Summary
Questo studio ha implementato il sequenziamento del genoma intero per l'analisi di mutazioni in geni che conferiscono resistenza ai farmaci antifungini in glabrata del Candida. Glabrata del c. isolati resistenti agli echinocandine, azoli e 5-flucitosina, sono stati sequenziati per illustrare la metodologia. Profili di predisposizione degli isolati correlata con la presenza o l'assenza di modelli specifici di mutazione nei geni.
Abstract
Glabrata del candida è in grado di acquisire rapidamente le mutazioni che provocano resistenza ai farmaci, soprattutto di azoli ed echinocandine. Identificazione delle mutazioni genetiche è essenziale, come rilevata resistenza in vitro può spesso essere correlata con guasto clinico. Abbiamo esaminato la fattibilità dell'utilizzo di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) per l'analisi del genoma della resistenza ai farmaci antifungini in glabrata del c. L'obiettivo era fattori abilitanti riconoscibili e barriere nell'implementazione WGS e misurarne l'efficacia. Questo documento delinea il punti di controllo chiave di controllo di qualità e componenti essenziali della metodologia WGS per indagare i marcatori genetici associati con ridotta sensibilità agli agenti antifungosi. Si stima anche l'accuratezza dell'analisi dei dati e Disabilita-intorno-periodo di prova.
Fenotipica suscettibilità di 12 clinica e un ceppo ATCC di glabrata del c. è stata determinata attraverso prova antifungosa di predisposizione. Questi tre inclusi isolano coppie, da tre pazienti, che hanno sviluppato aumento nelle concentrazioni inibitorie minime di droga. In due coppie, la seconda isolare ogni coppia ha sviluppato resistenza alla echinocandine. Il secondo isolato della terza coppia sviluppato resistenza alla 5-flucitosina. Il rimanente composto da sensibili e resistenti dell'azolo isolati. Polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) in geni collegati alla resistenza echinocandine, azolici e 5-flucitosina sono stati confermati in isolati resistenti attraverso WGS utilizzando il sequenziamento di nuova generazione. Non-sinonimo SNPs nella resistenza antifungina sono stati identificati geni quali FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 e FCY2 . Nel complesso, una media del 98% del legge WGS degli isolati di glabrata del c. mappati il genoma di riferimento con una copertura di circa 75-fold profondità di lettura. I tempi e i costi erano paragonabili a Sanger sequenziamento.
In conclusione, WGS di glabrata del c. era fattibile nel rivelare le mutazioni di gene clinicamente significativi coinvolti nella resistenza alle classi di farmaci antifungini differenti senza la necessità di più reazioni di PCR/DNA sequencing. Questo rappresenta un passo positivo verso la creazione di capacità WGS nel laboratorio clinico per la rilevazione simultanea di sostituzioni che conferisce resistenza antifungina.
Introduction
Glabrata del candida è un agente patogeno sempre più incontrato con importanza come una specie che esibisce la resistenza per l'azoli e anche più recentemente, a echinocandine1,2,3. A differenza della diploide albicans del c., il genoma aploide di glabrata del c. potrebbe consentirle di acquisire mutazioni e sviluppare resistenza multifarmaco più facilmente. Co-resistenza a entrambe le classi di droga è stato anche segnalato4. Quindi, la valutazione precoce di predisposizione antifungosa e rilevamento di farmaco-resistenza di glabrata del c. è fondamentale per la terapia corretta, mirata anche come nel contesto di stewardship antifungino per limitare i driver della resistenza agli antimicrobici1 , 5 , 6. stabilire un flusso di lavoro efficiente per rilevare rapidamente la presenza di mutazioni conferma collegate ai biomarcatori di resistenza in isolati resistenti sarà anche contribuire a migliorare la prescrizione le decisioni e gli esiti clinici.
Antifungosa di predisposizione è solitamente valutata misurando la concentrazione inibitoria minima (MIC) che è definita come la più bassa concentrazione di farmaco che si traduce in una significativa riduzione nella crescita di un microrganismo paragonato a quello di una crescita di droga-libero controllo. Il Comitato europeo sul test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST) e Laboratory Standards Institute (CLSI) e clinici hanno standardizzato antibiogramma metodi al fine di rendere MIC determinazione più accurata e coerente7, 8. Tuttavia, l'utilità di antimicotico MIC rimane limitata soprattutto per le echinocandine, in particolare per quanto riguarda i confronti interlaboratorio dove diverse metodologie e condizioni sono usate9. C'è anche incerta correlazione dei microfoni con risposta al trattamento echinocandine e incapacità di distinguere WT (o sensibili) isolati da quelli che harboring FKS mutazioni (echinocandine-resistenti)10,11. Nonostante la disponibilità di conferma singolo gene PCRs e Sanger sequenziamento dei marcatori di resistenza antifungina, realizzazione di risultati è spesso in ritardo dovuto alla mancanza di rilevazione simultanea di più resistenza marcatori5,12. Quindi, simultanee rilevazione delle mutazioni che conferiscono resistenza in posizioni diverse nel genoma, attivata dall'analisi di sequenziamento-basata di intero genoma, offre vantaggi significativi rispetto alle attuali approcci.
Tutto il sequenziamento del genoma (WGS) è stato implementato con successo per tenere traccia di trasmissione della malattia durante le epidemie, come pure un approccio per valutazione e test in batteri e virus13di resistenza genoma rischio. Gli avanzamenti recenti nella tecnologia di sequenziamento degli acidi nucleici hanno fatto il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) degli agenti patogeni in clinicamente actionable Disabilita-intorno-tempo sia tecnicamente ed economicamente fattibile. Sequenziamento del DNA offre importanti vantaggi rispetto ad altri metodi di identificazione dell'agente patogeno e caratterizzazione impiegate in laboratori di microbiologia14,15,16. Innanzitutto, fornisce una soluzione universale con qualità, velocità e produttività elevata. L'ordinamento può essere applicata a qualsiasi dei microrganismi e permette economie di scala a laboratori locali o regionali. In secondo luogo, essa produce dati in un formato di 'futuro' suscettibile di confronto a livello nazionale e internazionale. Infine, la potenziale utilità di WGS in medicina è stata aumentata dalla rapida crescita delle basi di dati pubblici contenenti genomi di riferimento, che possono essere collegati alle basi di dati equivalenti che contengono metadati aggiuntivi clinici ed epidemiologici17 ,18.
Recenti studi hanno dimostrato l'utilità di WGS per identificazione di marcatori di resistenza antifungina da isolati clinici di Candida spp. 10 , 19 , 20. questo è principalmente dovuto alla disponibilità di alto-rendimento benchtop sequencer, bioinformatica stabilito condotte e diminuendo il costo di sequenziamento21,22. Il vantaggio di WGS fungine su Sanger sequenziamento è che WGS permette di sequenziamento dei genomi multipli su una singola esecuzione. Inoltre, WGS di genomi di Candida può identificare mutazioni novelle nel target farmacologico, traccia l'evoluzione genetica e tipi di sequenza clinicamente rilevanti20,22,23. La cosa più importante, in caso di resistenza del multidrug intrinseca, WGS può aiutare nella diagnosi precoce delle mutazioni che conferiscono resistenza prima del trattamento selezione22,24.
