Summary
Это исследование реализован всего генома для анализа мутаций в генах, присвоении противогрибковым препаратам в Candida glabrata. C. glabrata изолятов устойчивых к echinocandins, азолов и 5-флуцитозин, были упорядочены для иллюстрации методологии. Восприимчивость профили изолятов, связаны с наличием или отсутствием структур конкретных мутаций в генах.
Abstract
Кандида glabrata можно быстро приобрести мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости, особенно для азолов и echinocandins. Определение генетических мутаций имеет важное значение, как сопротивление обнаруженные в vitro часто может быть соотнесена с клинической недостаточностью. Мы изучили возможность использования всего генома (РГ) для анализа генома общесистемной противогрибковым препаратам в C. glabrata. Цель была и создают условия и препятствия в осуществлении WGS и оценивать ее эффективность. В этом документе изложены основные качества контроля контрольно-пропускных пунктов и основных компонентов WGS методологии для изучения генетических маркеров, связанные с уменьшенной восприимчивости к противогрибковых препаратов. Она также оценивает точность анализа данных и поворот вокруг времени тестирования.
Фенотипические восприимчивость 12 клинических и один ATCC штамм C. glabrata был определен путем противогрибковые восприимчивость тестирования. Эти включены три изолировать пар, из трех пациентов, разработанные рост минимальный тормозной концентрации наркотиков. В две пары второй изолировать каждой пары разработан сопротивления echinocandins. Второй изолировать третьей пары развилась устойчивость к 5-флуцитозин. Оставшиеся состоит из восприимчивых и устойчивостью азол изолятов. Единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генов, связанных с echinocandin, азол и 5-флуцитозин сопротивления были подтверждены в устойчивые изолятов через WGS, с помощью следующего поколения последовательности. Non синоним ОНП в противогрибковые сопротивления, были определены гены как FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 и FCY2 . В целом, в среднем 98% говорится WGS изолятов C. glabrata , сопоставляются с геном ссылку с охватом около 75-fold чтения глубины. Сроки и стоимость, были сопоставимы с Сэнгер последовательности.
В заключение WGS C. glabrata было возможно в выявление мутаций гена клинически, участвующих в сопротивлении классов различных противогрибковый препарат без необходимости использования нескольких последовательности реакций ПЦР/ДНК. Это представляет собой позитивный шаг на пути к созданию WGS возможности в клинической лаборатории для одновременного обнаружения противогрибковые сопротивления присвоении замен.
Introduction
Кандида glabrata это все чаще встречающихся возбудителя с значение как вид, который проявляет устойчивость к азолов, а также совсем недавно,1,echinocandins,2,,3. В отличие от диплоидных C. albicansгаплоидным геномом C. glabrata может позволить ему приобрести мутации и более легко развить множественной лекарственной устойчивости. Совместное сопротивление для обоих классов наркотиков был также сообщили4. Таким образом ранние оценки противогрибковые восприимчивости и выявления лекарственной устойчивости в C. glabrata имеет решающее значение для правильного, целевые терапии в контексте противогрибковые руководством ограничить водителей антибиотикорезистентности1 , 5 , 6. Создание эффективного рабочего процесса быстро обнаружить наличие подтверждающих мутаций, связанных с Сопротивления биомаркеров в устойчивые изолятов будет также поможет улучшить предписывающих решениях и клинические исходы.
Противогрибковые восприимчивости обычно оценивается путем измерения минимальный тормозной концентрации (MIC), которая определяется как низкая концентрация препарата, что приводит к значительному сокращению темпов роста по сравнению с немедикаментозными роста микроорганизма управления. Клинические и лабораторные стандарты Института (CLSI) и Европейского комитета по тестирования по антимикробной чувствительности (EUCAST) имеют стандартизированные методы испытаний для определения MIC восприимчивости более точной и последовательной в7, 8. Однако утилита противогрибковые MIC остается ограниченным особенно для echinocandins, в частности отношении межлабораторных сравнений различных методологий и условия которых используются9. Существует также неопределенной корреляции с ответом на лечение echinocandin и неспособность отличить WT Мико (или подверженных) изоляты от тех, кто укрывает FKS мутации (echinocandin устойчивые штаммы)10,11. Несмотря на наличие подтверждающих сингл ген ГКДЗ и Сэнгер последовательности противогрибковые сопротивление, реализация результатов часто задерживается из-за отсутствия одновременного обнаружения нескольких сопротивления маркеры5,-12. Следовательно параллельных обнаружения сопротивления вручение мутаций в разных местах в геноме, включаемые на основе последовательности анализа всего генома, предлагает значительные преимущества в сравнении с текущими подходами.
Весь геном последовательности (РГ) успешно реализованы для отслеживания передачи болезни во время вспышек, а также подход для генома общесистемного риска оценки и наркотиков сопротивления, тестирование в13бактерий и вирусов. Последние достижения в технологии секвенирование нуклеиновой кислоты сделали всего генома (РГ) патогенов в клинически осуществимое поворот вокруг времени технически и экономически осуществимы. Секвенирования ДНК обеспечивает важные преимущества по сравнению с другими методами идентификации возбудителя и характеристика, занятых в микробиологии лаборатории14,,1516. Во-первых он обеспечивает универсальное решение с высокой пропускной способностью, скорость и качество. Последовательность может быть применен к любой из микроорганизмов и позволяет масштаба на местных или региональных лабораторий. Во-вторых он производит данные в формате «будущее» поддаются сравнения на национальном и международном уровнях. Наконец был увеличен потенциальной полезности WGS в медицине быстрый рост общественного данных баз, содержащих ссылку геномов, которые могут быть связаны с базы эквивалентных данных, которые содержат дополнительные метаданные клинических и эпидемиологических17 ,18.
Недавние исследования продемонстрировали полезность WGS для идентификации противогрибковые сопротивления маркеров из клинических изолятов Candida spp. 10 , 19 , 20. это главным образом объясняется наличие высокой пропускной способностью benchtop секвенсеры, установленным биоинформатики трубопроводов и снижается стоимость секвенирования21,22. Преимущество грибковых WGS Сэнгер, последовательности, что РГ позволяет секвенирования геномов несколько на один запуск. Кроме того РГ Candida геномов может идентифицировать новые мутации в наркотиков цели, отслеживать генетической эволюции и появление клинически значимых типов последовательности20,,2223. Самое главное в случае внутренней множественной лекарственной устойчивости, WGS может помочь раннего выявления мутаций присвоении сопротивления до лечения выбор22,24.
