבת ניתוח הנתונים (ראה טבלה של חומרים).
- ליצור רצף זרימת עבודה בתוכנה על ידי הוספת תכונות מרשימת כלומר זמירה, מיפוי על הפניה (הפניה בחר גנום), ההתכנסות המקומי וניתוח variant (איור 3א) תוך שימוש בהגדרות המפורטות בטבלה 5.
- להפעיל את זרימת העבודה על-ידי בחירת דוגמה אחת או על אצוות מדגם FASTQ קבצים ולשמור קבצי פלט בתיקיות מדגם המיועד.
- להפיק דוח עבור רצף כיסוי עומק, האזורים הממופים רשימה של משתנים מבניים של הגנום (איור 3ב).
- השתמש ברשימת של משתנים מבניים כדי לחפש נוקלאוטיד יחיד-שם נרדף פולימורפיזמים (SNPs) בגנים היוועצות והתנגדות התקפה אלימה.
- להכין דוח על-ידי רישום הסנ פ המיקום, ג'ין, ומספר מבודד עמיד או רגישים (טבלה 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
13 glabrata ג הכוללת glabrata ג מבודד בקרת האוויר 90030 ו-12 מהמעבדה קליניים הפניה מיקולוגיה (מבודד CMRL1 כדי CMRL12), בית החולים Westmead, סידני נחקרו (טבלה 1). אלה כללו שלושה זוגות מבודד CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 ו- CMRL-5/CMRL-6 שהושגו לפני ואחרי טיפול נגד פטריות עם קישורים אפידמיולוגיים ביניהם 24 (טבלה 1).
סנדלי החבלנים נקבעו באמצעות נקודת עצירה הפרשנית CLSI עבור סוכני פטריות תשע. כלומר, שהוא גוסס (השגריר), Anidulafungin (ANI), Micafungin (MIF), קספופונגין (CA), 5-Flucytosine (5-FC), Posaconazole (POS), Voriconazole (VRC), הכסף ( ITR) ואת תהליך הזיקוק (FLC). קנדידה parapsilosis בקרת האוויר 22019 קנדידה krusei בקרת האוויר 6258 שימשו כמו זנים בקרת איכות. בין זוג ולבודד, CMRL-1 ו- CMRL-2, CMRL-2 שנית ולבודד היה עמיד בפני קספופונגין (מיקרופון 8 לעומת 0.12 מ ג/ליטר, טבלה 1). CMRL-2 היה גם מגדיל ביחס דומה בסנדלי החבלנים של anidulafungin ו- micafungin (≥ 0.5 mg/L) וכתוצאה מכך במבחנה עמידות בפני שלושה echinocandins כל24. באופן דומה, בידוד CMRL-4 פיתח עמידות echinocandin מאלה של בידוד CMRL-3 (טבלה 1). בין בני הזוג השלישי, CMRL ולבודד-6 היה מיקרופון 5-flucytosine (> 64 לעומת 0.06 מ ג/ליטר)24. שני זוגות ולבודד אלה היו רגישים/פראי-סוג (WT) סוכני פטריות אחרים שנבדקו. ולבודד CMRL-6 ו CMRL-12 נמצאו להיות עמיד או הלא-WT כל azoles. CMRL-7 היה עמיד ועד תהליך הזיקוק הלא-WT כדי voriconazole (טבלה 1). Glabrata ג 90030 בקרת האוויר מבודד CMRL-8 ל- CMRL-11 היו רגישים רגישים/WT-סוכני פטריות כל24.
WGS של 13 מבודד בוצעה באמצעות הרצפים (sequencer) benchtop. באופן ממוצע, רצף פלט באמצע ריצה, הניב סביב 27-40 ג'יגה נתונים עם שיעור שגיאה בין 0.5-1.4%. האחוז הממוצע Q30 שהושג היה בדרך כלל בסביבות 80-85%. זרימה-תא אשכול צפיפות (K/מ מ2) נע בין 200-250 (טבלה 4). הנתונים הגולמיים רצף ממחקר זה נצברים ב- NCBI רצף קריאה ארכיון (ההזמנות) תחת מספר פרוייקט PRJNA310057. 98% של רצף פעולות הקריאה למפות את הגנום הפניה glabrata ג (זן CBS138) באמצעות ניתוח נתונים משולב ניתוח תוכנה. הממוצע לקרוא עומק כיסוי היה x 75 עם לקרוא את אורך 143-bp. מבנית variant זיהוי מזוהה יותר 50, 000 SNPs לכל לנתק את הממוצע. במיוחד, כאשר מנתחים את זוגות זן CMRL1/CMRL-2, הכולל SNPs מצא על בידוד כל היו סביב 79,000, עבור CMRL-3/CMRL-4, המספר הכולל של SNPs היו סביב 60,000 ועבור CMRL-5/CMRL-6, יותר 56,000 בהשוואה ל- CBS13824. ההבדל הסנ פ בהשוואה בין מבודד בזוג המתח היה פחות מ 25.
