Cancer Research

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739

Xianquan Zhan^1,2,3,4, Yuda Huang^1,2,3, Ying Long^1,2,3

¹Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, ²Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, ³State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, ⁴The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

Burada, kütle spektrometresi (ayırmak ve bir iyi ve tekrarlanabilir 2DE desen sunar insan hipofiz adenom doku Proteom tanımlamak için MS) ile birleştiğinde bir iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) mevcut. Çoğu protein her 2DE yerde karmaşık kanser Proteom yüksek-duyarlı MS kullanımı ile analiz ederken gözlenir.

Abstract

İnsan hipofiz adenom (PA) insan hipofiz bezi hipotalamus-hipofiz-hedef organ eksen sisteminde oluşur ve klinik olarak işlev veya işlevsiz PA (odak ve NFPA) sınıflandırılabilir ortak bir tümördür. NFPA erken aşamada tanı ve tedavi ancak odak için karşılaştırıldığında kan hormon yükselen nedeniyle zordur. Uzun vadeli hedefimiz güvenilir biyolojik açıklama PA moleküler mekanizmaları ve etkili tanı, prognostik işaretleri ve tedavi hedefleri tanınması için keşfetmek için proteomik yöntemleri kullanmaktır. Kütle spektrometresi (MS) yöntemlerle birleştiğinde etkili iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) buraya örnekleri, 2D Jel Elektroforez, protein görselleştirme, görüntü analizi, jel hazırlanması da dahil olmak üzere insan PA proteomes analiz sunuldu Tripsin sindirim, peptid kitle parmak izi (PMF) ve tandem spektrometresi (MS/MS) kitle. 2-boyutlu Jel Elektroforez matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi PMF (2DE-maldı MS PMF), 2DE-maldı MS/MS ve 2DE-sıvı Kromatografi (LC) MS/MS yordamları başarıyla uygulanan NFPA Proteom analizinde bir. Bir yüksek-duyarlı Kütle Spektrometre kullanımıyla, birçok protein ile her 2D jel insan PA Proteom kapsamını maksimize etmek için karmaşık PA doku analizinde bir spot 2DE-LC-MS/MS yönteminde tespit edilmiştir.

Introduction

PA insan endokrin sisteminde önemli roller oynar hipotalamus-hipofiz-hedef organ eksen sistemleri insan hipofiz bezinde oluşan ortak bir tümördür. PA klinik olarak fonksiyonel ve işlevsiz PAs (odak ve NFPA)¹^,²içerir. NFPA erken aşamada tanı ve tedavisi nedeniyle sadece biraz yüksek hormon düzeyleri (örneğin, LH ve FSH) kan kan³^,^{4 karşılık gelen hormon düzeyleri önemli ölçüde artmıştır odak göre zordur} ^,⁵. Moleküler mekanizmalar açıklama ve etkili biyolojik keşfi tanı, tedavi ve NFPA Prognozunda önemli klinik öneme sahip. Uzun vadeli hedefimiz geliştirmek ve NFPA onun moleküler mekanizmaları netleştirmek için güvenilir biyolojik keşfi için çalışmaya proteomik yöntemleri kullanın ve tanılama ve prognostik işaretleri yanı sıra etkili tedavi hedefleri tanımak olduğunu. 2-DE MS yöntemleri ile birleştiğinde kapsamlı bir şekilde kullanıldığını Proteom başvuru kurulması da dahil olmak üzere insan PA Proteom¹^,²^,⁶^,⁷, ilgili uzun vadeli araştırma programımızda ³^,⁸, analiz differentially ifade protein profilleri⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³, hormon türevleri^{14 haritalar} ^,¹⁵, fosforilasyon¹⁴ ve tirozin nitration¹⁶^,¹⁷^,¹⁸gibi translasyonel modifikasyon, göreli olarak invazif proteomik varyasyonu invaziv olmayan NFPAs¹⁹ve birden çok önemli yolu (mitokondrial disfonksiyon, hücre döngüsü bozukluk, oksidatif stres ve ağları MAPK sinyal keşfi yol açan NFPA alt türlerinden¹³, proteomik heterojen Sistem anormallik) NFPA¹³^,¹⁹^,²⁰dakikaya değişmiş.

2DE ayıran proteinler isoelectric noktası (PI) (isoelectric odaklanarak, IEF) ve molekül ağırlığı (yolu ile Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez, SDS-sayfa) göre¹^,²^,³^, ⁴ ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³. bu ortak ve klasik ayırma proteomik, alanında Proteom ve proteomik içinde 1995²⁴kavramlarını giriş beri bir tekniktir. MS 2DE ayrılmış proteinlerin PMF ve MS/MS stratejileri de dahil olmak üzere kimlik bulmak için çok önemli bir tekniktir. MS aletleri, özellikle de algılama hassasiyeti ve çözünürlük, LC sistemi, geliştirilmesi ile birlikte yönleri çok hızlı gelişimi büyük ölçüde düşük veya çok düşük bereket proteinler arasında en üst düzeye çıkarmak için bir Proteom kimlik geliştirir bir Proteom kapsama. Bu da bizim geleneksel kavramları yalnızca bir meydan okuyor veya iki protein 2B jel karmaşık insan dokusu Proteom analizinde bir nokta mevcut ve birden çok protein 2B jel karmaşık insan dokusu analizinde bir nokta belirlemek için bir fırsat sağlar Proteom ve NFPA Proteom kapsama en üst düzeye çıkarmak.