Здесь мы изучили возможности WGS-поддержкой скрининга для мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью к различным классам противогрибковых препаратов. Мы представляем методологии для осуществления WGS с точки зрения лабораторных диагностических микология и конечных пользователей. Мы включили в этот анализ, что три изолировать пар, культивированный из трех отдельных клинических случаев, в которых в vitro устойчивость к echinocandins и 5-флуцитозин разработаны со временем, после противогрибковое лечение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для этого исследования требовалось не этические утверждения.
1. субкультуры и посевные подготовка Candida glabrata
- Выберите группу изолятов C.glabrata быть изучены, которые также должны включать по крайней мере один C. glabrata американский тип культуры коллекции (ЦУВД) с известными восприимчивость узором.
- Субкультура изолят, прикоснувшись единую колонию с использованием стерильных одноразовых пластиковых цикла и мелирование на Sabouraud декстроза агар (SDA) пластины8.
- Инкубируйте пластину ПДД за 24-48 ч при 35 ° C для чистой культуры изолировать с хорошим ростом.
2. Определение противогрибковых восприимчивости
- Используйте Стерильные одноразовые пластиковые петли подобрать 4-5 колоний диаметром около 1 мм от свеже subcultured C. glabrata изолировать на табличке ПДД. Ресуспензируйте в 3 мл стерильной дистиллированной воды. Смешайте хорошо нежный дозирование для получения единообразных подвеска.
- Отрегулируйте плотность клеток до 0.5 МакФарланд, что эквивалентно6 1 x 10-5 х 106 клеток/мл с помощью денситометр 8.
- Выполните тестирование чувствительности с использованием коммерческих пробирного (см. таблицу материалов и реагентов) на всех C. glabrata изолятов, следуя инструкциям производителя. Интерпретировать восприимчивость изолятов в основанные на результирующей ОПГВ противогрибковыми препаратами согласно рекомендации CLSI и подготовить доклад (таблица 1)8.
3. genomic извлечения ДНК для виртуализации
- Ресуспензируйте loopful колоний от свежезаваренным выращенных пластины ПДД в 300 мкл 50 мм ЭДТА в 1,5 мл.
- Мкл 40 zymolyase (10 мг/мл) подвеска, и аккуратно накапайте 5 раз до тех пор, пока подвеска единообразной.
- Инкубируйте образца при 37 ° C для 1-2 h переваривать клеточной стенки. Охладить при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Центрифуга для подвески на 14 000 × g на 2 мин и затем тщательно удалить супернатант.
- Экстракт геномной ДНК, ДНК добыча комплект руководящих принципов (см. таблицу материалы).
- Ресуспензируйте извлечь ДНК Пелле в 50 мкл 10 мм трис буфере (рН 7,5-8,5) вместо Элюирующий буфер, предоставленный в комплекте.
- Проверьте чистоту ДНК путем измерения оптической плотности (О.Д) 260/280 Нм25.
4. геномной ДНК количественная оценка
- Подготовить 1 x буфер Tris ЭДТА (TE) поставляется в комплекте пробирного, основанный на руководящих принципах производителя для assay флуоресценции в (см. таблицу материалы).
- Разбавьте образец ДНК путем добавления 2 мкл 98 мкл 1 x TE пробирного буфера (окончательный объем 100 мкл, коэффициент разбавления 1:50) в одноразовых 96 пластины хорошо. Этот шаг в разбавления можно выполнить вручную с помощью многоканальные пипетки или автоматизированных жидкости рабочих станций.
- Подготовка перечня стандартов путем разбавления лямбда ДНК (100 мкг/мл) флуоресценции пробирного комплекта (таблица 2) и включают для измерения вместе с образцами.
- Добавьте 100 мкл флуоресцентного красителя на 100 мкл разбавленной образцов ДНК и стандартов для реакции. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре, в защищенном от света.
- Измерьте флуоресценции всех образцов, на основе руководящих принципов производителя.
- Участок калибровочной кривой с помощью флуоресценции чтений и рассчитать оригинальный концентрация образцов ДНК.
- Определите объем ДНК и буфер Tris 10 мм (рН 8) добавлены для регулировки концентрации ДНК до 0,2 нг/мкл.
- Выполните разведений ДНК, с помощью автоматизированных жидкости рабочих станций. Этот шаг также достигается за счет ручной закупорить.
5. ДНК библиотеки подготовка
Примечание: Библиотека подготовка и последовательность была выполнена после производителя протоколы и руководящие принципы, предоставляемые компанией (рис. 1А) (см. таблицу материалы).
- Tagmentation и PCR амплификация
- Ярлык нового 96-луночных hard-shell тонкой настенной.
- 5 мкл количественных ввода ДНК на 0.2 нг/мкл (1 нг в общей сложности) для каждой выборки хорошо пластины.
- Добавить 10 мкл буфера tagmentation и 5 мкл буфера усиления каждой хорошо содержащих ДНК и аккуратно Пипетка смешивать. Уплотнение пластину с клейкой пластины печать.
- Установите пластину в тепловая велосипедист и запустите следующую программу ПЦР: 55 ° C за 5 мин и провести на 10 ° C. Когда образец достигает 10 ° C, немедленно приступить к нейтрализации.
- 5 мкл буфера нейтрализации к пластине для нейтрализации ампликон реакции, и осторожно Пипетка микс. Печать пластину и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
- 15 мкл индексации mastermix ПЦР для образцов.
- Используйте поле Индекс грунтовка труб доступны для установки формат 96-луночных пластины, чтобы каждый образец получает уникальное сочетание индексов, основанных на индекс шаблона (таблица 3).
- Организовать индекс грунтовка труб в стойку индекс пластины (рис. 1Б) с использованием указанной последовательности в шаблоне таблицы 3 и записать позицию индексов на шаблоне.
- Место tagmentation пластина с добавил mastermix ПЦР на индекс пластины стойку с трубками индекс в порядке.
- Поместить индекс грунтовка 1 трубы в вертикально и индекс грунтовка 2 трубы в горизонтальном расположении на стойку индекс. С помощью многоканальных дозаторов, тщательно мкл 5 праймеров индекс для каждого образца.
- Замените старый шапки индекс трубок с новой шапки, чтобы избежать перекрестного загрязнения между индексами.
- Печать пластину с помощью шпатлевки 96-луночных четкие пластины и выполнить второй PCR следующим: 95 ° C за 30 s, 12 циклов 95 ° c 10 s, 55 ° C за 30 сек, 72 ° C за 30 s и 72 ° C за 5 мин.