בהתבסס על הפרופיל הרגישות של מבודד, ידוע התנגדות סמנים ביולוגיים נבחרו עבור ניתוח24, במיוחד, FKS1, FKS2 , FKS3 (echinocandin ההתנגדות), FCY1 , FCY2 (5- flucytosine ההתנגדות), ו ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 ו CgFLR1 (azole ההתנגדות). הגנים היו בדיקה של מוטציות מוכרות ותדירות הסנ פ המופעים. בלבד-שם נרדף SNPs בגנים עם קריאת עומק סיקור ≥ 20 קרי, באיכות גבוהה SNPs (hq-SNPs) נחקרו באופן ספציפי.
ראוי לציין, זוהו מוטציות FKS הגנום של שני מבודד עמידים echinocandin24. של שני זוגות, מבודד עמידים echinocandin, CMRL-2 טיפח מוטציה יחידה FKS2 S629P ו- CMRL-4, המוטציה FKS2 S663P (טבלה 6). בזוג השלישי, הסנ פ ב- FCY2 (Ala237Thr) נמצא ב- CMRL-5 (5-flucytosine חשופה) ו- CMRL-6 (עמיד) (טבלה 6). עם זאת, SNPs ב FCY2 נמצאו גם אחרים phenotypically-WT מבודד (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24. מבודד CMRL-6, CMRL-12 היו ראויים לציון עבור שלהם עמיד פאן-azole/חדרים-WT תו והיה SNPs CgCDR1 (קידוד azole בזרימת משאבות) והן CgPDR1 (קידוד של גורם שעתוק המסדיר את המשאבות בזרימת) (טבלה 6)26 ,27. הנוכחות של מוטציות בגן גן משאבת בזרימת אחר, CgFLR1 התרחש בשני מבודד azole, רגישים, עמידים azole26,28. חקירה SNPs בתוך ERG9 (קידוד סקוואלן סינתאז) חשף מוטציות אך אין מוטציות. שזוהו ERG1124.
ניתוח WGS גילה גם מרובות-שם נרדף SNPs בגנים קנדידה דופן התא אדהזיה. כלומר, EPA1, EPA6, PWP2 ו PWP5. מוטציות EPA6 היו קיימות ב- 9/12 מבודד. SNPs ב PWP2 ו PWP5 היו גם נוכח מבודד כמעט בכל, מלבד מבודד CMRL-1 CMRL-11-24.
| לבודד | השגריר | ANI | MIF | רשויות אישורים | 5-FC | POS | VRC | ITR | FLC | פרשנות של הרגישות פטריות | גנים היוועצות ההתנגדות המזוהה על-ידי WGS | ||
| CMRL-1 | 0.5 | 0.03 | < 0.008 | 0.12 | < 0.06 | 0.5 | 0.12 | 0.25 | 8 | פגיעים לכל | - | ||
| CMRL-2 | 0.5 | 1 | 1 | 8 | < 0.06 | 0.25 | 0.06 | 0.12 | 4 | עמיד בפני כל echinocandins בלבד | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0.25 | 0.015 | 0.015 | 0.12 | < 0.06 | 1 | 0.25 | 0.5 | 8 | פגיעים לכל | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0.06 | 0.5 | 0.12 | 0.25 | 8 | עמיד בפני כל echinocandins בלבד | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0.12 | 0.015 | 0.12 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 16 | פגיעים לכל | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0.06 | 0.015 | 0.06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | עמיד בפני 5-FC ו- azoles | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0.25 | 0.06 | 0.015 | 0.25 | < 0.06 | 1 | 8 | 0.5 | 256 | עמיד בפני כל azoles בלבד | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0.5 | 0.03 | 0.008 | 0.06 | < 0.06 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 4 | פגיעים לכל | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0.03 | 0.015 | 0.25 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 1 | 16 | פגיעים לכל | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0.03 | < 0.008 | 0.5 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 16 | פגיעים לכל | - | ||