Burada 2DE-maldı MS PMF, 2DE-maldı MS detaylı protokolleri açıklamak/MS ve 2DE-LC-MS/başarıyla insan NFPA Proteom analizinde kullanılan MS. İletişim kuralları hazırlık içerir örnekleri, ilk ikinci boyut (isoelectric odaklanarak, IEF), (SDS-sayfa), görselleştirme (Gümüş boyama ve Coomassie mavi boyama) proteinlerin boyut, görüntü analiz 2D jel, jel tripsin sindirim, Arıtma tryptic peptidler, PMF, MS/MS ve³^,⁸^,²⁵^,²⁶yakıcı veritabanı. Ayrıca, bu iletişim kuralı kolayca diğer insan dokusu proteomes analiz için çevirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mevcut iletişim kuralı Xiangya Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi merkez Güney Üniversitesi, Çin kuralları izler. Cilt ve saç⁸keratin kirlenmesini önlemek tüm deneysel işlemin için baş bir kap ve eldiven giyilmelidir.

1. hazırlanması örnekleri

PA dokuları (0.2 - 0.5 mg) Nöroşirürji bölümünden toplamak. Hemen sıvı azot donma ve sonra-80 ° C depolama için transfer.
Ekle 2 mL % 0,9 NaCl deiyonize distile su (GKD₂O). Bu çözüm kan doku yüzey (3 x) hafifçe yıkamak için kullanın.
Not: GKD₂O 18,2 MΩ/cm iletkenliği ile boyunca protokolünün kullanılır. Bazı tissuemight zaman kan mendil'ın yüzey yıkama kaybolur.
Bir birim (10 mL; 4 ° C'de) 2 M Asetik asit ve % 0.1 (v/v) β-mercaptoethanol her 0,5 - 0,6 g doku için içeren çözüm eklemek, (1 dk, 13000 rpm, 4 ° C, 10 x) ile bir doku homogenizer homojenize, homogenate 20 için solüsyon içeren temizleyicide s, lyophilize ve −80 ° C.
Lyophilized protein içeriğini ölçmek, bicinchoninic asit (BCA) kullanarak homojenize örnekleri kiti tahlil.
Not: BCA miktar mutlak bir miktar değildir ve ölçülen sonuç farklı bir teknisyen ve deneysel ajan ile değiştirilecek. Bir sabit konsantrasyon örnek standart farklı deneyler için kullanılmalıdır. Bu nedenle, protein 2B her jel için son yükleme miktarı önceden tasarlanmış deneylerde gümüş lekeli veya Coomassie lekeli iyi çözünürlüklü görüntü ile belirlenecektir.
1. Yaklaşık 300 µg lyophilized homojenize örnek protein ayıklama bir birime (282 µL) eklemek arabellek (8 M üre ve % 4 çocuklar), ardından 2s için ayakta, 1 h, tekrar 5 min için su banyosunda sonicating için dönüşümlü 5 min için bir su banyosunda sonicating , tekrar 1 h için döndürme ve 15.000 x g 20 dk için de centrifuging.
2. BSA standart çözümler konsantrasyonları ile belirtildiği gibi hazırlamak: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 µg/mL ticari BSA standart (2 mg/mL) ile.
3. Mix BCA Reaktif A ve B (A:B 50: 1 =) BCA çalışma çözüm kullanmak için önceden olarak.
4. BCA çalışma çözüm karıştırma ve 30 dk 37 ° C'de kuluçka ardından bir microfuge tüp 2 mL 0.1 mL numune veya standart çözüm ekleyin. Son olarak, oda sıcaklığında 10 dakika serin ve A ölçmek_{562 nm} od değer.
5. Standart doğrusal hat hesaplamak (A_{562 nm} BSA konsantrasyon vs) örnek protein_562nm değeri ile içerik hesaplamak için regresyon denklemi elde edilir.
Protein eşdeğer lyophilized örneği gümüş boyama için 150 µg veya 500 µg boyama, bir 18-cm immobilize pH degrade (IPG) şerit pH için 3-10 doğrusal olmayan (NL) Coomassie için protein kullanın.
Not: IPG kuru 0,5 mm kalınlığında ve 3 mm çapında, 7, 11, 13, 18 ve 24 cm ve pH 4-5, 4-7, 6-9 ve 3-10 ya da doğrusal veya doğrusal olmayan pH Gradyanda dahil olmak üzere farklı pH aralığı da dahil olmak üzere farklı uzunlukları ile bandıdır. IPG arabelleği şerit²⁷^,²⁸sığması gerekir.
Arabellek ayıklama 1.6.Add 250 µL (7 M üre, 2 M Tioüre, %4 (w/v) arkadaşlar, 100 mM DTT (eklemek kullanılmadan önce), % 0,5 v/v pharmalyte (kullanılmadan önce eklemek) ve bromophenol mavi iz).
Çözüm vortexing 5 dk, 5 dk sonicating ve 50 min için döndürme için ardından 30 ° C'den tutun.
Rehidrasyon arabelleği 110 µL eklemek (7 M üre, 2 M Tioüre, %4 (w/v) arkadaşlar, 60 mM DTT (eklemek kullanılmadan önce), % 0,5 v/v IPG arabellek (kullanılmadan önce eklemek) ve bromophenol mavi iz). 5 min için solüsyon içeren temizleyicide. Sonra örnek 50 dk, 5 dk için girdap ve 15.000 x g de 20 dk santrifüj döndürün.
Süpernatant (350 µL) protein örnek çözüm⁸olarak toplamak.