- ПЦР очистка
- Передача продукта PCR для ПЦР очистки, от tagmentation пластины к пластине штанхглубинных (см. таблицу материалы).
- Вихревой коммерческие магнитной бусины решение (см. таблицу материалы) на основе инструкции производителя и 30 мкл бусы для каждого продукта ПЦР в глубокой скважины пластины.
- Shake пластину на шейкере Гонав при 1800 об/мин на 2 мин и инкубации при комнатной температуре без встряхивания в течение 5 мин.
- Место пластину на магнитного стенд за 2 мин до тех пор, пока расчистил супернатант.
- Выбросите супернатант тщательно с табличке еще магнитного стенд.
- Добавьте 200 мкл свежеприготовленные 80% этанола с пластиной магнитного стенд.
- Инкубировать пластину на магнитного стенд для 30 s и осторожно снимите и выбросьте супернатант не нарушая бисер.
- Повторите шаг мыть и позволяют бисером высохнуть за 15 мин удалить избыток этанола, если таковые имеются.
- Снять пластину из магнитного стенд и 52,5 мкл буфера ресуспендирования корда.
- Shake пластину на шейкере Гонав при 1800 об/мин на 2 мин и инкубации при комнатной температуре на 2 мин без встряхивания.
- Место пластину на магнитную подставку и позволяют супернатант очистить.
- С помощью многоканальных дозаторов, тщательно передать 50 мкл супернатант от очистки пластины новой пластинкой твердой скорлупой.
- Нормализация библиотеки
- Оттепель библиотека нормализации реагенты согласно рекомендациям производителя (см. таблицу материалы).
- Передача 20 мкл супернатант от очистки пластины к новой плите глубокой скважины.
- 45 мкл суспензии магнитного шарик и печатью пластины с sealer пластины.
- Встряхните пластину на шейкере Гонав при 1800 об/мин за 30 мин. Это время инкубации имеет решающее значение и не должен быть превышен.
- Установите пластину на магнитного стенд на 2 мин и подтвердите, что супернатант расчистил (рис. 1Б).
- Снимите и выбросьте супернатант в контейнере соответствующего опасных отходов с табличке еще магнитного стенд.
- Снять пластину из магнитного стенд и мыть бусины с 45 мкл буфера мытья.
- Встряхните пластину с буфером мыть на шейкере Гонав при 1800 об/мин за 5 мин.
- Поместите пластину на магнитного стенд 2 мин и удалить супернатант, когда она становится ясно.
- Снять пластину из магнитного стенд и повторите мыть с буфером мыть.
- Снять пластину из магнитного стенд и 30 мкл 0,1 Н NaOH.
- Встряхнуть пластины с 0,1 Н NaOH в шейкере Гонав при 1800 об/мин за 5 мин и место пластину на магнитного стенд для 2 минут или до тех пор, пока жидкость ясно.
- Добавьте 30 мкл буфера в каждой скважине новой пластинкой окончательный нормализованных библиотека 96-луночных hard-shell тонкие стены.
- Передать 30 мкл супернатант от нормализации пластины пластины окончательный нормализованных библиотека сделать окончательный объем 60 мкл. Библиотеки теперь готовы к виртуализации.
- Определение концентрации библиотеки ДНК, ПЦР
- Оттепель mastermix, грунты и стандартов ПЦР комплекта согласно рекомендациям производителя (см. таблицу материалы).
- Объединить mastermix реагент ПЦР и грунт, в комплект ПЦР, соблюдая инструкции производителя и аликвоты могут храниться при температуре-20 ° C.
- Для определения концентрации библиотеки ДНК, сделайте 1/8000 разрежения библиотек ДНК, используя буфер Tris 10 мм (рН 8), выполняя разбавления 1: 100 (1.5 библиотеки ДНК мкл 148.5 буфер Tris мкл) следуют 1:80 разрежения (2 мкл от 1: 100 до 158 мкл буфера Tris).
- Shake пластину разрежения на 700 об/мин для по крайней мере 1 мин и затем центрифуги на 14000 × г за 1 мин.
- Подготовка 20 мкл окончательной реакции PCR путем смешивания 4 мкл разбавленного библиотеки ДНК или ДНК стандартов и 16 мкл mastermix.
- Выполнять следующие параметры производителя в Термоциклер ПЦР: 95 ° C за 5 мин, 35 циклов 95 ° C за 30 s-60 ° C для 45 s и заключительный 65 ° C до 95 ° C для анализа кривой расплава.
- Получите значения Ct библиотек образцов ДНК и стандартов Термоциклер ПЦР.
- Генерировать калибровочной кривой от Ct значения стандартов (рис. 2). Определите диапазон КК верхнего и нижнего, ± 3 циклов от среднего значения. Например если среднее значение Ct 13 циклов затем КК диапазон находится между 16 и 10 циклов.
- Определите индивидуальный и средняя библиотека концентрации (ALC) от стандартной кривой и Ct значения.
- Определите объем общего пула библиотек (PAL), которые будут использоваться на основании расчета, приведены ниже для окончательного последовательности, считая, что концентрация целевой библиотеки между 1.4 - 1 8 вечера.
Примечание: Средняя концентрация Библиотека, полученные от ПЦР = ALC; Всего пула библиотек (PAL) = ALC / 2; Денатурированный PAL (DAL) = PAL * 0.666
В зависимости от объема DAL, который смешивается с буфером является концентрация библиотеки, чтобы добавить в ячейку потока. Например, если 65 мкл библиотеки добавляется 835 мкл буфера, то от этого разрежения (Dil 1) 195 добавляется суммарный объем 1300 мкл: (65/900) * dnPAL = Dil1
Dil1 * (195/1300) = конечная концентрация (должно быть между 1.4 - 1 8 вечера)
6. Библиотека объединения и инициирование последовательности в Benchtop секвенсор
- Оттепель реагент патрон согласно рекомендациям производителя. Возьмите новую ячейку потока от своего пакета от 4 ° C для хранения и довести до комнатной температуры atleast 30 мин до последовательности. Вынуть картридж буфера и prechill последовательности буфера перед использованием (см. таблицу материалы).
- Подготовьте библиотеку элементов управления путем смешивания 5 мкл библиотеки (1 Нм) и 5 мкл 0,2 N NaOH. Вихревой кратко и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы денатурировать Библиотека элементов управления в одиночных стренги.