| CMRL-11 | 0.5 | 0.03 | < 0.008 | 0.03 | < 0.06 | 0.5 | 0.25 | 0.5 | 8 | פגיעים לכל | - | ||
| CMRL-12 | 0.5 | 0.03 | 0.015 | 0.06 | < 0.06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | עמיד בפני כל azoles בלבד | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| בקרת האוויר 90030 | 1 | 0.03 | 0.015 | 0.06 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 8 | פגיעים לכל | - | ||
| קיצורים: מיקרופון, הריכוז המעכב המינימלי; השגריר, המפוטריצין; אנני, anidulafungin; ? קייס, קספופונגין; FLC, פלוקונאזול; ITR, הכסף; MIF, micafungin; POS, posaconazole; VRC, voriconazole; 5-FC, 5-flucytosine. | |||||||||||||
טבלה 1- במבחנה הרגישות של 13 קנדידה glabrata מבודד כולל CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 ו- CMRL-5/CMRL-6 לבודד זוגות שהושגו לפני ואחרי טיפול נגד פטריות
| סטנדרטים | ה-DNA נפח רגיל (μL) | מאגר טה X 1 | ריאגנט (μL) | סה כ 96-ובכן צלחת (μL) | ריכוז הדנ א הסופי (ng/mL) |
| Std-פיקו 1 | 8 (DNA סטנדרטי צינור 100 µg/mL) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| Std-פיקו 2 | 10 (מ- Std-פיקו 1) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| Std - פיקו 3 | 5 (מ- Std-פיקו 1) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| Std-פיקו 4 | 2 (מ- Std-פיקו 1) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| Std-פיקו 5 | 10 (Std-פיקו 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| ריק | - | 100 | 100 | 200 | ריק |
בטבלה 2. פרוטוקול להכנת תקנים לדור עיקול רגיל על כימות דנ א
איור 1 . רצף זרימת עבודה: (א) חלוקה לרמות של שלבים עיקריים אנליטי עבור ספריית הכנה ורצף על ברצף benchtop. (B) מרכיבים חשובים להכנת ספריית DNA כגון (משמאל לימין) אינדקס צלחת מתלה להסדר של מדדי במהלך יצירת אינדקס, מתלה מגנטי עם צלחת עמוקה 96-ובכן עבור חרוז מגנטי המבוסס על ניקיון של ספריות ה-DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| אינדקס Set (מוגדרת) |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | דוגמה 1 | דוגמה 2 | דוגמה 3 | דוגמה 4 | דוגמה 5 | דוגמה 6 | דוגמה 7 | דוגמה 8 | מדגם 9 | לדוגמה 10 | דוגמה 11 | מדגם 12 |
| B | S503 | לדוגמה 13 | לדוגמה 14 | דוגמה 15 | דוגמה 16 | מדגם 17 | לדוגמה 18 | לדוגמה 19 | דוגמה 20 | לדוגמה 21 | לדוגמה 22 | דוגמה 23 | לדוגמה 24 |
| C | S505 | לדוגמה 25 | לדוגמה 26 | לדוגמה 27 | לדוגמה 28 | לדוגמה 29 | לדוגמה 30 | לדוגמה 31 | לדוגמה 32 | לדוגמה 33 | לדוגמה 34 | לדוגמה 35 | לדוגמה 36 |
| D | S506 | לדוגמה 37 | לדוגמה 38 | לדוגמה 39 | לדוגמה 40 | לדוגמה 41 | מדגם 42 | לדוגמה 43 | לדוגמה 44 | לדוגמה 45 | לדוגמה 46 | לדוגמה 47 | דוגמה 48 |
| E | S507 | לדוגמה 49 | לדוגמה 50 | לדוגמה 51 | לדוגמה 52 | לדוגמה 53 | לדוגמה 54 | מדגם 55 | לדוגמה 56 | לדוגמה 57 | לדוגמה 58 | לדוגמה 59 | לדוגמה 60 |
| F | S508 | מדגם 61 | מדגם 62 | לדוגמה 63 | דוגמה 64 | מדגם 65 | לדוגמה 66 | לדוגמה 67 | לדוגמה 68 | לדוגמה 69 | לדוגמה 70 | לדוגמה 71 | לדוגמה 72 |
| G | S510 | לדוגמה 73 | לדוגמה 74 | לדוגמה 75 | לדוגמה 76 | לדוגמה 77 | לדוגמה 78 | לדוגמה 79 | מדגם 80 | לדוגמה 81 | לדוגמה 82 | לדוגמה 83 | לדוגמה 84 |