2. iki boyutlu Jel Elektroforez

IEF (ilk boyut): IEF aşağıda açıklandığı gibi isoelectric odak sistem üzerinde gerçekleştir.
1. Protein örnek çözüm 350 µL 18 cm IPG şerit tutucu yuvasında ekleyin.
2. Bir 18 cm IPG şerit jel-yan-protein örnek çözümü bırak (kabarcıklar önlemek).
3. Mineral yağ IPG şerit kapsayacak şekilde 3-4 mL ekleyin.
4. IPG şerit sahibi isoelectric odaklama systemwith sivri uç geri (+) plaka ve kare sonu açık (−) plaka üzerinde topla.
5. Gecede (oda sıcaklığında ~ 18 h) suyla temasa.
6. IEF parametrelerini ayarlamak: maksimum geçerli 30 µA başına şerit, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, adım ve tutun; 1000 V, 1 h, 500 Vh, degrade; 8.000 V, 1 h, 4.000 Vh, degrade; 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, adım ve tutun; ve 500 V, 0,5 h, 250 Vh, adım ve tutun. Bir toplam süresi 7,5 h ve 36.875 Vh çalışmasına izin.
7. Yardımcı sonra her IPG şerit ve ilave mineral yağ bir çözünmez kağıt havlu ile sökün. Şimdi şerit plastik wrap bir yaprak sarma ve saklamak −80 ° C.
  Not: IPGstrip tutucu temizleme solüsyonu IPGstrip sahibi ile temizlenmelidir ve distile su.
SDS-sayfa (ikinci boyut): gerçekleştirmek SDS-sayfa dikey hücre Elektroforez Sistemi
Not: Her SDS-sayfa jel boyutu 255 x 190 x 1 mm olmalıdır.
1. % 12 oyuncular için bir çok jel pudra kullanın sayfa jelleri çözme. Döküm için % 12 sayfa jelleri, aşağıdaki adımları uygulayın.
  1. GKD₂O, 1.5 150 mL 270 mL ekleyin M Tris-HCl (pH 8.8), 180 mL % 40 (w/v) Akrilamid/bisacrylamide stok çözeltisi (29:1, % 40 w/v Akrilamid ve %1.38 w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 mL % 10 amonyum persülfat ve jel yapmak için TEMED 150 µL çözüm bir ölçek. Karışımı yavaşça ve kabarcıklar kaçının.
  2. Jel çözüm yavaşça beklenen jel Yükseklik (19 cm) kadar çok noktaya yayın odası içine dökün.
  3. Hemen yaklaşık 3 mL GKD₂O jelleri kapsayacak şekilde çözme her jel ekleyin. 1 h için polimerize jel izin.
2. Elektroforez arabelleği (25 mM Tris, 192 mM gliserin ve % 0.1 SDS) 20 L hazırlayın. Elektroforez ayırma birimi arabellek tank bu arabellek ile doldurun.
3. Dondurucu odaklı IPG şeritler çıkar ve denge arabellek (375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 6 M üre, %2 (w/v) SDS, %20 (v/v) gliserol, % 2 w/v DTT (önce Ekle) azaltmak 4 mL yavaşça içinde rock yaparak şeritler için 10 dk equilibrate ve bromophenol mavi iz).
4. 10 dakikadır yavaşça azaltılmış IPG şeritler 4 mL alkillenme denge arabelleği rock yaparak equilibrate (375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 6 M üre, %2 (w/v) SDS, %20 (v/v) gliserol, % 2,5 w/v iodoacetamide (kullanılmadan önce eklemek) ve bromophenol mavi iz).
5. Jel denge sırasında çok noktaya yayın odası sökmeye ve hazırlanan çözme jel kaset al. GKD ile₂O. Kaldır aşırı GKD₂O bir çözünmez kağıt havlu ile 3 x durulama ve bir jel stander koymak.
6. Denge IPG şeritler Elektroforez arabellek ile durulayın ve çözünmez kağıt havlu ile IPG şerit yüzeyindeki aşırı sıvı kaldırın.
7. Bir IPG şerit çözme SDS-sayfa jel koyun ve IPG Şerit'ın plastik yan uzun cam levha ve sol sivri ucunu başvurun verelim.
8. 3-4 mL sıcak % 1'özel SDS Elektroforez arabelleği (~ 80 ° C) hızlı bir şekilde IPG şerit imzalamaya her SDS-sayfa jel üstüne dökün ve IPG şerit aşağı daha kısa cam levha kabarcıklar olmadan üst yüzeye koyup 10 dakikadır polimerize.
9. Dikey Elektroforez Sistemi plastik contalar arasında dikey olarak birleştirilmiş jel kaset yerleştirin. Jel katot (−) yanında IPG şeridi ile üst koymak.
10. Elektroforez jel kaset sokmak için arabellek düzeyini ayarlayın.
11. Bağlanmak ve sabit voltaj modunda güç kaynağı/kontrol ünitesi ve 200 V yaklaşık 370 min için boya izleme sırasında çalışması.
12. Çalışan sonra jel kaset Elektroforez sisteminden çıkar ve jel 2DE ayrılmış proteinlerin boyama tarafından takip jel, yırtılma kaçınarak jel kaset yavaşça kaldırın.
2DE ayrılmış proteinlerin boyama
1. Gümüş boyama
  1. Yavaşça jel 250 mL fiksasyon çözeltisi (% 50 metanol (v/v) ve (v/v) % 5 Asetik asit) içeren bir tepsi içinde iki elle aktarmak ve yavaşça 20 dk için jel sallamak.
  2. Çözüm atın ve 250 mL % 50 (v/v) metanol içinde belgili tanımlık tepsi ekleyin ve hafifçe sallayın 10 dakikadır.
  3. Metanol atın ve 250 mL GKD₂O içinde belgili tanımlık tepsi ekleyin. 10 dakikadır hafifçe sallayın.
  4. Yavaşça 1 dk. için jel 250 mL %0.02 (w/v) sodyum thiosulfate içeren Sensitizasyonu arabellek sallamak ve sıvı atın.
  5. Yavaşça GKD₂O için 1 dk (tekrar bir kez daha) 250 ml jel sallamak. Sıvı her adımdan sonra atın.
  6. Yavaşça 20 dk için jel 250 mL gümüş tepki çözüm (%0,1 (w/v) gümüş nitrat kullanılmadan önce eklendi 200 µL % 37 (v/v) formaldehit ile) sallamak.
  7. Yavaşça GKD₂O için 1 dk (tekrar bir kez daha) 250 ml jel sallamak. Sıvı her adımdan sonra atın.
  8. Shake jel 250 mL geliştirme çözümü içinde yavaşça (%3 (w/v) Sodyum karbonat 100 µL % 37 (v/v) formaldehit ile kullanılmadan önce eklendi) Boyama istenen yoğunluğu (genellikle 1-3 dk), elde edilir kadar sonra atmak sıvı.
  9. Yavaşça 10 min için jel 250 mL çözüm (%5 (v/v) Asetik asit) durdurma sallamak ve sıvı atın.
  10. Yavaşça 5 dk'ya 250 ml GKD₂O sallamak ve sıvı atın.
  11. 250 mL % 8.8 gliserol 4 ° C'de çözüm depolama jel tutmak
2. Coomassie parlak mavi boyama
  1. Çözüm Coomassie parlak çözülerek boyama Coomassie hazırlamak G250 0.3 g, 25 g amonyum sülfat ve fosforik asit GKD₂O ve en fazla 200 mL toplam hacmi 25 mL mavi. Önce metanol ekle 50 mL.
  2. Jel çözüm boyama Coomassie 250 mL ekleyin ve hafifçe kadar temiz oda sıcaklığında sallamak protein noktalar görünür (~ 2-4 h). Sıvı atmak.
  3. GKD₂O 250 mL ekleyin ve yavaş yavaş 5 dk, sonra iki kez daha fazla çalkalanır. Sıvı atmak.
  4. 250 mL destaining çözeltisi (% 20 (v/v) etanol) eklemek ve arka plan rengini neredeyse renksiz hale ve sıvı atmak kadar yavaşça sallayın.
  5. Ne zaman eski bir hava kararıyor taze destaining çözüm ile değiştirin ve sıvı atın.
  6. GKD₂O 250 mL ekleyin ve yavaş yavaş 5 dk. atma sıvı sallamak.
  7. Depolama çözümü (% 8.8 gliserol) 250 mL ekleyin ve 4 ° C'de tutmak
İki boyutlu Jel Elektroforez görüntü analizi
1. Lekeli jelleri Düz Yataklı Tarayıcı ile dijital ortama.
2. Görüntü 2D jel görüntü analiz sistemi girdi.
3. Algılamak ve üreticinin protokolüne göre bir 2D jel görüntü analiz yazılımı kullanarak her spot ölçmek.
4. Farklı jelleri arasındaki noktalar aynı.