Qui, abbiamo esaminato la fattibilità dello screening WGS-abilitato per mutazioni associate alla resistenza ai farmaci di diverse classi di agenti antifungini. Vi presentiamo una metodologia per l'implementazione di WGS da micologia diagnostica laboratorio prospettive e degli utenti finali. Abbiamo incluso in questa analisi tre isolare coppie coltivate da tre casi clinici separati in cui in vitro resistenza alla echinocandine e 5-flucitosina sviluppato nel tempo dopo il trattamento antimicotico.
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Protocol
Nessuna approvazione etica è stato richiesto per questo studio.
1. preparazione sottocultura e inoculo per Candida glabrata
- Selezionare un gruppo di C.glabrata isolati da studiare che dovrebbe anche includere almeno un glabrata del c. americano tipo cultura Collection (ATCC) con modello conosciuto di predisposizione.
- Sottocultura isolate toccando una singola Colonia utilizzando un'ansa di plastica monouso sterile e striature su agar di un Sabouraud destrosio (SDA) piastra da8.
- Incubare la piastra SDA per 24-48 h a 35 ° C per coltura pura di isolare con una buona crescita.
2. la determinazione della predisposizione antifungosa
- Utilizzo di un'ansa di plastica monouso sterile per prendere 4-5 colonie di circa 1 mm di diametro da un fresco subcoltivate glabrata del c. isolare il piatto SDA. Risospendere in 3 mL di acqua distillata sterile. Miscelare bene pipettando delicato per ottenere la sospensione uniforme.
- Regolare la densità delle cellule a 0,5 McFarland che equivale a 1 x 106 a 5 x 106 cellule/mL utilizzando un densitometro 8.
- Eseguire test di sensibilità facendo uso di analisi commerciale (Vedi tabella materiali e reagenti) su tutti i c. glabrata isola seguendo le istruzioni del produttore. Interpretare la suscettibilità degli isolati basato su microfoni risultante di droghe antifungose secondo le linee guida CLSI e preparare il rapporto (tabella 1)8.
3. genomic estrazione del DNA per il sequenziamento
- Risospendere una loopful delle colonie da una piastra SDA recente sviluppata in 300 µ l di 50 mM EDTA in una provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere 40 µ l di zymolyase (10 mg/mL) per la sospensione e delicatamente dispensare 5 volte sino ad ottenere una sospensione uniforme.
- Incubare il campione a 37 ° C per 1-2 ore digerire la parete cellulare. Raffreddare a temperatura ambiente per 5 min.
- Centrifugare la sospensione a 14.000 × g per 2 minuti e poi rimuovere con attenzione il sovranatante.
- Estrazione del DNA genomico seguendo linee guida del kit di estrazione del DNA (Vedi tabella materiali).
- Risospendere estratte pellet di DNA in 50 µ l di 10 mM Tris tampone (pH 7.5-8.5) anziché il buffer di eluizione fornito nel kit.
- Controllare la purezza del DNA tramite la misura della densità ottica (od) a 260/280 nm25.
4. genomic quantificazione del DNA
- Preparare un 1x buffer di Tris EDTA (TE) fornito nel kit di dosaggio basato sulle linee guida del produttore per l'analisi di fluorescenza (Vedi tabella materiali).
- Diluire il campione di DNA aggiungendo 2 µ l a 98 µ l di tampone di dosaggio di TE (volume finale di 100 µ l, diluizione fattore 01:50) in un piatto ben 96 monouso: 1x. Questo passaggio di diluizione può essere eseguito manualmente mediante una pipetta multicanale o da workstation di gestione automatizzata di liquidi.
- Preparare la gamma degli standard diluendo la lambda DNA (100 µ g/mL) forniti nel kit di analisi di fluorescenza (tabella 2) e includono per misura insieme campioni.
- Aggiungere 100 µ l di colorante fluorescente a 100 µ l diluito campioni di DNA e gli standard per la reazione. Incubare per 5 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Misurare la fluorescenza di tutti i campioni sulla base degli orientamenti del produttore.
- Tracciare la curva standard utilizzando le letture di fluorescenza e calcolare la concentrazione originale dei campioni del DNA.
- Determinare il volume di DNA e di tampone Tris 10 mM (pH 8) da aggiungere a regolare la concentrazione di DNA a 0,2 ng / µ l.
- Eseguire le diluizioni del DNA utilizzando Gestione workstation automatizzata di liquidi. Questo passaggio può essere ottenuto anche pipettando manuale.
5. DNA libreria preparazione
Nota: Preparazione di biblioteca e sequenziamento è stato effettuato a seguito del produttore protocolli e linee guida fornite dall'azienda (Figura 1A) (Vedi tabella materiali).
- Amplificazione di PCR e Tagmentation
- Etichettare una nuova piastra 96 pozzetti rigida di parete sottile.
- Aggiungere 5 µ l di input quantificati DNA a 0,2 ng / µ l (1 ng in totale) per ogni campione bene della piastra.
- Aggiungere 10 µ l di tampone di tagmentation e 5 µ l di tampone di amplificazione per ogni contenente DNA e pipettare delicatamente per mescolare. Sigillare la piastra con un sigillo di targhetta adesiva.
- Posizionare la piastra in un termociclatore ed eseguire il seguente programma PCR: 55 ° C per 5 min e permanenza a 10 ° C. Quando il campione raggiunge i 10 ° C, procedere immediatamente a neutralizzare.
- Aggiungere 5 µ l di tampone di neutralizzazione alla piastra per neutralizzare la reazione di amplicon e pipettare delicatamente mix. La piastra ed incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere 15 µ l di indicizzazione PCR mastermix ai campioni.
- Utilizzare una scatola di tubi di primer indice disponibili per un setup di formato piastra a 96 pozzetti affinché ciascun campione ottiene una combinazione unica di indici basati sul modello di indice (tabella 3).
- Disporre i tubi di primer Indice Indice piastra rack (Figura 1B) utilizzando l'ordine fornito nel modello di tabella 3 e registrare la posizione degli indici sul modello.
- Posizionare la piastra di tagmentation con aggiunto PCR mastermix sull'indice scolapiatti con i tubi di indice in ordine.
- Mettere tubi di primer 1 indice nella disposizione verticale e indice primer 2 tubi in disposizione orizzontale sulla cremagliera indice. Con attenzione usando una pipetta multicanale, aggiungere 5 µ l di primer indice per ogni campione.
- Sostituire vecchi tappi dei tubi di indice con tappi nuovi per evitare la contaminazione incrociata tra indici.