| H | S511 | לדוגמה 85 | לדוגמה 86 | דגימה 87 | דוגמה 88 | לדוגמה 89 | לדוגמה 90 | מדגם 91 | מדגם 92 | 93 לדוגמה | לדוגמה 94 | דוגמה 95 | דוגמה 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| אינדקס קבוצת B | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | דוגמה 1 | דוגמה 2 | דוגמה 3 | דוגמה 4 | דוגמה 5 | דוגמה 6 | דוגמה 7 | דוגמה 8 | מדגם 9 | לדוגמה 10 | דוגמה 11 | מדגם 12 |
| B | S503 | לדוגמה 13 | לדוגמה 14 | דוגמה 15 | דוגמה 16 | מדגם 17 | לדוגמה 18 | לדוגמה 19 | דוגמה 20 | לדוגמה 21 | לדוגמה 22 | דוגמה 23 | לדוגמה 24 |
| C | S505 | לדוגמה 25 | לדוגמה 26 | לדוגמה 27 | לדוגמה 28 | לדוגמה 29 | לדוגמה 30 | לדוגמה 31 | לדוגמה 32 | לדוגמה 33 | לדוגמה 34 | לדוגמה 35 | לדוגמה 36 |
| D | S506 | לדוגמה 37 | לדוגמה 38 | לדוגמה 39 | לדוגמה 40 | לדוגמה 41 | מדגם 42 | לדוגמה 43 | לדוגמה 44 | לדוגמה 45 | לדוגמה 46 | לדוגמה 47 | דוגמה 48 |
| E | S507 | לדוגמה 49 | לדוגמה 50 | לדוגמה 51 | לדוגמה 52 | לדוגמה 53 | לדוגמה 54 | מדגם 55 | לדוגמה 56 | לדוגמה 57 | לדוגמה 58 | לדוגמה 59 | לדוגמה 60 |
| F | S508 | מדגם 61 | מדגם 62 | לדוגמה 63 | דוגמה 64 | מדגם 65 | לדוגמה 66 | לדוגמה 67 | לדוגמה 68 | לדוגמה 69 | לדוגמה 70 | לדוגמה 71 | לדוגמה 72 |
| G | S510 | לדוגמה 73 | לדוגמה 74 | לדוגמה 75 | לדוגמה 76 | לדוגמה 77 | לדוגמה 78 | לדוגמה 79 | מדגם 80 | לדוגמה 81 | לדוגמה 82 | לדוגמה 83 | לדוגמה 84 |
| H | S511 | לדוגמה 85 | לדוגמה 86 | דגימה 87 | דוגמה 88 | לדוגמה 89 | לדוגמה 90 | מדגם 91 | מדגם 92 | 93 לדוגמה | לדוגמה 94 | דוגמה 95 | דוגמה 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| אינדקס סט C | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S513 | דוגמה 1 | דוגמה 2 | דוגמה 3 | דוגמה 4 | דוגמה 5 | דוגמה 6 | דוגמה 7 | דוגמה 8 | מדגם 9 | לדוגמה 10 | דוגמה 11 | מדגם 12 |
| B | S515 | לדוגמה 13 | לדוגמה 14 | דוגמה 15 | דוגמה 16 | מדגם 17 | לדוגמה 18 | לדוגמה 19 | דוגמה 20 | לדוגמה 21 | לדוגמה 22 | דוגמה 23 | לדוגמה 24 |
| C | S516 | לדוגמה 25 | לדוגמה 26 | לדוגמה 27 | לדוגמה 28 | לדוגמה 29 | לדוגמה 30 | לדוגמה 31 | לדוגמה 32 | לדוגמה 33 | לדוגמה 34 | לדוגמה 35 | לדוגמה 36 |
| D | S517 | לדוגמה 37 | לדוגמה 38 | לדוגמה 39 | לדוגמה 40 | לדוגמה 41 | מדגם 42 | לדוגמה 43 | לדוגמה 44 | לדוגמה 45 | לדוגמה 46 | לדוגמה 47 | דוגמה 48 |
| E | S518 | לדוגמה 49 | לדוגמה 50 | לדוגמה 51 | לדוגמה 52 | לדוגמה 53 | לדוגמה 54 | מדגם 55 | לדוגמה 56 | לדוגמה 57 | לדוגמה 58 | לדוגמה 59 | לדוגמה 60 |
| F | S520 | מדגם 61 | מדגם 62 | לדוגמה 63 | דוגמה 64 | מדגם 65 | לדוגמה 66 | לדוגמה 67 | לדוגמה 68 | לדוגמה 69 | לדוגמה 70 | לדוגמה 71 | לדוגמה 72 |
| G | S521 | לדוגמה 73 | לדוגמה 74 | לדוגמה 75 | לדוגמה 76 | לדוגמה 77 | לדוגמה 78 | לדוגמה 79 | מדגם 80 | לדוגמה 81 | לדוגמה 82 | לדוגמה 83 | לדוגמה 84 |
| H | S522 | לדוגמה 85 | לדוגמה 86 | דגימה 87 | דוגמה 88 | לדוגמה 89 | לדוגמה 90 | מדגם 91 | מדגם 92 | 93 לדוגמה | לדוגמה 94 | דוגמה 95 | דוגמה 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| אינדקס סט D | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | דוגמה 1 | דוגמה 2 | דוגמה 3 | דוגמה 4 | דוגמה 5 | דוגמה 6 | דוגמה 7 | דוגמה 8 | מדגם 9 | לדוגמה 10 | דוגמה 11 | מדגם 12 |