- 5 мкл 200 мм трис-HCl, pH 7 и вихря. Добавьте 235 мкл буфера prechilled последовательности и осторожно перемешать. Общий объем-250 мкл с управления Библиотека конечная концентрация на 20 вечера.
- Бассейн библиотеки ДНК путем передачи 5 мкл каждого образца библиотеки для виртуализации от окончательного нормализованных библиотека пластины в одной низкой свяжите 1,5 мл трубку.
- Добавьте 30 мкл пуле библиотеки и 30 мкл 0,2 N NaOH чтобы денатурировать библиотеки в другой трубки низкого bind.
- Вихревой низкий bind трубки и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы денатурировать библиотек в одиночных стренги.
- 30 мкл 200 мм трис-HCl, pH 7 трубка с денатурированного библиотек для нейтрализации реакции.
- Добавьте 65 мкл нейтрализованы денатурированного библиотек подвеска и 835 мкл предварительно охлажденные последовательности буфера и вихревой хорошо перемешайте.
- В трубке окончательный низким bind объединить следующие: 195 мкл от нейтрализованы денатурированного библиотеки, 1,30 мкл библиотеки элементов управления и 1103.70 мкл буфера последовательности. Mix правильно.
- Загрузите окончательный библиотека микс (1300 мкл) в назначенный пятно на реагент картриджа.
- Настройка последовательности запуска введя детали проекта и образец в программе Sequencer места для веб-сайта после руководящих принципов.
- Начало последовательности с руководящими принципами. Загрузить поток клеток, реагент картридж с библиотеками и буфера картридж в секвенсор benchtop.
- Запишите номера партии всех наборов реагентов и картриджи, используемых в последовательности.
7. данные скачать с сайта последовательности
- Скачайте FASTQ файлы, следуя инструкциям на веб-сайте изготовителя.
- Для хорошего качества, проверить, что процент Q30 ≥ 75% и кластера плотность является между 170-280 K/мм2 с оптимальной на 200-210 K/мм2 (таблица 4).
8. последовательности анализа данных
- Импорт файлов FASTQ виртуализированного образцов в интегрированный программный пакет анализа данных (см. таблицу материалы).
- Создание рабочего процесса виртуализации программного обеспечения путем добавления функций из списка а именно обрезки, сопоставления ссылок (выберите ссылку генома), местные перестройки и вариант анализа (рисA) с помощью параметров, перечисленных в таблице 5.
- Запуск рабочего процесса, выбрав один образец или пакетных файлов образцов FASTQ и сохранить выходные файлы в папках указанного образца.
- Создать отчет для последовательности глубину охвата, сопоставленных регионов и список структурных вариантов в геноме (рис. 3B).
- Используйте список структурных вариантов для поиска не являются синонимами единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генах, присвоении сопротивления и вирулентности.
- Подготовьте доклад, перечисляя SNP местоположение, ген и количество устойчивостью или подверженных изоляты (таблица 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тринадцать C. glabrata составе изолятов ATCC 90030 и 12 C. glabrata от клинической микологии референс-лаборатории (изоляты CMRL1 до CMRL12), были изучены больницы Westmead, Сидней (таблица 1). К ним относятся три пары изолятов, CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 и CMRL-5/CMRL-6, полученные до и после противогрибковой терапии с нет эпидемиологической связи между ними 24 (таблица 1).
ОПГВ были определены с использованием CLSI о толковании останова для девяти противогрибковых агентов, амфотерицин (AMB), Anidulafungin (ANI), Micafungin (МВС), Caspofungin (CAS), 5-флуцитозин (5-ФК), Позаконазол (POS), вориконазол (ВРЦ), итраконазол () ITR) и флуконазол (ФОК). Кандида parapsilosis ATCC 22019 и Candida krusei ATCC 6258 были использованы в качестве контроля качества штаммов. Среди изолировать пара, CMRL-1 и CMRL-2, второй изолировать CMRL-2 был устойчив к caspofungin (MIC 8 против 0,12 мг/Л, таблица 1). CMRL-2 также имел аналогичный рост пропорциональные в МИКО anidulafungin и micafungin (≥ 0,5 мг/Л) привело в vitro сопротивление всех трех echinocandins24. Аналогичным образом изолировать CMRL-4 был разработан echinocandin сопротивление, чем те из изоляции CMRL-3 (таблица 1). Между третьей пары, изолировать CMRL-6 был 5-флуцитозин MIC (> 64 против 0,06 мг/Л)24. Оба эти изолировать пар были восприимчивы/одичал тип (WT) другие противогрибковые препараты протестированы. Изоляция CMRL-6 и CMRL-12 были признаны устойчивыми или не WT для всех азолов. CMRL-7 был устойчив к флуконазолу и не WT для вориконазол (таблица 1). C. glabrata ATCC 90030 и изоляты CMRL-8-CMRL-11 были восприимчивы восприимчивы/WT для всех противогрибковых агентов24.
WGS 13 изолятов была выполнена с помощью программы sequencer benchtop. В среднем, средней выходной последовательности запуска, принесли около 27-40 ГБ данных с погрешность между 0,5-1,4%. Средний процент полученных Q30 был обычно около 80-85%. Поток-кластера плотность клеток (K/мм2) колеблется от 200-250 (таблица 4). Необработанные данные о последовательности из этого исследования сдали в NCBI последовательности чтения Архив (SRA) под номером проекта PRJNA310057. 98% секвенирования читает сопоставляется с геном C. glabrata ссылка (штамм CBS138) путем анализа комплексных данных анализа программного обеспечения. Средняя читал глубина охвата было 75 x с среднем читать длина 143-bp. структурных вариант обнаружения выявленных, более чем на 50, 000 ОНП в изоляции. В частности анализируя напряжение пар, которые были вокруг 79,000, для CMRL-3/CMRL-4, CMRL1/CMRL-2, Общая ОНП на каждом изолировать общее количество SNPs были около 60000 и для CMRL-5/CMRL-6, более 56 000 человек по сравнению с CBS13824. SNP разница при сравнении между изолятов в паре штамм был меньше, чем 25.
На основе восприимчивости профиля изолятов, известный сопротивления биомаркеров были отобраны для анализа24, в частности, FKS1, FKS2 и FKS3 (echinocandin сопротивления), FCY1 и FCY2 (5- флуцитозин сопротивления) и ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 и CgFLR1 (азол сопротивление). Гены были проверены для известных мутации и частота случаев SNP. Только не синонимами полиморфизмов в генах с читать т.е. глубина охвата каналов ≥20, SNPs высокого качества (hq-SNPs) специально были изучены.