- Sigillare la piastra con sigillanti piastra 96 pozzetti chiaro ed eseguire la seconda PCR come segue: 95 ° C per 30 s, 12 cicli di 95 ° C per 10 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s e 72 ° C per 5 min.
- Pulizia di PCR
- Trasferire il prodotto PCR per pulizia di PCR, dalla piastra di tagmentation in un piatto profondo-pozzo (Vedi tabella materiali).
- Vortex la soluzione commerciale biglie magnetiche (Vedi tabella materiali) in base alle istruzioni del produttore e aggiungere 30 µ l di perline per ogni prodotto PCR in piastre da profondo.
- Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre a 1800 giri/min per 2 min e incubare a temperatura ambiente senza agitare per 5 min.
- Posizionare la piastra su un supporto magnetico per 2 min, fino a quando il surnatante è cancellata.
- Scartare il surnatante con cautela la piastra ancora sul supporto magnetico.
- Aggiungere 200 µ l di etanolo di 80% preparati al momento con la piastra sul supporto magnetico.
- Incubare la piastra sul supporto magnetico per 30 s e attentamente rimuovere e scartare il supernatante senza le perline.
- Ripetere la fase di lavaggio e consentire le perline per asciugare all'aria per 15 min. Remove etanolo in eccesso se presente.
- Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e aggiungere 52,5 µ l di tampone di risospensione ai talloni.
- Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre a 1800 giri/min per 2 min e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti senza agitazione.
- Posizionare la piastra sul supporto magnetico e consentire il surnatante cancellare.
- Usando una pipetta multicanale, attentamente trasferire 50 µ l del surnatante dalla piastra di pulitura per una nuova piastra rigida.
- Normalizzazione di biblioteca
- Scongelare i reagenti di normalizzazione biblioteca secondo le linee guida del produttore (Vedi tabella materiali).
- Consente di trasferire una nuova piastra profondo 20 µ l del surnatante dalla piastra di pulitura.
- Aggiungere 45 µ l della sospensione di biglie magnetiche e sigillare la piastra con un foglio sigillante.
- Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre a 1800 rpm per 30 min. Questo tempo di incubazione è fondamentale e non deve essere superato.
- Collocare la piastra su un supporto magnetico per 2 min e confermare che il supernatante è cancellata (Figura 1B).
- Rimuovere e scartare il surnatante in un contenitore appropriato di rifiuti pericolosi con la piastra ancora sul supporto magnetico.
- Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e lavare le perle con 45 µ l di tampone di lavaggio.
- Agitare la piastra con il tampone di lavaggio su un agitatore per micropiastre a 1800 rpm per 5 min.
- Collocare la piastra su supporto magnetico per 2 min e scartare supernatante quando diventa chiaro.
- Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e ripetere il lavaggio con tampone di lavaggio.
- Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e aggiungere 30 µ l di 0,1 N NaOH.
- Agitare la piastra con 0,1 N NaOH su un agitatore per micropiastre a 1800 rpm per 5 min e posizionare la piastra sul supporto magnetico per 2 min o fino a quando il liquido è chiaro.
- Aggiungere 30 µ l di tampone di eluizione in ciascun pozzetto di una nuova piastra finale libreria normalizzata rigida trasparente 96 pozzetti a parete sottile.
- Trasferire 30 µ l di supernatante dalla piastra di normalizzazione alla piastra finale libreria normalizzata per rendere il volume finale 60 µ l. Le librerie sono ora pronte per essere ordinati in sequenza.
- Determinazione della concentrazione di DNA biblioteca di qPCR
- Scongelare i mastermix, primer e standard forniti nel kit qPCR secondo le linee guida del produttore (Vedi tabella materiali).
- Combinare la PCR reagente mastermix e primer forniti nel kit qPCR seguendo le istruzioni del produttore e aliquote possono essere conservate a-20 ° C.
- Per determinare la concentrazione di libreria di DNA, preparare una diluizione di 1/8000 delle librerie del DNA tramite tampone Tris 10 mM (pH 8) eseguendo una diluizione di 1: 100 (libreria di DNA 1,5 µ l a 148,5 µ l di tampone Tris) seguita da una diluizione di 1: 80 (2 µ l da 1: 100 a 158 µ l di tampone Tris).
- Agitare la piastra diluizione a 700 giri/min per almeno 1 min e poi Centrifugare a 14000 × g per 1 min.
- Preparare 20 µ l di reazione di PCR finale con 4 µ l di DNA standard o diluito libreria del DNA e 16 µ l di mastermix.
- Eseguire le seguenti impostazioni del produttore nel termociclatore PCR: 95 ° C per 5 min, 35 cicli di 95 ° C per 30 s e 60 ° C per 45 s e finale 65 ° C a 95 ° C per l'analisi della curva di fusione.
- Ottenere i valori di Ct delle norme e librerie di campioni del DNA dal termociclatore qPCR.
- Generare una curva standard dal valore di Ct degli standard (Figura 2). Definire l'intervallo QC superiore e inferiore di ± 3 cicli dalla media. Ad esempio, se il Ct valore medio è di 13 cicli della gamma QC è tra i 16 e 10 cicli.
- Determinare le concentrazioni di individuale e media library (ALC) dalla curva standard e i valori di Ct.
- Determinare il volume di librerie pool totale (PAL) per essere utilizzato sulla base di calcolo indicato di seguito per la sequenza finale, considerando che la concentrazione di libreria target è tra 1.4-13:08.
Nota: Biblioteca di concentrazione ottenuto da qPCR media = ALC; Totale biblioteche pool (PAL) = ALC / 2; Denaturato PAL (DAL) = PAL * 0.666
A seconda del volume di DAL che si mescola con il tampone, è la concentrazione della libreria da aggiungere alla cella di flusso. Ad esempio, se 65 µ l di libreria viene aggiunto a 835 µ l di tampone, quindi da questa diluizione (Dil 1) 195 viene aggiunto ad un volume totale di 1300 µ l: (65/900) * dnPAL = Dil1
Dil1 * (195/1300) = concentrazione finale (dovrebbe essere tra 1.4-13:08)
6. Biblioteca pooling e sequenziamento Initiating nel Sequencer di Benchtop
- Cartuccia di reagente di disgelo secondo le linee guida del produttore. Estrarre una nuova cella di flusso dalla sua confezione da deposito di 4 ° C e portare a temperatura ambiente almeno 30 min prima del sequenziamento. Estrarre la cartuccia di buffer e sequenziamento prechill buffer prima dell'uso (Vedi tabella materiali).
- Preparare una libreria di controlli mescolando 5 µ l di libreria (1 nM) e 5 µ l di 0,2 N NaOH. Vortex brevemente e incubare per 5 min a temperatura ambiente per denaturare la libreria di controlli nei singoli fili.