| B | S515 | לדוגמה 13 | לדוגמה 14 | דוגמה 15 | דוגמה 16 | מדגם 17 | לדוגמה 18 | לדוגמה 19 | דוגמה 20 | לדוגמה 21 | לדוגמה 22 | דוגמה 23 | לדוגמה 24 |
| C | S516 | לדוגמה 25 | לדוגמה 26 | לדוגמה 27 | לדוגמה 28 | לדוגמה 29 | לדוגמה 30 | לדוגמה 31 | לדוגמה 32 | לדוגמה 33 | לדוגמה 34 | לדוגמה 35 | לדוגמה 36 |
| D | S517 | לדוגמה 37 | לדוגמה 38 | לדוגמה 39 | לדוגמה 40 | לדוגמה 41 | מדגם 42 | לדוגמה 43 | לדוגמה 44 | לדוגמה 45 | לדוגמה 46 | לדוגמה 47 | דוגמה 48 |
| E | S518 | לדוגמה 49 | לדוגמה 50 | לדוגמה 51 | לדוגמה 52 | לדוגמה 53 | לדוגמה 54 | מדגם 55 | לדוגמה 56 | לדוגמה 57 | לדוגמה 58 | לדוגמה 59 | לדוגמה 60 |
| F | S520 | מדגם 61 | מדגם 62 | לדוגמה 63 | דוגמה 64 | מדגם 65 | לדוגמה 66 | לדוגמה 67 | לדוגמה 68 | לדוגמה 69 | לדוגמה 70 | לדוגמה 71 | לדוגמה 72 |
| G | S521 | לדוגמה 73 | לדוגמה 74 | לדוגמה 75 | לדוגמה 76 | לדוגמה 77 | לדוגמה 78 | לדוגמה 79 | מדגם 80 | לדוגמה 81 | לדוגמה 82 | לדוגמה 83 | לדוגמה 84 |
| H | S522 | לדוגמה 85 | לדוגמה 86 | דגימה 87 | דוגמה 88 | לדוגמה 89 | לדוגמה 90 | מדגם 91 | מדגם 92 | 93 לדוגמה | לדוגמה 94 | דוגמה 95 | דוגמה 96 |
טבלה 3- תבנית ההסדר אינדקס שונות
איור 2 : גרף תקן שנוצר עם הערכים Ct של סטנדרטים. השתמש הערכים intercept ו- slope עיקול רגיל כדי לקבוע את הריכוז הממוצע ספריית מהערך Ct של ספריות דוגמה למצב שבו כפילויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מדדים | ערכים סטנדרטיים | הערכים שהתקבלו (ממוצע) |
| תשואות | 32.5-50 Gb עבור פלט בינוני | 42 ג'יגה עבור פלט בינוני |
| 100-130 ג'יגה עבור פלט גבוהה | 120 ג'יגה-בתים עבור פלט גבוהה | |
| אחוז Q30 | ≥ 75% | 80% |
| אשכול צפיפות | 170-230 K/מ מ2, אופטימלי ב-200 אלף/מ מ2 | 210 K/מ מ2. |
| אשכולות עובר מסננים | > 70% | 89.09% |
| עוצמת על ידי מחזור | מעל 1000 עבור כל אריח ב- flowcell | מעל 1500 עבור כל אריח ב- flowcell |
| שיעור שגיאה | להלן 1.5 | 1.4 |
בטבלה 4. מדדי רצף רגיל להפעיל Benchtop הרצפים (sequencer)
איור 3 : קביעת רצף נתונים ניתוח תוכנה. (א) ליצור זרימת עבודה הרצוי, כולל חיתוך רצף, מיפוי הפניה ואת איכות המבוססת על זיהוי משתנה. הפעל זרימת עבודה על-ידי בחירת קבצים לדוגמה FASTQ (ביחיד או דוגמאות מרובות באצווה). (B) רשימה של משתנים מבניים מציג עמדה הפניה, כיסוי, נוקלאוטיד שינוי ושינוי חומצת אמינו השיג עבור אנליזה של רצפים מדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| 1. לקצץ רצפים | הגדרת המשמש |
| לקצץ בסיסים | הגדרות ברירת המחדל |
| לסנן לפי אורך עם מספר מרבי של נוקלאוטיד ב קריאות | 1000 |
| לסנן לפי אורך עם מספר מינימלי של נוקלאוטיד ב קריאות | 50 |
| 2. מיפוי קריאות להפניה | |
| ההתייחסות שנבחרה | CBS138 |
| הפניה מיסוך עם מיסוך מצב | אין המסיכה |
| מיפוי אפשרויות | הגדרות ברירת המחדל |
| 3. ההתכנסות המקומי | |
| הגדרות היישור | הגדרות ברירת המחדל |
| 4. איכות המבוסס על זיהוי משתנה | |
| השכונה רדיוס | 5 |
| ספירת הפער ואת חוסר התאמה מינימלית | 2 |
| איכות השכונה מינימלי | 15 |
| מרכזי איכות מינימלי | 20 |
| מסננים לקריאה | הגדרות ברירת המחדל |
| למינימום כיסוי | 4 |
| תדירות משתנה מינימלי (%) | 75 |
| מסננים משתנה | הגדרות ברירת המחדל |