В частности FKS мутации были определены в геном обеих echinocandin устойчивостью изолятов24. Из первых двух пар, echinocandin устойчивостью изолятов, CMRL-2 укрывал одной мутации FKS2 S629P и CMRL-4, FKS2 мутации S663P (таблица 6). Третьей пары SNP в FCY2 (Ala237Thr) был найден в CMRL-5 (5-флуцитозин восприимчивы) и CMRL-6 (устойчивость) (таблица 6). Однако ОНП в FCY2 были найдены в других фенотипически WT изоляты (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24. Изоляты CMRL-6 и CMRL-12 заслуживают внимания для их устойчивостью Пан азол/non-WT характер и имел ОНП в CgCDR1 (кодирование азол измеряем насосы) и CgPDR1 (кодирование транскрипционный фактор, регулирующий измеряем насосы) (таблица 6)26 ,27. Наличие мутаций гена другой насос измеряем, CgFLR1 произошла в обоих азол восприимчивы и азол устойчивостью изолятов26,28. Расследования для SNP в пределах ERG9 (кодирования сквален синтетазы) показали мутаций, но там было не мутации в ERG1124.
WGS анализ также показал несколько не синоним ОНП в Candida клеточной стенки сцепления генов, а именно, EPA1, EPA6, PWP2 и PWP5. EPA6 перегласовок были представлены в 9/12 изолятов. ОНП в PWP2 и PWP5 также присутствовали в почти всех изолятов, за исключением изолятов CMRL-1 и CMRL-11-24.
| Изолировать | AMB | АНИ | MIF | CAS | 5-ФК | POS | VRC | ITR | ФОК | Интерпретация противогрибковые восприимчивости | Гены, присвоении сопротивления, выявленные WGS | ||
| CMRL-1 | 0.5 | 0,03 | < 0,008 | 0,12 | < 0,06 | 0.5 | 0,12 | 0.25 | 8 | Подвержены все | - | ||
| CMRL-2 | 0.5 | 1 | 1 | 8 | < 0,06 | 0.25 | 0,06 | 0,12 | 4 | Устойчив к всем echinocandins только | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0.25 | 0,015 | 0,015 | 0,12 | < 0,06 | 1 | 0.25 | 0.5 | 8 | Подвержены все | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0,06 | 0.5 | 0,12 | 0.25 | 8 | Устойчив к всем echinocandins только | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0,12 | 0,015 | 0,12 | < 0,06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 16 | Подвержены все | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0,06 | 0,015 | 0,06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | Устойчив к 5-ФК и азолов | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0.25 | 0,06 | 0,015 | 0.25 | < 0,06 | 1 | 8 | 0.5 | 256 | Устойчив к всем азолов только | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0.5 | 0,03 | 0,008 | 0,06 | < 0,06 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 4 | Подвержены все | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0,03 | 0,015 | 0.25 | < 0,06 | 1 | 0.5 | 1 | 16 | Подвержены все | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0,03 | < 0,008 | 0.5 | < 0,06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 16 | Подвержены все | - | ||
| CMRL-11 | 0.5 | 0,03 | < 0,008 | 0,03 | < 0,06 | 0.5 | 0.25 | 0.5 | 8 | Подвержены все | - | ||
| CMRL-12 | 0.5 | 0,03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | Устойчив к всем азолов только | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0,03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 8 | Подвержены все | - | ||
| Сокращения: MIC, минимальный тормозной концентрации; АТФБанк, амфотерицин B; ANI, anidulafungin; CAS, caspofungin; ФОК, флуконазол; ИТР, итраконазол; MIF, micafungin; POS, Позаконазол; VRC, вориконазол; 5-ФК, 5-флуцитозин. | |||||||||||||
Таблица 1. В vitro чувствительности 13 Candida glabrata изолятов, включая CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 и CMRL-5/CMRL-6 изолировать пар, полученных до и после противогрибковая терапия
| Стандарты | Стандартный объем ДНК (мкл) | 1 X TE буфер | Реагент (мкл) | Всего в 96-луночных пластины (мкл) | Концентрация окончательный ДНК (нг/мл) |
| STD Пико 1 | 8 (стандартный ДНК трубки 100 мкг/мл) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| STD Пико 2 | 10 (от Std Пико 1) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| STD - Пико 3 | 5 (от Std Пико 1) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| STD Пико 4 | 2 (от Std Пико 1) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| STD Пико 5 | 10 (Std Пико 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| Пустой | - | 100 | 100 | 200 | Пустой |
Таблица 2. Протокол для подготовки стандартов для стандартной кривой поколения для количественного определения ДНК
Рисунок 1 . Последовательности рабочего процесса: (A) наброски основных аналитических шаги для подготовки библиотека и секвенирования на benchtop секвенсор. (B) важных компонентов для приготовления библиотеки ДНК как (слева направо) индекс пластины стойку для расположения индексов во время индексирования и магнитные стойки с глубоким 96-луночных пластина для магнитных шарик на основе очистке библиотек ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Индекс Блок A |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | Пример 1 | Пример 2 | Пример 3 | Пример 4 | Пример 5 | Пример 6 | Пример 7 | Образец 8 | Пример 9 | Образец 10 | Пример 11 | Пример 12 |
| B | S503 | Пример 13 | Образец 14 | Образец 15 | Образец 16 | Пример 17 | Пример 18 | Пример 19 | Пример 20 | Пример 21 | Пример 22 | Пример 23 | Пример 24 |
| C | S505 | Образец 25 | Пример 26 | Образец 27 | Пример 28 | Пример 29 | Образец 30 | Пример 31 | Пример 32 | Пример 33 | Пример 34 | Пример 35 | Пример 36 |
| D | S506 | Пример 37 | Пример 38 | Пример 39 | Пример 40 | Пример 41 | Пример 42 | Пример 43 | Пример 44 | Пример 45 | Пример 46 | Пример 47 | Пример 48 |
| E | S507 | Пример 49 | Пример 50 | Пример 51 | Образец 52 | Пример 53 | Пример 54 | Пример 55 | Пример 56 | Пример 57 | Пример 58 | Пример 59 | Пример 60 |