- Aggiungere 5 µ l di 200 mM Tris-HCl, pH 7 e vortice. Aggiungere 235 µ l di tampone di sequenziamento prechilled e mescolare delicatamente. Il volume totale è di 250 µ l con concentrazione finale di libreria di controllo alle 20 pM.
- Librerie di DNA piscina trasferendo 5 µ l di ciascuna libreria di campioni da sequenziare dalla piastra finale biblioteca normalizzato in una provetta singola bassa-bind 1,5 mL.
- Aggiungere 30 µ l di biblioteca in pool e 30 µ l di 0,2 N NaOH denaturare librerie in un altro tubo di basso bind.
- Vortice il basso-bind tube e incubare per 5 min a temperatura ambiente per denaturare le librerie nei singoli fili.
- Aggiungere 30 µ l di 200 mM Tris-HCl, pH 7 a tubo con librerie denaturate per neutralizzare la reazione.
- Aggiungere 65 µ l di sospensione neutralizzati librerie denaturato e 835 µ l di tampone di sequenziamento pre-refrigerati e vortice per mescolare bene.
- In un tubo finale basso bind combinare i seguenti: 195 µ l da biblioteche denaturati neutralizzati, 1.30 µ l di libreria di controlli e 1103.70 µ l di tampone di sequenziamento. Mescolare bene.
- Caricare il mix finale biblioteca (1300 µ l) nel posto designato sulla cartuccia di reagente.
- Set-up il sequenziamento eseguito inserendo i dettagli di progetto e campione nel Sequencer designato sito Web seguendo le linee guida.
- Avviare sequenziazione seguendo le linee guida. Caricare la cella di flusso, cartuccia di reagente con librerie e buffer nel sequencer di benchtop.
- Registrare i numeri di lotto di tutti i kit di reagenti e cartucce usate nel sequenziamento.
7. dati scaricare dal sito Web di sequenziamento
- Scarica file FASTQ seguendo le istruzioni del produttore fornite sul sito Web.
- Per una buona qualità eseguita verifica che la percentuale Q30 è ≥ 75% e cluster densità è tra 170-280 K/mm2 con ottimale a 200-210 K/mm2 (tabella 4).
8. analisi dei dati di sequenziamento
- Importare file FASTQ di campioni sequenziati in pacchetto software integrato di analisi dei dati (Vedi tabella materiali).
- Creare un flusso di lavoro di sequenziamento nel software aggiungendo funzionalità dall'elenco cioè rifilatura, il mapping a riferimento (riferimento selezionare genoma), riallineamento locale e analisi di variante (Figura 3A) utilizzando le impostazioni elencate nella tabella 5.
- Eseguire il flusso di lavoro selezionando un singolo campione o un batch di file di esempio FASTQ e salvare il file di output in cartelle campione designato.
- Generare report per profondità di copertura di sequenza, regioni mappate ed elenco delle varianti strutturali nel genoma (Figura 3B).
- Elenco delle varianti strutturali consente di cercare non sinonimo singoli polimorfismi del nucleotide (SNPs) in geni che conferiscono resistenza e virulenza.
- Preparare report elencando SNP posizione, gene e numero di isolati resistenti o sensibili (tabella 6).
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Representative Results
Tredici glabrata del c. che comprende gli isolati di glabrata del c. ATCC 90030 e 12 dal laboratorio di riferimento clinico di micologia (isolati CMRL1 a CMRL12), Westmead Hospital, Sydney sono stati studiati (tabella 1). Questi hanno incluso tre paia di isolati CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 e CMRL-5/CMRL-6 ottenuti prima e dopo la terapia antifungosa con nessun correlazioni epidemiologiche tra loro 24 (tabella 1).
I microfoni sono stati determinati utilizzando il punto di interruzione interpretativa CLSI per nove agenti antifungini vale a dire, anfotericina (AMB), anidulafungina (ANI), Micafungin (MIF), Caspofungin (CAS), 5-flucitosina (5-FC), posaconazolo (POS), voriconazolo (VRC), itraconazolo ( ITR) e fluconazolo (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019 e Candida krusei ATCC 6258 erano usati come ceppi di controllo di qualità. Tra la coppia isolata, CMRL-1 e CMRL-2, il secondo isolare CMRL-2 era resistente a caspofungin (MIC 8 vs 0,12 mg/L, tabella 1). CMRL-2 inoltre ha avuto simili aumenti proporzionali nei microfoni di anidulafungina e micafungin (≥ 0,5 mg/L) con conseguente resistenza in vitro a tutti tre echinocandine24. Allo stesso modo, isolato CMRL-4 aveva sviluppato echinocandine resistenza rispetto a quelli di isolare CMRL-3 (tabella 1). Tra la terza coppia isolare CMRL-6 aveva un MIC 5-flucitosina (> 64 contro 0,06 mg/L)24. Entrambe queste coppie isolate erano sensibili/wild-type (WT) ad altri agenti antifungini testati. Isolare CMRL-6 e CMRL-12 sono stati trovati per essere resistenti o non-WT per tutti azoli. CMRL-7 era resistente al fluconazolo e non-WT a voriconazolo (tabella 1). Glabrata del c. ATCC 90030 e isolati CMRL-8 CMRL-11 erano sensibili/WT sensibili a tutti gli agenti antifungini24.
WGS di 13 isolati è stato effettuato usando il sequencer di benchtop. Su una media, una corsa di Mid-uscita sequenziamento, ha reso intorno 27-40 GB di dati con un tasso di errore tra 0,5-1,4%. La percentuale media Q30 ottenuta era solitamente circa 80-85%. La densità di cluster cella di flusso (K/mm2) ha variata fra 200-250 (tabella 4). I dati di prime sequenze da questo studio sono stati depositati presso NCBI sequenza lettura archivio (SRA) sotto il numero del progetto PRJNA310057. 98% di letture mappate il genoma di riferimento di glabrata del c. (ceppo CBS138) attraverso l'analisi nel software di analisi integrata dei dati di sequenziamento. La media di lettura profondità copertura era 75 x con media leggere lunghezza di 143-BP. strutturale variante rilevazione identificati più di 50, 000 SNPs per isolare. In particolare, quando si analizzano le coppie di ceppo CMRL1/CMRL-2, totale SNPs trovati su ogni isolato sono stati di circa 79.000, per CMRL-3/CMRL-4, il numero totale di SNPs era circa 60.000 e per CMRL-5/CMRL-6, più di 56.000 rispetto a CBS13824. La differenza SNP rispetto tra isolati in una coppia di ceppo era inferiore a 25.
Base al profilo di suscettibilità degli isolati, noto resistenza biomarcatori sono stati selezionati per analisi24, in particolare, FKS1, FKS2 e FKS3 (echinocandine resistenza), FCY1 e FCY2 (5- flucytosine resistenza) ed ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 e CgFLR1 (resistenza dell'azolo). I geni sono stati controllati per le mutazioni conosciute e la frequenza delle occorrenze di SNP. Solo non sinonimo SNPs in geni con leggere approfondimenti di ≥ 20 cioè, SNPs di alta qualità (hq-SNPs) in particolare sono stati studiati.