| אללים המקסימלי הצפוי (פלואידיות) | 2 |
| הקוד הגנטי | תקן |
טבלה 5- זרימת העבודה פרמטרים והגדרות על התוכנה
| המיקום משתנה נוקלאוטיד מבנית | ג'ין | Drug(s) | שנמצאו ב מספר מבודד |
מבודד עמיד | מבודד רגישים | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | MIF CAS, אנני, | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | MIF CAS, אנני, | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | 0 | CMRL-1, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | FLC, POS, VRC, ITR | 3 | CMRL-6 | CMRL-5, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 5 | CMRL-6, CMRL-12 | CMRL-5, CMRL 10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 4 | CMRL-7 | CMRL-1, CMRL-2, CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
טבלה 6- דיווח על המיקום משתנה מבניים גנים הקשורים עמידות לתרופות נגד פטריות נמצאו מספר מבודד של glabrata ג
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה נקבע היתכנות, צירי זמן משוער ודיוק של זיהוי מונחה WGS של עמידות לתרופות ב glabrata ג. זמן טיפול (TAT) כדי להפוך את הספריה הכנת רצף היה ארבעה ימים ודיווח תוצאות שנותחה שתיים ימים. זה משווה עם כמות דומה של פחות TAT על מבחני רגישות בין צלחות לתרבות סנגר רצף עם מספר גבוה משמעותית של דגימות. בסביבות 30-90 glabrata ג הגנום יכול היה לסדרם המבוססת על רצף זרימה-תא קיבולת, עם רצף 80-100% כיסוי. מאז הרצף בוצעה התקנה מעבדה WGS ללא צורך במיקור חוץ, הדרישות עלויות/משאב במחקר זה היה שווה ערך ל העלות הנוכחית של סנגר מבחני רצף, מבוסס על בדיקה עם העלות של 80-100 דולר אוסטרלי עבור דגימה. הרגישות של כל מבודד נקבעו על ידי ערכת וזמינותו המסחרית היו לקרוא באופן חזותי באמצעות מראה קריאה. התרבות הצמיחה היה שצוין על-ידי שינוי ערכי צבע מוחלטים צמיחה מחוון מכחול על ורוד. מיקרופון נקראה כמו הכחול הראשון טוב, אחרי סדרה של ורוד (צמיחה) בארות קרי, הריכוז הנמוך ביותר של סוכן פטריות כי באופן משמעותי מעכב צמיחה. עבור WGS, ספריות DNA גנומי הוכנו באמצעות ערכת הכנה הספרייה. הספריות ולבודד היו לכמת על-ידי qPCR. הספריות כימות היו איחדו יחד על הרצף הסופי לרוץ שבוצעו ב הרצפים (sequencer) benchtop.
בניתוח שלנו, הנוכחות של SNPs בגנים היוועצות עמידות מבודד בקורלציה עם ה מוגברות במבחנה מיקרופון נגד הסמים. מוטציותS629P ב FKS1 ו S663P ב FKS2 זיהה שויכו בבירור התנגדות echinocandins. שתי מוטציות ידועות היטב להתייעץ ההתנגדות פנוטיפי29,30. רצף הגנום כולו סימולטני התגלה גם מוטציות בגנים מקושר 5-flucytosine (ג'ין FCY2) והתנגדות azole (CgPDR1, CgCDR1 ו- CgFLR1) המשויכים ההתנגדות באמצעות הפעלת / ביטוי כמו בזרימת משאבות26,27,28. עם זאת, ההשפעות של מוטציות בגנים מקושר azole ו- 5-flucytosine ההתנגדות31 צרכים להיות מאושרות על ידי נוספים פונקציונלי מנתח כדי להעריך את רמת הביטוי של גנים. מעניין לציין, מספר גדול של SNPs נמצאו גם על קיר התא adhesins ב מבודד כל32,33. מוטציות בגן אדהזיה EPA6, שמקודד ביופילמים, אירעה בתדירות גבוהה יחסית33. בנוסף, מבודד CMRL-3, CMRL-4 ו- CMRL-8 כי חסרה לה מוטציות בגנים ההתנגדות azole היה אין SNPs מתועדים24,של EPA1 ו- EPA6-34. עם זאת, בסך הכל, אין שיוך ספציפי בין SNPs ב מיקרוגרם adhesins התרופות, יכול להימצא עקב מספר נמוך של מבחן מבודד כלול.