| F | S508 | Пример 61 | Пример 62 | Пример 63 | Пример 64 | Пример 65 | Пример 66 | Пример 67 | Пример 68 | Пример 69 | Пример 70 | Пример 71 | Пример 72 |
| G | S510 | Пример 73 | Пример 74 | Образец 75 | Пример 76 | Пример 77 | Пример 78 | Пример 79 | Пример 80 | Пример 81 | Пример 82 | Пример 83 | Пример 84 |
| H | S511 | Пример 85 | Пример 86 | Пример 87 | Пример 88 | Пример 89 | Пример 90 | Образца 91 | Образец 92 | Пример-93 | Образец 94 | Образец 95 | Образец 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Индекс набора B | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | Пример 1 | Пример 2 | Пример 3 | Пример 4 | Пример 5 | Пример 6 | Пример 7 | Образец 8 | Пример 9 | Образец 10 | Пример 11 | Пример 12 |
| B | S503 | Пример 13 | Образец 14 | Образец 15 | Образец 16 | Пример 17 | Пример 18 | Пример 19 | Пример 20 | Пример 21 | Пример 22 | Пример 23 | Пример 24 |
| C | S505 | Образец 25 | Пример 26 | Образец 27 | Пример 28 | Пример 29 | Образец 30 | Пример 31 | Пример 32 | Пример 33 | Пример 34 | Пример 35 | Пример 36 |
| D | S506 | Пример 37 | Пример 38 | Пример 39 | Пример 40 | Пример 41 | Пример 42 | Пример 43 | Пример 44 | Пример 45 | Пример 46 | Пример 47 | Пример 48 |
| E | S507 | Пример 49 | Пример 50 | Пример 51 | Образец 52 | Пример 53 | Пример 54 | Пример 55 | Пример 56 | Пример 57 | Пример 58 | Пример 59 | Пример 60 |
| F | S508 | Пример 61 | Пример 62 | Пример 63 | Пример 64 | Пример 65 | Пример 66 | Пример 67 | Пример 68 | Пример 69 | Пример 70 | Пример 71 | Пример 72 |
| G | S510 | Пример 73 | Пример 74 | Образец 75 | Пример 76 | Пример 77 | Пример 78 | Пример 79 | Пример 80 | Пример 81 | Пример 82 | Пример 83 | Пример 84 |
| H | S511 | Пример 85 | Пример 86 | Пример 87 | Пример 88 | Пример 89 | Пример 90 | Образца 91 | Образец 92 | Пример-93 | Образец 94 | Образец 95 | Образец 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Индекс набор C | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S513 | Пример 1 | Пример 2 | Пример 3 | Пример 4 | Пример 5 | Пример 6 | Пример 7 | Образец 8 | Пример 9 | Образец 10 | Пример 11 | Пример 12 |
| B | S515 | Пример 13 | Образец 14 | Образец 15 | Образец 16 | Пример 17 | Пример 18 | Пример 19 | Пример 20 | Пример 21 | Пример 22 | Пример 23 | Пример 24 |
| C | S516 | Образец 25 | Пример 26 | Образец 27 | Пример 28 | Пример 29 | Образец 30 | Пример 31 | Пример 32 | Пример 33 | Пример 34 | Пример 35 | Пример 36 |
| D | S517 | Пример 37 | Пример 38 | Пример 39 | Пример 40 | Пример 41 | Пример 42 | Пример 43 | Пример 44 | Пример 45 | Пример 46 | Пример 47 | Пример 48 |
| E | S518 | Пример 49 | Пример 50 | Пример 51 | Образец 52 | Пример 53 | Пример 54 | Пример 55 | Пример 56 | Пример 57 | Пример 58 | Пример 59 | Пример 60 |
| F | S520 | Пример 61 | Пример 62 | Пример 63 | Пример 64 | Пример 65 | Пример 66 | Пример 67 | Пример 68 | Пример 69 | Пример 70 | Пример 71 | Пример 72 |
| G | S521 | Пример 73 | Пример 74 | Образец 75 | Пример 76 | Пример 77 | Пример 78 | Пример 79 | Пример 80 | Пример 81 | Пример 82 | Пример 83 | Пример 84 |
| H | S522 | Пример 85 | Пример 86 | Пример 87 | Пример 88 | Пример 89 | Пример 90 | Образца 91 | Образец 92 | Пример-93 | Образец 94 | Образец 95 | Образец 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Индекс Set D | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | Пример 1 | Пример 2 | Пример 3 | Пример 4 | Пример 5 | Пример 6 | Пример 7 | Образец 8 | Пример 9 | Образец 10 | Пример 11 | Пример 12 |
| B | S515 | Пример 13 | Образец 14 | Образец 15 | Образец 16 | Пример 17 | Пример 18 | Пример 19 | Пример 20 | Пример 21 | Пример 22 | Пример 23 | Пример 24 |
| C | S516 | Образец 25 | Пример 26 | Образец 27 | Пример 28 | Пример 29 | Образец 30 | Пример 31 | Пример 32 | Пример 33 | Пример 34 | Пример 35 | Пример 36 |
| D | S517 | Пример 37 | Пример 38 | Пример 39 | Пример 40 | Пример 41 | Пример 42 | Пример 43 | Пример 44 | Пример 45 | Пример 46 | Пример 47 | Пример 48 |
| E | S518 | Пример 49 | Пример 50 | Пример 51 | Образец 52 | Пример 53 | Пример 54 | Пример 55 | Пример 56 | Пример 57 | Пример 58 | Пример 59 | Пример 60 |
| F | S520 | Пример 61 | Пример 62 | Пример 63 | Пример 64 | Пример 65 | Пример 66 | Пример 67 | Пример 68 | Пример 69 | Пример 70 | Пример 71 | Пример 72 |
| G | S521 | Пример 73 | Пример 74 | Образец 75 | Пример 76 | Пример 77 | Пример 78 | Пример 79 | Пример 80 | Пример 81 | Пример 82 | Пример 83 | Пример 84 |
| H | S522 | Пример 85 | Пример 86 | Пример 87 | Пример 88 | Пример 89 | Пример 90 | Образца 91 | Образец 92 | Пример-93 | Образец 94 | Образец 95 | Образец 96 |
Таблица 3. Шаблон расположения различных индекс
Рисунок 2 : Стандартный график с КТ значения стандартов. Используйте значения калибровочной кривой перехвата и склон для определения концентрации средняя библиотеки от Ct значение библиотек образцов в дубликаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Метрики | Стандартные значения | Полученные значения (в среднем) |
| Доходность | 32.5-50 ГБ для среднего вывода | 42 Гб для среднего вывода |
| 100-130 ГБ для высокомощных | 120 ГБ для высокомощных | |
| Процент Q30 | ≥ 75% | 80% |
| Кластера плотность | 170-230 K/мм2, оптимальной на 200 K/мм2 | 210 K/мм2. |
| Кластеры пропускающие фильтры | > 70% | 89.09% |
| Интенсивность цикла | Свыше 1000 для каждой плитки в flowcell | Выше 1500 для каждой плитки в flowcell |
| Частота ошибок | Ниже 1.5 | 1.4 |
Таблица 4. Метрики для стандартной последовательности запуска в Benchtop секвенсор