In particolare, sono state identificate FKS mutazioni nel genoma di entrambi isolati resistenti echinocandine24. Delle prime due coppie, gli isolati resistenti echinocandine, CMRL-2 harbored una singola mutazione FKS2 S629P e CMRL-4, la mutazione di FKS2 S663P (tabella 6). Della terza coppia, un SNP in FCY2 (Ala237Thr) è stata trovata in entrambi CMRL-5 (5-flucitosina sensibile) e CMRL-6 (resistente) (tabella 6). Tuttavia, SNPs in FCY2 inoltre sono stati trovati in altri fenotipico-WT isolati (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24. Gli isolati CMRL-6 e CMRL-12 erano notevoli per loro pan-azolici resistente/non-carattere WT e aveva SNPs in CgCDR1 (codifica pompe di efflusso dell'azolo) e CgPDR1 (codifica per il fattore di trascrizione che regolano le pompe di efflusso) (tabella 6)26 ,27. La presenza di mutazioni in un altro gene pompa di efflusso, CgFLR1 si è verificato in entrambi isolati azole-sensibili e resistente agli azolici26,28. Ricerca per SNPs all'interno di ERG9 (codifica lo squalene sintasi) ha rivelato le mutazioni, ma non c'erano nessun mutazioni identificate in ERG1124.
WGS analisi inoltre ha rivelato più non-sinonimo SNPs in geni di adesione di parete cellulare di Candida vale a dire, EPA1, EPA6, PWP2 e PWP5. Le mutazioni di EPA6 erano presenti in 9/12 isolati. SNPs in PWP2 e PWP5 erano inoltre presenti in quasi tutti gli isolati, ad eccezione di isolati CMRL-1 e CMRL-1124.
| Isolare | AMB | ANI | MIF | CAS | 5-FC | POS | VRC | ITR | FLC | Interpretazione di predisposizione antifungosa | Geni che conferiscono resistenza identificato da WGS | ||
| CMRL-1 | 0,5 | 0,03 | < 0,008 | 0.12 | < 0,06 | 0,5 | 0.12 | 0.25 | 8 | Sensibili a tutti | - | ||
| CMRL-2 | 0,5 | 1 | 1 | 8 | < 0,06 | 0.25 | 0,06 | 0.12 | 4 | Resistente a tutte le echinocandine solo | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0.25 | 0,015 | 0,015 | 0.12 | < 0,06 | 1 | 0.25 | 0,5 | 8 | Sensibili a tutti | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0,06 | 0,5 | 0.12 | 0.25 | 8 | Resistente a tutte le echinocandine solo | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0.12 | 0,015 | 0.12 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Sensibili a tutti | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0,06 | 0,015 | 0,06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | Resistente al 5-FC e azoli | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0.25 | 0,06 | 0,015 | 0.25 | < 0,06 | 1 | 8 | 0,5 | 256 | Resistente a tutti i azoles solo | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0,5 | 0,03 | 0,008 | 0,06 | < 0,06 | 0,5 | 0.25 | 0.25 | 4 | Sensibili a tutti | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0,03 | 0,015 | 0.25 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 1 | 16 | Sensibili a tutti | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0,03 | < 0,008 | 0,5 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Sensibili a tutti | - | ||
| CMRL-11 | 0,5 | 0,03 | < 0,008 | 0,03 | < 0,06 | 0,5 | 0.25 | 0,5 | 8 | Sensibili a tutti | - | ||
| CMRL-12 | 0,5 | 0,03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | Resistente a tutti i azoles solo | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0,03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 8 | Sensibili a tutti | - | ||
| Abbreviazioni: MIC, concentrazione minima inibente; AMB, amfotericina B; ANI, anidulafungina; CAS, caspofungin; FLC, fluconazolo; ITR, itraconazolo; MIF, micafungin; POS, posaconazolo; VRC, voriconazolo; 5-FC, 5-flucitosina. | |||||||||||||
Tabella 1. Suscettibilità in vitro di 13 glabrata del Candida isola cui CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 e CMRL-5/CMRL-6 coppie ottenute prima e dopo la terapia antifungosa di isolare
| Standard | Volume Standard di DNA (μL) | 1 tampone di X TE | Reagente (μL) | Totale in piastra a 96 pozzetti (μL) | Concentrazione finale del DNA (ng/mL) |
| STD-Pico 1 | 8 (DNA standard tubo 100 µ g/mL) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| STD-Pico 2 | 10 (da Std-Pico 1) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| STD - Pico 3 | 5 (da Std-Pico 1) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| STD-Pico 4 | 2 (da Std-Pico 1) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| STD-Pico 5 | 10 (Std-Pico 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| In bianco | - | 100 | 100 | 200 | In bianco |
Tabella 2. Protocollo per la preparazione di campioni per la generazione di curva Standard per la quantificazione del DNA
Figura 1 . Flusso di lavoro di sequenziamento: (A) un contorno di analitici principali per la preparazione di biblioteca e sequenziamento su un sequencer di benchtop. (B) componenti importanti per la preparazione di biblioteca del DNA come il (da sinistra a destra) Indice scolapiatti per la disposizione degli indici durante l'indicizzazione e magnetico con piastra a 96 pozzetti profondi per biglie magnetiche base clean-up di librerie del DNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indice Insieme A |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | Campione 1 | Campione 2 | Campione 3 | Campione 4 | Campione 5 | Campione 6 | Campione 7 | Campione 8 | Campione 9 | Esempio 10 | Esempio 11 | Esempio 12 |
| B | S503 | Esempio 13 | Esempio 14 | Esempio 15 | Esempio 16 | Esempio 17 | Campione 18 | Campione 19 | Campione 20 | Campione 21 | Campione 22 | Campione 23 | Campione 24 |
| C | S505 | Campione 25 | Campione 26 | Campione 27 | Campione 28 | Campione 29 | Campione 30 | Campione 31 | Campione 32 | Campione 33 | Campione 34 | Esempio 35 | Campione 36 |
| D | S506 | Campione 37 | Campione 38 | Campione 39 | Campione 40 | Campione 41 | Campione 42 | Campione 43 | Campione 44 | Campione 45 | Campione 46 | Campione 47 | Campione 48 |
| E | S507 | Campione 49 | Campione 50 | Campione 51 | Campione 52 | Campione 53 | Campione 54 | Campione 55 | Campione 56 | Campione 57 | Campione 58 | Campione 59 | Esempio 60 |