3. kimlik ile Bayan 2DE ayrılmış proteinlerin

Tryptic peptid karışımı hazırlanması
Not: Silikonlu veya düşük tutma tüpler ve pipet ipuçları proteinler veya peptidler kaybı önlemek için kullanılmalıdır.
1. Gümüş-jel destaining
  1. Noktalar 1,5 mL silikonlu içine tüp ve 500 µL GKD₂O 6 kez yıkayın jel tüketim.
  2. Yıkanmış jel yeni silikonlu 1,5 mL tüp içine koymak ve birçok küçük parçalar halinde kıyma (0,5-1 mm³).
  3. 20 µL jel parçaları 30 mM potasyum ferricyanide bir parçası ve 100 mM sodyum thiosulfate (1:1) kullanım öncesinde bir parçası (genellikle 1-2 dk) ortadan kahverengimsi renk izin vermek karışımları destaining çözüm destain. Sıvı atmak.
  4. 5 - 6 kez GKD₂O 20 µL ile jel parçalarını yıkamak yok sarı renk izin vermek. Sıvı her adımdan sonra atın.
  5. 200 mM amonyum bikarbonat 20 µL jel parçaları ekleyin ve 20 dk. yıkama için jel adet (20 µL, 1 saat) ile GKD₂O dur. Sıvı atmak.
  6. 30 µL Asetonitril jel taşlarla en az iki kez açmak için 30 dk kuru bir opak beyaz ve vakum-santrifüj jel adet izin kurutmak.
2. Parlak mavi jel Coomassie destaining
  1. Jel noktalar silikonlu 1,5 mL tüp içine kesilmiş ve 500 µL GKD₂ile O en az 3 kez yıkayın.
  2. Yıkanmış jel bir yeni 1.5 mL siliconized tüp içine koymak ve birkaç parçaya kıyma (0,5-1 mm³) bir pipet ucu ile.
  3. Jel 50-100 µL destaining çözümü (1:1 v/v mix 200 mM NH₄HCO₃ ile Asetonitril) jel hacmine bağlı olarak destain, bir su banyosu içinde 37 ° C'de kuluçkaya. Tekrarlayın ve (~ 1 h) rengi kayboluncaya kadar taze destaining çözüm ekleyin. Sıvı her adımdan sonra atın.
  4. GKD₂O. bir kez ile 20 µL jel parçalarını yıkayın
  5. Jel parçalar halinde bir opak beyaz açmak jel adet izin 100 µL Asetonitril (en az iki kez) kurutmak.
  6. Vakum için 30 dk kuru.
3. Jel tripsin sindirim kurutulmuş jel parçalar halinde proteinlerin
  1. 20 µg (833 pmol) 50 mM asetik asitin 100 µL tripsin liyofilize toz geçiyoruz.
  2. Tripsin çözüm (200 ng/µL) 20 µL 16 ng/µL 230 µL 50 mM amonyum bikarbonat ile oranında seyreltin.
  3. 20-30 µL ekleyin (0,32-0.48 µg) kurutulmuş jel parçaları içeren her tüpün seyreltilmiş tripsin çözüm. 18-20 h su banyosu içinde 37 ° C'de için kuluçkaya. 4 ° C'de 30 dk için stand çözüm ver.
  4. Çözüm yavaşça su banyosu için 5-6 dk 30 ° C'de 10 s. Sonicate için santrifüj kapasitesi ve 12.000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi.
  5. Toplamak 0.5 mL tryptic peptid karışımı içeren süpernatant tüp silikonlu.
4. Tryptic peptid karışımı C18 microcolumn ile arıtma.
  1. Her C18 sütun Asetonitril (10 µL, 5 kez) ve o zaman % 50 Asetonitril (10 µL, 5 kez) ile yıkayın.
  2. % 0.1 trifluoro Asetik asit (TFA) (10 µL, 5 kez) ile equilibrate.
  3. Örnek yukarı ve aşağı için 15 kez hazırlanan C18 sütunu boyunca pipette.
  4. Örnek 2 yıkama x 10 µL % 0.1 ile TFA.
    Not: Saf tryptic peptidler C18 sütununda korunur.
  5. Bir birim (6 µL) çözeltisi (% 85 v/v acetonitrile/0.1% v/v formik asit) bir temiz 0.5 mL siliconized tüp içinde eklemek, bu çözüm yavaşça pipette ve yukarı ve aşağı yavaş yavaş peptid-C18 boncuk bond peptidler çözüm içine yıkamak 10 x için aracılığıyla kuruması ve MS analizi için mağaza (−20 ° C).
MS analizi
1. MALDI-MS PMF analizi
  1. 4 µL % 85 v/v acetonitrile/0.1% v/v arıtılmış tryptic peptid karışımı çözülmeye TFA ekleyin. Yük 2 çözünmüş µL tryptic peptid karışımı bir maldı plaka üzerine ve hemen ekleyin 2 µL 10 g/L 500 mL/L Asetonitril içerir a-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) çözüm 1 mL/L TFA, sonra kuruması.
  2. Tryptic peptid karışımı ile maldı plaka maldı-MS Kütle Spektrometre yükleyin.
    Not: Aracı parametreleri reflektör modu 20 olarak ayarlanmıştır kV gerilim, pozitif polarite ve 160 ns gecikme çıkarma süresi hızlandırılması. Her MS spektrum m/z 1000-4000 bir dizi ile 200 lazer çekin sonra dış kalibrasyon standart peptid ile kazanılır kitle.
  3. Bir MS spektrum-işleme yazılımı temel düzeltme, gürültü kaldırma (% 5) ve en yüksek deisotoping da dahil olmak üzere her MS spektrum işlemek için kullanın.
  4. Tripsin, matris, keratins ve bilinmeyen diğer kirletici boş-jel deneyler paralel bulaşıcı modellerden kaldırılması ile her MS spektrum kitle listeden düzeltin.
  5. Düzeltilmiş kitle cevapsız tripsin 1 en fazla bölünme, sabit bir PMF tabanlı protein araştırıcı proteinler İsviçre-Prot protein veritabanındaki PMF arama türü, insan, dahil olmak üzere aşağıdaki arama parametreleri ile belirlemek için bilgisayar yazılımı içine liste girişi carbamidomethyl sistein, değişken metiyonin oksidasyon, monoisotopic, peptid kitle tolerans 50 ppm, peptid sorumlu devlet (1 +) ve sinyal gürültü (S/N) 5.0.
  6. Proteinler ile istatistiksel olarak anlamlı protein Skorlar, tanımlamak ve nerede protein skor-10 × log(p), p gözlenen maç rastgele bir olay olma olasılığını nerede =.
2. MALDI-MS/MS analizi
  1. 4 µL % 50 v/v acetonitrile/0.1% v/v arıtılmış tryptic peptid karışımı çözülmeye TFA ekleyin. Her saf tryptic peptid karışımı (0.5 µL) 384-iyi maldı-tabak içinde benekli, hemen 0,5 µL % 50 acetonitrile/0.1% TFA peptid örnek üst doymuş CHCA matrisin lekeli ve havada kurutulmuş.