Рисунок 3 : Виртуализации программного обеспечения для анализа данных. (A) создание нужного рабочего процесса, включая последовательность обрезки, отображение ссылок и качества на основе варианта обнаружения. Запуск рабочего процесса, выбрав файлы образцов FASTQ (лицо или несколько образцов в пакете). (B) список структурных вариантов показаны исходное положение, освещение, нуклеотидных изменений и изменения аминокислоты, полученные для анализа последовательностей образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| 1. обрезать последовательности | Параметры, используемые |
| Трим баз | Параметры по умолчанию |
| Фильтр по длине с максимальное количество нуклеотидов в чтений | 1000 |
| Фильтр по длине с минимальное количество нуклеотидов в чтений | 50 |
| 2. Сопоставление читает для ссылки | |
| Ссылка выбрана | CBS138 |
| Ссылка маскирование с режиме маскировки | Без маскировки |
| Сопоставление параметров | Параметры по умолчанию |
| 3. Местные перестройки | |
| Параметры выравнивания | Параметры по умолчанию |
| 4. качество на основе варианта обнаружения | |
| Соседства радиус | 5 |
| Минимальное количество разрыв и несоответствие | 2 |
| Минимальная соседства качество | 15 |
| Минимальный Центральный качество | 20 |
| Фильтры чтения | Параметры по умолчанию |
| Минимальное освещение | 4 |
| Минимальный вариант частоты (%) | 75 |
| Вариант фильтры | Параметры по умолчанию |
| Максимальный ожидаемый аллели (плоидности) | 2 |
| Генетический код | Стандарт |
Таблица 5. Параметры рабочего процесса и на программное обеспечение
| Структурные вариант нуклеотидной позиции | Джин | Препаратом | Найдено в Количество Изолирует |
Устойчивые изолятов | Восприимчивы изолятов | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | CAS, АНИ, MIF | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | CAS, АНИ, MIF | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-ФК | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-ФК | 2 | 0 | CMRL-1, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | ФОК, POS, VRC, ИТР | 3 | CMRL-6 | CMRL-5, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | ФОК, POS, VRC, ИТР | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | ФОК, POS, VRC, ИТР | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | ФОК, POS, VRC, ИТР | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | ФОК, POS, VRC, ИТР | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | ФОК, POS, VRC, ИТР | 5 | CMRL-6, CMRL-12 | CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | ФОК, POS, VRC, ИТР | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | ФОК, POS, VRC, ИТР | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | ФОК, POS, VRC, ИТР | 4 | CMRL-7 | CMRL-1, CMRL-2, CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | ФОК, POS, VRC, ИТР | 1 | CMRL-12 | - | |
Таблица 6. Доклад о структурной вариант позиции в генов, связанных с противогрибковыми лекарственной устойчивости в количество изолятов C. glabrata
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование определяет целесообразность, приблизительные сроки и точность обнаружения WGS-руководствуясь лекарственной устойчивости в C. glabrata. Время обработки (ТАТ) для подготовки библиотека и последовательности было четыре дня и отчетности проанализированы результаты одного-двух дней. Это сравнивает с по крайней мере такую же сумму ТАТ для анализов чувствительности от культуры пластин и Сэнгер виртуализации значительно большее количество образцов. Около 30-90 C. glabrata геномов можно упорядочивать основанный на последовательности потока-соты, с охватом 80-100% последовательности. Поскольку последовательность была исполнена на внутренней установки лаборатории WGS, расходы/ресурсах в этом исследовании была эквивалентна текущих расходов Сэнгер последовательности и зонд на основе анализов с ориентировочной цене AUD 80-100 на сэмпл. Подверженность всех изолятов были определены коммерческих пробирного комплект, который были читать визуально с помощью чтения зеркало. Рост культуры было указано изменение показателя колориметрические роста от синего до розового. Микрофон был читать как первый синий хорошо после того, как серия розовый (рост) скважин, т.е., низкая концентрация противогрибковый агент, который существенно замедляет рост. Для WGS геномной ДНК библиотеки были подготовлены с использованием библиотеки подготовка комплекта. Изолировать библиотеки были количественно по ПЦР. Количественных библиотеки были объединены вместе для окончательного последовательности запуска выполняется в программе sequencer benchtop.
В нашем анализе присутствие полиморфизмов в генах, присвоении сопротивления в изолятах коррелирует с повышенными в vitro MIC против наркотиков. МутацииS629P в FKS1 и S663P в FKS2 определены были явно связаны с устойчивостью к echinocandins. Обе мутации хорошо известны придать фенотипические сопротивление29,30. Одновременная секвенирования генома общесистемной также показали мутации в генах, связанных с 5-флуцитозин (ген FCY2) и азол сопротивления (CgPDR1, CgCDR1 и CgFLR1), которые связаны с сопротивление путем активации / Гиперэкспрессия как измеряем насосы26,27,28. Однако влияние мутаций в генах, связаны с азол и 5-флуцитозин сопротивления31 должна быть подтверждена дополнительных функциональных анализирует оценить уровень выражения гена. Интересно, что большое количество SNP были также обнаружены в клеточной стенки адгезины в всех изолятов32,33. Мутации в гене EPA6, который кодирует биопленки, адгезии произошло сравнительно часто33. Кроме того изоляты, CMRL-3, CMRL-4 и CMRL-8, что не имеют мутации в генах азол сопротивления не документированы ОНП в EPA1 и EPA624,34. Однако в целом, без конкретных связь между ОНП в адгезины и наркотиков микрофонов можно найти из-за низкого количества теста изолятов включены.