| F | S508 | Campione 61 | Campione 62 | Campione 63 | Campione 64 | Campione 65 | Campione 66 | Campione 67 | Campione 68 | Campione 69 | Esempio 70 | Campione 71 | Campione 72 |
| G | S510 | Campione 73 | Campione 74 | Campione 75 | Campione 76 | Campione 77 | Esempio di 78 | Campione 79 | Campione 80 | Campione 81 | Campione 82 | Campione 83 | Campione 84 |
| H | S511 | Campione 85 | Campione 86 | Campione 87 | Campione 88 | Campione 89 | Campione 90 | Campione 91 | 92 di campione | 93 di campione | Campione 94 | Campione 95 | 96 di campione |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indice Set B | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | Campione 1 | Campione 2 | Campione 3 | Campione 4 | Campione 5 | Campione 6 | Campione 7 | Campione 8 | Campione 9 | Esempio 10 | Esempio 11 | Esempio 12 |
| B | S503 | Esempio 13 | Esempio 14 | Esempio 15 | Esempio 16 | Esempio 17 | Campione 18 | Campione 19 | Campione 20 | Campione 21 | Campione 22 | Campione 23 | Campione 24 |
| C | S505 | Campione 25 | Campione 26 | Campione 27 | Campione 28 | Campione 29 | Campione 30 | Campione 31 | Campione 32 | Campione 33 | Campione 34 | Esempio 35 | Campione 36 |
| D | S506 | Campione 37 | Campione 38 | Campione 39 | Campione 40 | Campione 41 | Campione 42 | Campione 43 | Campione 44 | Campione 45 | Campione 46 | Campione 47 | Campione 48 |
| E | S507 | Campione 49 | Campione 50 | Campione 51 | Campione 52 | Campione 53 | Campione 54 | Campione 55 | Campione 56 | Campione 57 | Campione 58 | Campione 59 | Esempio 60 |
| F | S508 | Campione 61 | Campione 62 | Campione 63 | Campione 64 | Campione 65 | Campione 66 | Campione 67 | Campione 68 | Campione 69 | Esempio 70 | Campione 71 | Campione 72 |
| G | S510 | Campione 73 | Campione 74 | Campione 75 | Campione 76 | Campione 77 | Esempio di 78 | Campione 79 | Campione 80 | Campione 81 | Campione 82 | Campione 83 | Campione 84 |
| H | S511 | Campione 85 | Campione 86 | Campione 87 | Campione 88 | Campione 89 | Campione 90 | Campione 91 | 92 di campione | 93 di campione | Campione 94 | Campione 95 | 96 di campione |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indice Set C | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | DONNA S513 | Campione 1 | Campione 2 | Campione 3 | Campione 4 | Campione 5 | Campione 6 | Campione 7 | Campione 8 | Campione 9 | Esempio 10 | Esempio 11 | Esempio 12 |
| B | S515 | Esempio 13 | Esempio 14 | Esempio 15 | Esempio 16 | Esempio 17 | Campione 18 | Campione 19 | Campione 20 | Campione 21 | Campione 22 | Campione 23 | Campione 24 |
| C | S516 | Campione 25 | Campione 26 | Campione 27 | Campione 28 | Campione 29 | Campione 30 | Campione 31 | Campione 32 | Campione 33 | Campione 34 | Esempio 35 | Campione 36 |
| D | S517 | Campione 37 | Campione 38 | Campione 39 | Campione 40 | Campione 41 | Campione 42 | Campione 43 | Campione 44 | Campione 45 | Campione 46 | Campione 47 | Campione 48 |
| E | S518 | Campione 49 | Campione 50 | Campione 51 | Campione 52 | Campione 53 | Campione 54 | Campione 55 | Campione 56 | Campione 57 | Campione 58 | Campione 59 | Esempio 60 |
| F | S520 | Campione 61 | Campione 62 | Campione 63 | Campione 64 | Campione 65 | Campione 66 | Campione 67 | Campione 68 | Campione 69 | Esempio 70 | Campione 71 | Campione 72 |
| G | S521 | Campione 73 | Campione 74 | Campione 75 | Campione 76 | Campione 77 | Esempio di 78 | Campione 79 | Campione 80 | Campione 81 | Campione 82 | Campione 83 | Campione 84 |
| H | S522 | Campione 85 | Campione 86 | Campione 87 | Campione 88 | Campione 89 | Campione 90 | Campione 91 | 92 di campione | 93 di campione | Campione 94 | Campione 95 | 96 di campione |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indice Set D | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | DONNA S513 | Campione 1 | Campione 2 | Campione 3 | Campione 4 | Campione 5 | Campione 6 | Campione 7 | Campione 8 | Campione 9 | Esempio 10 | Esempio 11 | Esempio 12 |
| B | S515 | Esempio 13 | Esempio 14 | Esempio 15 | Esempio 16 | Esempio 17 | Campione 18 | Campione 19 | Campione 20 | Campione 21 | Campione 22 | Campione 23 | Campione 24 |
| C | S516 | Campione 25 | Campione 26 | Campione 27 | Campione 28 | Campione 29 | Campione 30 | Campione 31 | Campione 32 | Campione 33 | Campione 34 | Esempio 35 | Campione 36 |
| D | S517 | Campione 37 | Campione 38 | Campione 39 | Campione 40 | Campione 41 | Campione 42 | Campione 43 | Campione 44 | Campione 45 | Campione 46 | Campione 47 | Campione 48 |
| E | S518 | Campione 49 | Campione 50 | Campione 51 | Campione 52 | Campione 53 | Campione 54 | Campione 55 | Campione 56 | Campione 57 | Campione 58 | Campione 59 | Esempio 60 |
| F | S520 | Campione 61 | Campione 62 | Campione 63 | Campione 64 | Campione 65 | Campione 66 | Campione 67 | Campione 68 | Campione 69 | Esempio 70 | Campione 71 | Campione 72 |
| G | S521 | Campione 73 | Campione 74 | Campione 75 | Campione 76 | Campione 77 | Esempio di 78 | Campione 79 | Campione 80 | Campione 81 | Campione 82 | Campione 83 | Campione 84 |
| H | S522 | Campione 85 | Campione 86 | Campione 87 | Campione 88 | Campione 89 | Campione 90 | Campione 91 | 92 di campione | 93 di campione | Campione 94 | Campione 95 | 96 di campione |
Tabella 3. Modello di indice diverso arrangiamento
Figura 2 : Un grafico standard generato con i valori di Ct degli standard. Utilizzare i valori di intercetta e pendenza della curva standard per determinare la concentrazione media biblioteca dal valore di Ct di librerie di campioni in duplicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Metriche | Valori standard | Valori ottenuti (media) |
| Resa | 32,5-50 Gb per mid-uscita | 42 Gb per mid-uscita |
| 100-130 Gb per ad alto rendimento | 120 Gb per ad alto rendimento | |
| Percentuale Q30 | ≥ 75% | 80% |
| Densità di cluster | 170-230 K/mm2, ottimale a 200 K/mm2 | 210 K/mm2. |