  2. 100 lazer çekim bir MS1 spektrum, elde etmek için kullanarak otomatik olarak yönetilecek MALDI-TOF-TOF MS/MS izin ve biriken 6 MS1 spectra bir sentetik MS1 spektrum tekrar.
  3. 4 en yoğun habercisi iyonları her sentetik MS1 spektrum MS/MS analizi için ayarlayın. Kullanım 100 lazer çekim bir MS/MS spektrum elde etmek ve 4 birikir her öncül iyon için MS/MS spectra bir sentetik MS/MS spektrum tekrarladı.
  4. Sentetik MS/MS veri proteinler Yazılım MS/MS iyon arama, İsviçre-Prot insan veritabanı, en fazla 1 cevapsız bölünme, sabit carbamidomethyl (C), değişken tripsin dahil olmak üzere parametreleri ile arama bir MS/MS tabanlı protein aracılığıyla aramak için kullanın Oksidasyon (M), monoisotopic kitle değer, peptid kitle tolerans ± 100 ppm ve parça kitle tolerans ± 0.7 Da.
  5. Mowse puan ve iyonları puanı göre istatistiksel olarak anlamlı bir olasılık ile bir protein belirlemek -10 = Log(P), p gözlenen maç rastgele bir olay olma olasılığını nerede x.
3. LC-ESI-MS/MS analizi
  1. 6 µL arıtılmış tryptic peptid karışımı çözülmeye % 5 v/v acetonitrile/0.1% v/v formik asit ekleyin.
  2. Yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) sistemi online bir electrospray iyonlaşma (ESI) ile birleştiğinde kullanmak-MS/MS Kütle Spektrometre ile bütün operasyonu yönetmek için bir MS/MS veri alınan yönetim yazılımı.
  3. C18 tuzak sütun (300 µm kimlik × 5 mm Uzunluk) ve % 98'i solvent (%0,1 formik asit), bir ayrılık gradyan ile ters fazlı C18 sütun (75 µm kimlik x 15 cm uzunluk) ve % 2 çözücü B kullanın (%0,1 formik asit % 100 Asetonitril) için 2 dk , 2-% 40 çözücü B 45 dk, 5 min için % 40 ila % 95 çözücü B ve % 95 çözücü B 10 dakika (300 nL/dk 65 dk toplam).
  4. Pozitif iyon ve MS ve MS/MS spectra elde etmek ve ayrılma (CID) çarpışma indüklenen iyon parçalanma için ayarlamak için veri bağımlı otomatik anket modları ayarlayın.
  5. Her MS tarama m/z 350-1.800 kitle bir dizi 100.000 m/z 400, çözünürlük için ayarlayın. MS tarama 7 en yoğun iyonu için tarama gerçekleştirin.
  6. Kullanım MS/MS tabanlı protein yazılım arama ben kimlik proteinlerin veritabanını aramak için.
    1. İnsan proteini veritabanını seçin.
    2. Tripsin bir cevapsız bölünme site izin seçin.
    3. Peptid toleransı (±10 ppm) ayarla, iyon toleransı (±0.8 Da), sistein, peptid sabit ücret (2 +, 3 + ve 4 +), carbamidomethylation ve metionin, değişken oksidasyon parçası.
    4. Ayarla yanlış bulma oranları (FDR) < % 1 ve sadece peptidler sırası 1 ile kabul edilir.
    5. Protein PSM≥1 ile tanımlamak (PSMs: tanımlanan peptid dizileri (PSMs) protein artıksız tespit de dahil olmak üzere, toplam sayısı) ve protein başına en az iki benzersiz peptidler.
  7. Ayrıca, protein arama yazılımı MS/MS tabanlı II proteinler tanımlaması veritabanını aramak için kullanın.
    1. Ham MS dosyasını .mgf dosyasına dönüştürme.
    2. İnsan proteini veritabanı (uniprothuman_20161031.fasta 70940 dizileri ve 23897047 kalıntılar içeren) seçili.
    3. Tripsin sindirim en fazla 2 cevapsız nefrette seçin.
    4. Sabit carbamidomethyl (C), değişken deamidated (NQ) ve oksidasyon (M), öncül iyon kitle toleransı 10 ppm, kızı iyon kütle tolerans 0.8 kümesi Da ve monoisotopic en yüksek.
    5. Proteinler 0,05 ve en az 2 benzersiz peptidler önem eşik ile tanımlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. 2DE-maldı MS PMF: yukarıda açıklanan deneysel bir işlem ile toplam 150 µg proteinlerin NFPA FSH ifade edilen dokulardan elde (erkek; 50 yıl yaşlı, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+) ve TSH (-)) ve bir 18 cm ile dizilmiş IPG Şerit (pH 3-10 NL) ve bir geniş formatlı SDS-sayfa jeli, gümüş boyama ile görüntülenir. NFPA doku Proteom (şekil 1), bir ortalama konum sapma 1,98 ± IEF yönde 0,75 mm ile ve 1.62 ± 0.68 mm SDS-sayfa yönünü ve yaklaşık 1200 protein benekli bir tekrarlanabilir ve iyi 2DE jel desen elde esas olarak pH 4-8 ve kitle 15-150 kDa³alanı içinde dağıtılmış olup 2DE jel harita algılandı. Toplamda, 337 jel noktalar varlığına ve tabi jel destaining, tripsin sindirim, arıtma tryptic peptidler ve MALDI-TOF-Bayan PMF analiz için. PMF veri protein kimliği ile insan proteini veritabanıyla maskot aramak için kullanıldı. Toplam 192 gereksiz proteinlerin (107 nonredundant proteinler temsil eden) 337 analiz jel noktalar dışında 141 jel noktalardan tespit edildi (141/337 = %42), ve hiç protein 196 noktalar tespit edilmiştir (196/337 = %58) (Tablo 1). 141 bu noktalar, nokta başına yalnızca bir protein tespit için 121 noktalar, nokta başına 2 proteinleri tespit edilmiştir (noktalar 31, 32, 33, 41, 42, 43, 44, 68, 75, 137, 148 ve 224) 12 noktalar içinde nokta başına 5 proteinler 3 sıraya (noktalar 19 tespit edilmiştir 22 ve 23), nokta başına 6 protein 3 sıraya (noktalar 24, 91 ve 93) tespit edildi ve nokta başına 7 proteinler 2 pozisyon (noktalar 72 ve 92) tespit edildi.