Осуществление WGS в клинической микологии требует осуществления надежного качества системы управления. Для хорошего результата WGS важно высокое качество геномной ДНК и контроля качества контрольно-пропускные пункты которые сопровождают каждый шаг в эксперименте. Чистота C. glabrata образец ДНК представлены для подготовки библиотеки могут быть проверены с помощью метода поглощения УФ (поглощение в 260/280 Нм и 260/230 Нм25. По нашему опыту для C. glabrata ДНК 260/280 ожидается в пределах рекомендуемого диапазона 1,8-2 и для 260/230 между 2-2,2. Если ДНК выдержки не удовлетворяют этим требованиям качества, могут выполняться дополнительные очистки высыпанием этанола. Tagmentation представляет собой важный шаг добавления последовательности уникальных штрих-кода называется индекс грунтовки, так как включить дифференциация несколько образцов во время виртуализации (мультиплексирование). Следовательно в процессе индексирования, должны приниматься осторожность во избежание перекрестного загрязнения между индекс трубы и образцы для того, чтобы поддерживать уникальность индексов. Нормализация в последовательности гарантирует, ликвидировать любые различия, возникающие в образец ДНК библиотек, которые могут ввести предвзятости в последовательности данных. Нормализация шаг с помощью очистки шарик на основе обычно позволяет удаление избыточного библиотека фрагментов ДНК и вариации в размер библиотеки, которые могут возникнуть во время подготовки библиотеки. Поэтому 30 минут инкубации имеет решающее значение для оптимальной кластера плотность. Плотности кластера, который плотность клоновых кластеров библиотек образцов, порожденных массовым усиления во время виртуализации влияния качества данных как Q30 баллы и вывода данных. Хотя underclustering может дать высокое качество данных, это также приведет к нижней данных, тогда как overclustering низкие оценки Q30. ДНК библиотеки должны быть свободны от остатков магнитный шарик во время очистки ПЦР и нормализации, что может мешать секвенирования качества данных. ПЦР должны выполняться на по крайней мере несколько библиотек репрезентативной выборки, включая эталонного штамма как положительный контроль (ATCC штамм C. glabrata в данном случае) от конкретного набора показателей. Средние значения КТ должен быть между 15-18 циклов. Любой образец в этом диапазоне считается приемлемым для выполнения последовательности. Однако если Ct значения находятся за пределами этого диапазона ПЦР следует повторить. Образцы могут иногда не ПЦР, либо из-за низкого качества ввода ДНК или ошибки при подготовке библиотеки. На основании расчетов из позитивных элемента управления, следует создать минимальную концентрацию библиотек, которые будут производить хорошие последовательности данных. Используя средняя концентрация библиотек, полученные от ПЦР, можно рассчитать объем окончательного библиотеки, чтобы быть добавлены для виртуализации. Это должно привести к концентрации Рекомендуемые окончательный библиотека между 1.4 - 1 8 вечера. Для библиотек C. glabrata , установленного диапазона Ct, используя C. glabrata ATCC изолировать был между 16-18 циклов с библиотека средний диапазон концентраций 300-500 м. Соответствующий объем пула денатурированной ДНК библиотек было в пределах 60-65 мкл для кластера плотность диапазоне между 200-250 K/мм2.
Файлы данных последовательности должны быть demultiplexed до дальнейшего анализа. Это может достигаться путем сортировки в их соответствующих библиотек с использованием их штрих-коды после секвенирования имело место. Необязательный шаг качества отделки FASTQ файлов может выполняться до анализа данных. Считывает последовательность изолятов от WGS были проанализированы с помощью настраиваемого рабочего процесса, созданный в стандартный программный пакет. Это позволило обрезки низкого качества гласит и последующего сопоставления ссылки генома кандиды . Ссылка генома, CBS138, был загружен из базы данных генома кандиды (КГД) и связан с рабочим процессом до анализа. Присутствие ДНК повторяется в геноме Candida (например, адгезина гены имеют повторов ДНК) может осложнить выравнивание чтения коротких последовательностей и призвание SNP. Это может быть улучшена путем дополнительных местных перестройки сопоставленных последовательностей. Выход из рабочего процесса был список структурных вариантов, который представил аннотированный генов с не синонимами и синонимом SNP позиции, так и охвата. Это было использовано выявление полиморфизмов в генах интерес и подготовить отчет окончательный анализ для изоляты (таблица 6).
Следует признать некоторые ограничения нашего исследования и подход. Наш отчет основан на небольшое количество изолятов и база данных отсутствует стандартный грибковых resistome для клинической микологии. Хотя секвенирования ДНК Сэнгер в настоящее время более доступным для клинических лабораторий, она имеет ограниченную способность одновременно обнаруживать несколько генных мутаций, которые наделяют лекарственной устойчивости в Candida spp. (> 20 FKS мутации для echinocandin сопротивление только). С консолидацией патологии услуг и снижение последовательности расходы, практичность использования РГ над Сэнгер виртуализации, будет расти. Однако важным фактором является первоначальный лаборатории установки и стоимость внедрения WGS инструмента, а также конечного пользователя обучение сотрудников лабораторий. По существу, будет включать долгосрочные издержки, последовательности наборов реагентов и аксессуары. Если WGS инструмент не является внутренней следует ожидать дополнительных затрат и выше тат. Кроме того присутствие повторения последовательностей ДНК в геномах может затруднить выравнивание чтения коротких последовательностей и призвание SNP. Доступность качественного ведения геномов последовательного использования Длинные чтения технологий поможет поддерживать качество SNP идентификации.
В будущем WGS предполагается добиться улучшений в клинической терапии отчетности время быстрого отслеживания в диагностических параметров, легко доступны и истолковано клиницисты20,22. Это может быть достигнуто с развитием куратор современных WGS противогрибковый препарат сопротивления баз данных и Роман и подтверждающего мутации вывести противогрибковые сопротивления. Как больше геномов клинически значимых дрождей известных фенотипические лекарственную становятся доступными для анализа, Роман маркеров и механизмы противогрибковым препаратам, могут быть обнаружены. Эти события существенно снизит риск неудач лечения благодаря multi лекарственной устойчивости и токсичности препарата. В заключение следующего поколения последовательности с надлежащим качеством управления протоколами обеспечивает обнаружение генома общесистемной мутаций, присвоении сопротивления в Candida glabrata , который можно дополнить фенотипические тестирования в лаборатории микологии. Идеи, предоставляемые быстрого генома клинически значимых Candida spp можно принципиально изменить наше понимание механизмов сопротивления на различные классы противогрибковых агентов и совершенствования управления больных инвазивным грибковые заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют без финансовых интересов и конфликта интересов не разглашать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана центра инфекционных заболеваний и микробиологии, общественного здравоохранения. Авторы не получили каких-либо других источников финансирования для этого исследования. Авторы благодарят Drs Alicia Арнотт, Натан Бахман и Ranjeeta Менон за их квалифицированную консультацию и помощь с весь геном последовательности эксперимент.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