| Cluster passando filtri | > 70% | 89.09% |
| Intensità di ciclo | Sopra i 1000 per ogni piastrella in flowcell | Sopra 1500 per ogni piastrella in flowcell |
| Tasso di errore | Sotto di 1,5 | 1.4 |
Tabella 4. Metriche per un sequenziamento standard eseguito nel Sequencer di Benchtop
Figura 3 : Software di analisi dati di sequenziamento. (A) creare un flusso di lavoro desiderato tra cui taglio di sequenze, mappatura di riferimento e qualità variante rilevazione basata. Eseguire flussi di lavoro selezionando file FASTQ di esempio (individuo o campioni multipli in batch). (B) elenco delle varianti strutturali, mostrando la posizione di riferimento, copertura, cambiamento del nucleotide e cambiamento dell'amminoacido ottenuto per l'analisi delle sequenze del campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 1. tagliare sequenze | Impostazione utilizzata |
| Tagliare basi | Impostazioni predefinite |
| Filtrare su lunghezza con numero massimo di nucleotide in letture | 1000 |
| Filtrare su lunghezza con numero minimo di nucleotide in letture | 50 |
| 2. mappatura letture per fare riferimento a | |
| Riferimento selezionato | CBS138 |
| Mascheramento di riferimento con modalità di mascheratura | Nessun mascheramento |
| Opzioni di mappatura | Impostazioni predefinite |
| 3. locale riallineamento | |
| Impostazioni di allineamento | Impostazioni predefinite |
| 4. qualità variante rilevazione basata | |
| Raggio di vicinato | 5 |
| Conteggio minimo divario e mancata corrispondenza | 2 |
| Qualità minima vicinato | 15 |
| Minimi di qualità centrali | 20 |
| Leggere filtri | Impostazioni predefinite |
| Copertura minima | 4 |
| Frequenza minima variante (%) | 75 |
| Filtri di varianti | Impostazioni predefinite |
| Massima prevista di alleli (ploidia) | 2 |
| Codice genetico | Standard |
Tabella 5. I parametri del flusso di lavoro e impostazioni del Software
| Posizione del Nucleotide variante strutturale | Gene | Droghe | Trovato in Numero di Isolati |
Isolati resistenti | Isolati sensibili | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | CAS, ANI, MIF | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | CAS, ANI, MIF | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | 0 | CMRL-1, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | FLC, POS, VRC, ITR | 3 | CMRL-6 | CMRL-5, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 5 | CMRL-6, CMRL-12 | CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 4 | CMRL-7 | CMRL-1, CMRL-2, CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
Tabella 6. Rapporto di posizione variante strutturale in geni collegati alla resistenza ai farmaci antifungini trovata il numero di isolati di glabrata del c.
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Discussion
Questo studio ha determinato la fattibilità, sequenze temporali approssimativo e precisione di rilevazione WGS-Guida di farmaco-resistenza di glabrata del c. Il tempo di consegna (TAT) per la preparazione di biblioteca e il sequenziamento è stato quattro giorni e la segnalazione di uno-due giorni risultati analizzati. Ciò confronta con almeno una quantità simile TAT per i test di suscettibilità da piastre di coltura e Sanger sequenziamento con significativamente più alto numero di campioni. Circa 30-90 c. glabrata del genoma può essere sequenziata basato su capacità di cella di flusso, con 80-100% di copertura di sequenziamento di sequenziamento. Poiché il sequenziamento è stato effettuato su un'installazione di laboratorio WGS in-House, i requisiti di costi/risorse in questo studio era equivalente a costi correnti di Sanger saggi basati su sonda e sequenziamento con un costo stimato di 80-100 AUD per campione. Predisposizione di tutti gli isolati sono stati determinati mediante un kit di analisi commerciali che sono state lette visivamente utilizzando uno specchio di lettura. Crescita della coltura è stata indicata da cambiamento nell'indicatore colorimetrico crescita dal blu al rosa. MIC è stato letto come il primo blu ben dopo una serie di rosa (crescita) pozzi vale a dire, la più bassa concentrazione dell'agente antifungino che sostanzialmente inibisce la crescita. Per WGS, librerie di DNA genomic sono state preparate utilizzando il kit di preparazione di libreria. Le librerie di isolare sono state quantificate da qPCR. Le librerie quantificate sono state riunite insieme per il sequenziamento finale eseguito eseguito nel sequencer benchtop.
Nella nostra analisi, la presenza di polimorfismi in geni che conferiscono resistenza negli isolati hanno correlato bene con la sopraelevata in vitro MIC contro le droghe. Le mutazioniS629P in FKS1 e S663P in FKS2 identificati sono state associate chiaramente con la resistenza a echinocandine. Entrambe le mutazioni sono ben note per conferire resistenza fenotipica29,30. Simultanea sequenziamento del genoma ha rivelato anche le mutazioni in geni collegati alla resistenza dell'azolo (CgPDR1, CgCDR1 e CgFLR1) e 5-flucitosina (gene FCY2) che sono associate con resistenza attraverso l'attivazione / sovraespressione come pompe di efflusso26,27,28. Tuttavia, gli effetti delle mutazioni in geni collegati alla azolici e 5-flucitosina resistenza31 deve essere confermata da ulteriori funzionale analizza per valutare il livello di espressione genica. Interessante, il gran numero di SNPs inoltre sono stato trovato nella parete cellulare adesine in tutti gli isolati32,33. Mutazioni nel gene EPA6, che codifica per la formazione di biofilm, di adesione si sono verificati relativamente frequentemente33. Inoltre, isola CMRL-3, CMRL-4 e CMRL-8 che mancava mutazioni in geni di resistenza del azole non avevano nessun SNPs documentata in EPA1 ed EPA624,34. Tuttavia, nel complesso, non può essere trovato alcuna associazione specifica tra gli SNPs nei microfoni adesine e droga causa il basso numero di isolati di prova inclusa.