2. 2DE-maldı MS/MS ve 2DE-LC-MS/MS: yukarıda açıklanan deneysel bir işlem kullanarak, toplam 500 µg bir invaziv NFPA doku (erkek, 22 yaşında, ACTH (-), hGH (-), PRL (++), LH (-) ve FSH (-)) çıkarılan protein dizilmiş bir 18 cm IPG Şerit () ile pH 3-10 NL) ve bir geniş formatlı SDS-sayfa jel, Coomassie mavi G250 boyama ile görüntülenir. Bu yaklaşık bir ortalama konum sapma 1,95 ± IEF yönde 0,85 mm ile invaziv NFPA doku Proteom (Resim 2) ve 1.85 ± 0,79 mm SDS-sayfa yönünü ve ile bir tekrarlanabilir ve kaliteli 2DE jel desen vermiştir boyama esas olarak pH 4-8 ve kitle 15-150 kDa²⁹Aralık içinde dağıtılmış olup 2DE jel harita 1.100 protein spotsdetected. 10 noktalar rastgele seçilmiş ve Şekil 2 ' de çıkarılan ve tabi için jel destaining edildi etiketli, tripsin sindirim, arıtma tryptic peptidler, ardından maldı-MS/MS ve LC-ESI-MS/MS analizleri. Her MS/MS veri kümesi protein kimliği ile insan proteini veritabanıyla maskot aramak için kullanıldı. Tüm noktalar için ise MALDI-TOF-TOF MS/MS analizi ile nokta başına 1 protein ortalama tespit edilmiştir birçok protein (63 proteinler tek jel nokta arasında ortalama, ortalama 2 eşleşen noktalar bir havuzda 71 proteinlerin ve ortalama 3 Eşleştir bir havuzda 118 proteinlerin Hed jel lekeler) karşılık gelen her yerde LC-ESI-MS/MS analizi (Tablo 2) ile tespit edilmiştir. Burada, bir LC-ESI-MS/MS sistem bir çok daha yüksek duyarlılık ve çözünürlük maldı-MS/MS analiz sistemi göreli olduğunu belirtmek zorundadır. Bu veri açıkça her 2D jel spot birçok protein, karmaşık insan kanser dokusu Proteom bir ya da iki protein içerdiğini gösterir.