מימוש WGS במיקולוגיה הקליניים דורש היישום של מערכת ניהול איכות. באיכות גבוהה גנומית DNA ובקרת איכות המחסומים המלווים כל שלב בניסוי חיוני עבור תוצאה WGS טובה. טוהר glabrata ג דגימת DNA נאספו עבור ספריית הכנה הניתנים לאימות בשיטת ספיגת UV (ספיגת-260/280 nm ו- 260/230 nm25. מניסיוננו, עבור glabrata ג דנ א 260/280 צפוי להיות בתוך הטווח המומלץ של 1.8-2 וגם עבור 260/230 בין 2-2.2. אם ה-DNA תמציות אינן עונות על דרישות איכות אלה, ניתן לבצע טיהור נוסף על ידי משקעים אתנול. Tagmentation הוא צעד חיוני של הוספת ברקוד ייחודי רצפים נקרא מדד תחל כך שיאפשרו בידול מדגם מרובות במהלך רצף (ריבוב). לפיכך, בתהליך יצירת האינדקס, לנקוט משנה זהירות יש לנקוט כדי למנוע זיהום צולב בין צינורות אינדקס ודוגמאות על מנת לשמור על ייחודה של המדדים. נורמליזציה של רצף מבטיחה כי כל ההבדלים הנובעים בספריות הדי מדגם זה אולי להטיה רצף נתונים חוסלה. נורמליזציה שלב באמצעות שחרוז המבוסס על ניקיון בדרך כלל מאפשר הסרה של עודפי שברי ספריית DNA ווריאציות בגודל הספרייה שעלולים להתעורר במהלך הכנת ספריה. לכן הדגירה 30 דקות הוא קריטי עבור צפיפות אשכול אופטימלית. צפיפות אשכול אשר היא הצפיפות של האשכולות המשובטים של ספריות מדגם שנוצר על ידי הגברה מסיבית במהלך רצף איכות הנתונים השפעות כמו Q30 ציונים הכולל נתוני הפלט. בעוד underclustering עשוי לתת איכות הנתונים גבוהה, זה גם תוצאה של נתונים נמוך פלט ואילו overclustering ציונים Q30 נמוכה. ספריות DNA צריך להיות ללא שאריות חרוז מגנטי במהלך ניקוי PCR ונורמליזציה כמו זה יכול להפריע רצף איכות הנתונים. QPCR צריכה להתבצע לפחות כמה ספריות במדגם מייצג כולל זן הפניה כפקד חיובי (בקרת האוויר מזן glabrata ג במקרה זה) מתוך קבוצה מסוימת של מדדים. הערכים Ct הממוצע צריך להיות בין 15-18 מחזורים. דוגמה בטווח הזה נחשב מקובל הפעל רצף. עם זאת, אם הערכים Ct נמצא מחוץ לטווח זה יש qPCR לחזור. דוגמאות יכול לפעמים להיכשל qPCR עקב DNA הקלט באיכות נמוכה או שגיאה או במהלך הכנת ספריה. על סמך חישובים מהפקד חיובית, הריכוז המינימלי של הספריות בהן יהיה לייצר רצף טוב נתונים גלובאלים. באמצעות ריכוז ממוצע של ספריות המתקבל qPCR, הנפח של ספריית הסופי שיתווספו עבור רצף ניתן לחשב. זה צריך לייצר את הריכוז המומלץ ספריית הסופי בין 1.4 - 1-8 pM. עבור ספריות glabrata ג , הטווח Ct הוקמה באמצעות בידוד של בקרת האוויר glabrata ג היה בין 16-18 מחזורים עם טווח הריכוז הממוצע ספריה של 300-500 pM. אמצעי האחסון המתאימים של ספריות DNA שפגע בסימני במאגר היה בטווח של 60-65 µL למגוון צפיפות אשכול בין 200-250 K/מ מ2.