L'implementazione di WGS in micologia clinica richiede l'implementazione del sistema di gestione qualità robusta. Alta qualità genomic del DNA e controllo di qualità i checkpoint che accompagnano ogni passaggio nell'esperimento è essenziale per un buon risultato WGS. La purezza di DNA campione, glabrata del c. presentato per la preparazione di libreria possa essere convalidati utilizzando il metodo di assorbanza UV (assorbanza a 260/280 nm e 260/230 nm25. Nella nostra esperienza, per glabrata del c. DNA 260/280 dovrebbe essere all'interno della gamma raccomandata di 1,8-2 e per 260/230 tra 2-2.2. Se gli estratti del DNA non si soddisfano questi requisiti di qualità, ulteriore purificazione dalla precipitazione dell'etanolo può essere effettuata. Tagmentation è un passo essenziale dell'aggiunta di sequenze di codice a barre univoco chiamano primer indice così come attivare differenziazione del campione più durante la sequenziazione (multiplexing). Quindi, nel processo di indicizzazione, supplementare deve fare attenzione per evitare contaminazioni tra campioni e tubi di indice al fine di mantenere l'unicità degli indici. Normalizzazione nel sequenziamento assicura che eventuali differenze nelle librerie di DNA campione che potrebbero introdurre la polarizzazione in dati di sequenziamento è eliminato. Un passaggio normalizzazione utilizzando che un branello basata clean-up solitamente permette la rimozione di frammenti di DNA biblioteca in eccesso e le variazioni nella dimensione di biblioteca che può sorgere durante la preparazione della biblioteca. Pertanto l'incubazione di 30 min è fondamentale per la densità ottimale cluster. Densità di cluster che è la densità dei glomeruli clonale di librerie di campioni generate da massiccia amplificazione durante la qualità dei dati di sequenziamento influenze come Q30 punteggi e uscita dati totale. Mentre underclustering potrebbe dare elevata qualità dei dati, comporterà anche l'uscita considerando che overclustering punteggi bassi Q30 inferiore di dati. Le librerie di DNA devono essere privi di residui di biglie magnetiche durante la pulizia di PCR e la normalizzazione come che possono interferire con la qualità dei dati di sequenziamento. QPCR deve essere eseguita su almeno alcune librerie di campione rappresentativo, compreso un ceppo di riferimento come controllo positivo (ceppo ATCC di glabrata del c. in questo caso) da un particolare insieme di indici. I valori medi di Ct dovrebbero essere tra i cicli di 15-18. Ogni campione all'interno di questa gamma è considerato accettabile per l'esecuzione di sequenziamento. Tuttavia, se i valori di Ct sono fuori di questo intervallo la qPCR deve essere ripetuto. Campioni non riesca a volte qPCR a causa del DNA di input di bassa qualità o errore durante la preparazione della biblioteca. Basato su calcoli da controllo positivo, occorre stabilire la concentrazione minima delle librerie che consentono di ottenere dati di sequenza buona. Utilizzando la concentrazione media delle librerie ottenuti da qPCR, può essere calcolato il volume della libreria finale da aggiungere per il sequenziamento. Questo dovrebbe produrre la concentrazione consigliata biblioteca finale tra 1.4-13:08. Per le librerie di glabrata del c. , la consolidata gamma di Ct usando l'isolato ATCC glabrata del c. era tra i cicli di 16-18 con una gamma di concentrazione media biblioteca di 300-500 pM. Il volume corrispondente di librerie di DNA denaturate pool era all'interno della gamma di 60-65 µ l per una gamma di densità di cluster tra 200-250 K/mm2.
I file di dati di sequenza dovrebbero essere demultiplexing prima di un'ulteriore analisi. Ciò può essere ottenuto ordinando nelle loro rispettive librerie utilizzando i codici a barre dopo sequenziamento ha avuto luogo. Un passaggio facoltativo di trimming di qualità dei file FASTQ può essere eseguito prima dell'analisi dei dati. Le letture di sequenza degli isolati da WGS sono state analizzate utilizzando un flusso di lavoro personalizzato creato in un pacchetto software standard. Questo ha permesso di rifilatura di letture di bassa qualità e quindi il mapping al riferimento del genoma Candida . Il genoma di riferimento, CBS138, è stato scaricato da Candida Genome Database (CGD) e collegato al flusso di lavoro prima dell'analisi. La presenza di DNA si ripete nel genoma Candida (per esempio, adesina geni hanno DNA ripetizioni) può complicare l'allineamento delle sequenze di lettura breve e la chiamata di SNP. Questo può essere migliorato da ulteriore locale riallineamento delle sequenze mappate. L'output del flusso di lavoro era una lista di varianti strutturali che ha fornito i geni annotati con non-sinonimo sinonimo posizioni SNP e copertura. Questo è stato utilizzato per identificare SNPs in geni di interesse e preparare la relazione finale di analisi per gli isolati (tabella 6).
Alcune limitazioni del nostro studio e l'approccio dovrebbero essere riconosciuti. Il nostro rapporto si basa su un piccolo numero di isolati e non c'è nessun database standard resistome fungine per micologia clinica. Sebbene il sequenziamento del DNA Sanger è attualmente più accessibile ai laboratori clinici, ha limitate capacità di rilevare contemporaneamente molteplici mutazioni che conferiscono resistenza ai farmaci in Candida spp. (> 20 FKS mutazioni per echinocandine resistenza da solo). Con il consolidamento dei servizi di patologia e diminuzione costi di sequenziamento, la praticità di utilizzo di WGS su Sanger sequenziazione, è destinato ad aumentare. Tuttavia, una considerazione importante è l'installazione iniziale del laboratorio e costi di implementazione dello strumento WGS nonché la formazione degli utenti finali del personale di laboratorio. Costi a lungo termine sarebbero essenzialmente includono, procurarsi il kit di reagenti di sequenziamento e accessori. Costo aggiuntivo e un TAT superiore dovrebbe essere previsto se lo strumento WGS non è in casa. Inoltre, la presenza di ripetere sequenze di DNA nei genomi può complicare l'allineamento delle sequenze di lettura breve e la chiamata di SNP. La disponibilità di riferimenti di alta qualità genomi sequenziati mediante lettura lunga tecnologie aiuteranno a sostenere la qualità di identificazione SNP.
In futuro, WGS è previsto per portare miglioramenti nella terapia clinica di fast-tracking report ora in impostazioni di diagnostica che è facilmente accessibile e interpretato dai clinici20,22. Ciò sarà possibile con lo sviluppo di database di resistenza di farmaco antifungino curati e aggiornati WGS di romanzo e mutazioni conferma di dedurre resistenza antifungina. Come altri genomi di lieviti clinicamente rilevanti di sensibilità ai farmaci fenotipica noti diventano disponibili per l'analisi, nuovi marcatori e meccanismi di resistenza ai farmaci antifungini sono suscettibili di essere scoperto. Questi sviluppi potranno di ridurre considerevolmente i rischi di guasti di trattamento a causa di multi farmacoresistenza e della tossicità dei farmaci. In conclusione, il sequenziamento di nuova generazione con protocolli di gestione di qualità adeguata consente il rilevamento di genoma di mutazioni che conferiscono resistenza a glabrata del Candida che può aumentare fenotipica test nei laboratori di micologia. Le intuizioni fornite dal sequenziamento del genoma rapida di clinicamente rilevanti Candida spp possono radicalmente cambiare la nostra comprensione dei meccanismi di resistenza a diverse classi di agenti antifungini e migliorare la gestione dei pazienti con dilagante malattie fungine.
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Disclosures
Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari e nessun conflitto di interessi di divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal centro per le malattie infettive e microbiologia, salute pubblica. Gli autori non hanno ricevuto altri finanziamenti per questo studio. Gli autori ringraziano Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann e Ranjeeta Menon per la loro consulenza e assistenza con l'esperimento di sequenziamento del genoma intero.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
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