Resim 1 : Gümüş lekeli IPGstrip pH 3 ile analiz bir FSH ifade NFPA Proteom 2-DE desen - SDS-sayfa 10 NL ve % 12'si jel konsantrasyonu. Kırmızı-kahverengi lekeler gümüş lekeli proteinler, turuncu arka plan gümüş lekeli jel. Etiketli noktalar MALDI-TOF-Bayan PMF ile analiz edildi. Wang X, et al. çoğaltılamaz (2015) ³, Wiley-VCH izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Coomassie mavi lekeli IPGstrip pH ile 3 - analiz bir NFPA Proteom 2-DE desen SDS-sayfa 10 NL ve % 12'si jel konsantrasyonu. Etiketli noktalar MALDI-TOF-TOF MS/MS ve LC-ESI-MS/MSile analiz edildi. Noktalar 1 *, 2 *, 3 * 5 * ve 16 * karşılık gelen noktalar 1, 2, 3, 5 ve 16 uyumlu ve 2 eşleşen jelleri havuza alınmış. Zhan X, vd. modifiye (2018) ²⁹, Wiley-VCH izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Table 1
Tablo 1: Sayı her 2DE tanımlananların proteinlerin MALDI-TOF-Bayan PMF analizi ile spot jel..

Table 2
Tablo 2: Her 2DE jel spot MS/MS analizi ile tespit edilmiştir proteinler sayısı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

2DE 2DE-MS PMF ve 2DE-MS/MS, MS yöntemleri ile birleştiğinde, başarılı bir şekilde kullanılmıştır bizim uzun vadeli programı - insan NFPA proteomik varyasyonları ve moleküler ağ çeşitleri için moleküler mekanizmaları aydınlatma çalışmaya proteomik kullanımı ve NFPAs için etkili biyolojik keşfi. İyi tekrarlanabilirlik ile karşılaştırmalı proteomik 2DE tabanlı NFPA proteomik varyasyonları⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^, tanımlaması içinde önemli bir rol oynar ¹⁹ve antikor yöntemi ile birleştiğinde 2DE gösterir avantajları verilen translasyonel modifikasyon tespiti ve tirozin nitration¹⁶^,¹⁷ tespiti gibi belirli bir protein türevleri ^, ¹⁸ ve GH türevleri¹⁴^,¹⁵.