צריך להיות demultiplexed את קבצי הנתונים רצף לפני ניתוח נוסף. זו יכולה להיות מושגת על-ידי מיון לתוך ספריות בהתאמה שלהם באמצעות שלהם ברקודים לאחר רצף התרחש. שלב אופציונלי של איכות זמירה של הקבצים FASTQ יכולה להתבצע לפני ניתוח נתונים. קריאות רצף של מבודד מן WGS נותחו באמצעות זרימת עבודה מותאמת אישית שנוצרו בחבילת תוכנה רגילה. פעולה זו מותרת זמירה הקריאות באיכות נמוכה ומיפוי ואז להפניה קנדידה הגנום. הגנום הפניה, CBS138, הורדה של מסד הנתונים הגנום קנדידה (CGD), מקושרים לזרימת העבודה לפני ניתוח. חוזר על הנוכחות של ה-DNA הגנום קנדידה (לדוגמה, adhesin הגנים יש DNA חזרה) עלול לסבך את היישור של רצפים קצרים-קריאה, דה קולינג הסנ פ. זה ניתן לשפר על ידי מקומיים נוספים העיצוב מחדש של רצפי ממופה. הפלט של זרימת העבודה הייתה רשימה משתנים מבניים סיפק גנים המבואר-שם נרדף, נרדף הסנ פ עמדות, כיסוי. זה שימש כדי לזהות SNPs בגנים עניין ולהכין את דו ח הניתוח הסופי מבודד (טבלה 6).
יש להכיר כמה מגבלות של המחקר ואת הגישה שלנו. הדוח שלנו מבוסס על מספר קטן של מבודד, ויש אין נתונים resistome פטרייתי סטנדרטי עבור מיקולוגיה קליניים. רצפי DNA סנגר אמנם כיום יותר נגיש קליני מעבדות, זה הגביל את היכולת לזהות מוטציות מרובות המקנים עמידות לתרופות ב קנדידה spp. בו זמנית (> 20 מוטציות FKS עבור echinocandin ההתנגדות לבד). עם איחוד של פתולוגיה שירותים ועלויות הפחתת רצף, המעשיות של השימוש WGS מעל סנגר רצף, הוא ככל הנראה יגדל. עם זאת, שיקול חשוב הוא ההתקנה הראשונית מעבדה ואת העלות של יישום כלי WGS וכן שתסכים הכשרת עובדי מעבדה. עלויות לטווח ארוך יכלול בעיקרו של דבר, תקוות גדולות רצף ריאגנט ערכות ואביזרים. עלות נוספת, קעקוע גבוה יותר אמור להיות צפוי אם המכשיר WGS אינה ללא צורך במיקור חוץ. יתר על כן, הנוכחות של רצפי דנ א. אני חוזר תוך הגנום עלול לסבך את היישור של רצפים קצרים-קריאה לבין קריאה הסנ פ. הזמינות של הפניה באיכות גבוהה באמצעות ברצף הגנום הארוך-קריאה טכנולוגיות יסייעו לקיים את האיכות של זיהוי הסנ פ.
בעתיד, WGS צפוי להביא שיפורים בטיפול קליני על ידי מאיץ דיווח זמן הגדרות אבחון זה נגיש בקלות, לפרש על-ידי קלינאים20,22. זו יכולה להיות מושגת עם פיתוח מאגרי אצר ומעודכן WGS תרופה נגד פטריות ההתנגדות של הרומן, מוטציות להסיק עמידות נגד פטריות. כמו עוד הגנומים של שמרים הרלוונטית קלינית של סמים פנוטיפי ידוע הרגישות הופכים לזמינים עבור ניתוח, סמנים חדשניים ומנגנונים של עמידות לתרופות נגד פטריות צפויים להתגלות. התפתחויות אלה יקטינו הסיכונים של הטיפול בכשלים עקב ריבוי תרופתיים ורעילות סמים. לסיכום, רצף הדור הבא עם איכות המתאימה ניהול פרוטוקולים מאפשר זיהוי ברמת הגנום של מוטציות היוועצות עמידות קנדידה glabrata אשר יכול להגדיל פנוטיפי בדיקות במעבדות מיקולוגיה. המסופקים על ידי רצף הגנום מהירה של הרלוונטית קלינית קנדידה spp לתובנות יכול לשנות את ההבנה שלנו של מנגנוני עמידות לסוגים שונים של סוכני פטריות ולשפר את הניהול של חולים עם פולשני ביסודה מחלות פטרייתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים, אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז למחלות זיהומיות, מיקרוביולוגיה, בריאות הציבור. המחברים לא קיבלו כל אחרים מימון למחקר זה. המחברים מודים Drs אלישיה Arnott, נתן בכמן, Ranjeeta מנון על שלהם מומחים יעוץ וסיוע עם הניסוי רצף הגנום כולו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