Ancak, MS yöntemi ile birleştiğinde 2DE düşük bereket proteinler, hidrofobik proteinler, son derece temel veya asidik protein ve son derece düşük veya yüksek kitle proteinler²analizlerde zorluklarla emek yoğun bir teknik olarak kabul edilir. Örneğin, son derece düşük kütle (< 10 kDa) veya yüksek-kütle (> 150 kDa) proteinler ve son derece temel (PI > 7.5 veya 8) veya asidik (pI < 3.5 veya 4) proteinler değil kolayca algılanır 2DE bir 18 cm ile tarafından IPG şerit pH 3-10 NL³. Jel içermeyen ayırma yöntemleri, kararlı izotop iTRAQ ve TMT gibi son on yıl²³' te, etiketleme ile birleştiğinde iki boyutlu sıvı Kromatografi (2D-LC) dahil olmak üzere hızla gelişmesi ile bu 2 DE yavaş yavaş üzerinden çekilmiş görünüyor onun proteomik Merkezi statüsünde araştırma karmaşık doku Proteom analizde kararlı izotop etiketleme ile 2D-LC birleştiğinde ve MS/MS yöntemleri etkili 2DE tabanlı yöntemleri sakıncaları üstesinden çünkü.

LC-ESI-MS / (1-10 Ekrem aralıkta hassasiyeti olduğunu) MS 2DE ayrılmış proteinlerin tanımlama gibi yüksek-duyarlı kütle spektrometresi kullanımı ile 2-DE yöntemi yeni özellikleri show keşfedildi, son yıllarda yapılan çalışmalarda bulundu 2B nokta jel birçok protein (Tablo 2) içerir. Sayaç yer, başına yalnızca bir veya iki proteinler geleneksel kavramına dünya 2DPAGE veritabanı tarafından kanıtlanan ran bu (Dünya-2DPAGE portal: http://world-2dpage.expasy.org/portal). Bu açıkça 2-DE karmaşık bir insan Proteom proteinler kimliğine verim--dan bir daha önce kabul, yani çok daha yüksek olduğunu göstermektedir bir 2D jel yerde sadece bir veya iki proteinler vardı. Bu techinique Allah'ın 2DE proteomik alanında kullanıma sunmaktadır. Üzerinde ayrı bir 2DE sonuna kadar Proteom karmaşıklığını basitleştirmek için daha ayrıntılı bir ayrılık teknik karmaşık insan Proteom, böylece 2DE analizinde bin-10 bin noktalar³^,⁸^,²² yaşında örnekleri önce 2D-LC sistemi göre LC-MS/MS analizi ilk boyutlu LC genellikle 18-30 kesirleri LC-MS/MS analiz önce oluşturur. Bu nedenle, yüksek-duyarlı kütle spektrometresi ile birlikte 2DE muazzam bilgi başvuru harita için özellikle bu düşük için karmaşık insan Proteom kurmak veya son derece düşük bereket proteinler için kullanılabilir. Buna ek olarak, 2-DE kararlı izotop ile birlikte (iTRAQ, TMT ve SILAC gibi) etiketleme ve yüksek-duyarlı kütle spektrometresi büyük ölçekli proteomik varyasyonları farklı koşullar arasında ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, 2DE kararlı izotop etiketleme ile birleştiğinde ve yüksek-duyarlı kütle spektrometresi büyük ölçekli algılama ve miktar protein PTMs, protein türevleri, protein Türleşme ve protein tür mutlak avantajları vardır. Bu avantajları 2DE proteomik alanında canlanmış olacak.

Ayrıca, burada açıklanan insan PA doku Proteom analizler için mevcut protokolleri kolayca diğer insan hastalık proteomes çalışmaya dönüştürülür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çatışma olduğunu ilan eder.

Acknowledgments

Bu eser Çin (Grant Hayır 81572278 ve 81272798 olarak XZ), Çin "863" planı Projesi (Grant No XZ için 2014AA020610-1), Hunan ve yetenek Giriº (XZ) Xiangya hastane fon gelen hibe Ulusal doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Çin'in il doğal Bilim Vakfı (XZ için Grant No. 14JJ7008). Yazarlar da Dr Dominic M. Desiderio Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi içinde bilimsel katkısını kabul. X.Z. sürekli olarak geliştirilen ve 2DE-MS yöntemleri 2001'den başlayarak hipofiz adenom Proteom çözümlemek için kullanılan, mevcut el yazması için kavram gebe, yazdı ve el yazması revize, ilgili çalışmaları koordine ve sorumlu mali desteği ve karşılık gelen çalışma. Yl el yazması revizyonunda katıldı. Y.H başvurular topluluğu ve el yazması revizyonu'na katılmıştır. Tüm yazarlar son el yazması onayladı.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ettan IPGphor 3	GE Healthcare		isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS	ABI, Foster City,CA		MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF	Autoflex III, Bruker		MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA		ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system	Proxeon Biosystems, Odense, Denmark		High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column	300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column	75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe	Kimvipe		Insoluble paper towel
Watter	Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer	Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest	Bio-Rad, Hercules, CA		2D gel image analysis software
SEQUEST	Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software			MS spectrum-processing software
Mascot software			PMF-based protein searching software
Mascot software			MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta	Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1			MS/MS data-acquired management software
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta			Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)			MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)			MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn	Millipore
PeptideMass Standard kit	Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
2-D Quant Kit	GE Healthcare	80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE	AMRESCO	0172
ACRYLAMIDE	AMRESCO	0341
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Urea	VETEC	V900119
SDS	AMRESCO	0227
CHAPS	AMRESCO	0465
TEMED	AMRESCO	M146
Ammonium Persulfate	AMRESCO	M133
Trypsin	Promega, Madison, WI, USA	V5111
IPG buffer pH 3-10, NL	GE Healthcare	17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm	GE Healthcare	17-1235-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).
Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).
Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. , (2018).

Cancer Research

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.