需要一种动物模型来解析循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移过程中促进肺部定植的作用。在此，我们建立并成功实施了一种体内检测方法，专门用于验证CTC表面聚合纤连蛋白（polyFN）组装对肺部定植的必要性。
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摘要
摘要
转移是导致癌症死亡的主要原因。循环肿瘤细胞（CTCs）在促进癌症转移中的作用已被广泛研究，其中CTCs在肺部的定植对早期肺转移过程具有关键贡献。因此，动物模型是唯一能够完整模拟转移全身性过程的研究手段。鉴于既往用于研究CTCs在血管外渗中作用的实验设计存在诸多问题，我们建立了一种 体内 肺定植实验，采用长期荧光细胞示踪剂羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记悬浮肿瘤细胞，并在切除肺组织前进行肺灌注以清除非特异性滞留的循环肿瘤细胞（CTCs），随后进行共聚焦成像与定量分析。研究发现，CTC表面组装的聚合纤连蛋白（polyFN）在转移性肿瘤组织的最终建立过程中介导了肺定植。在此，为特异性验证CTCs表面polyFN组装在肺定植及血管外渗过程中的必要性，我们开展了短期肺定植实验，将稳定表达FN-shRNA（shFN）或对照scramble-shRNA（shScr）、并预先用20 μM CFSE标记的悬浮Lewis肺癌细胞（LLCs）经尾静脉接种至C57BL/6小鼠体内。我们成功证明，与shScr LLC细胞相比，shFN LLC细胞在小鼠肺部的定植能力显著降低。因此，该短期实验方法可广泛应用于特异性验证循环中CTCs的肺定植能力。
引言
转移是导致癌症死亡的主要原因1,2。来源于原发组织的肿瘤细胞以悬浮状态进入循环系统，并在定植远端器官之前，需耐受多种血源性挑战，例如，失巢凋亡、免疫攻击以及由血压或几何限制引起的剪切应力所造成的损伤，而远端器官定植是决定转移成功的关键步骤3,4,5,6。因此，目前人们正大力开展循环肿瘤细胞（CTCs）的特征分析，并将这些特征与肿瘤恶性程度、转移能力及癌症患者的生存率相关联7,8,9。由于癌症转移过程特指一种体内事件，动物模型是唯一能够完整再现转移系统性全过程的研究手段10,11,12。
循环肿瘤细胞（C....
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方案
所有小鼠实验均按照本机构的指南（《实验动物护理和使用指南》，成功大学医学院）进行。
1. 仪器、培养基和培养皿的准备
- 开始实验操作前，准备无菌外科缝线、1 mL 注射器配 26G/0.5 cm 针头（用于尾静脉注射）、3 mL 注射器配 24G/3 cm 针头（用于肺灌注）、杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、胰蛋白酶-EDTA 溶液（5 g/L 胰蛋白酶和 0.53 mM EDTA）、胎牛血清（FBS）、1× 磷酸盐缓冲液（PBS）（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2PHO4 和 1.8 mM KH2PO4），以及 6 cm 培养皿。
2. 悬浮肿瘤细胞的制备与回收
- 准备无菌的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），含 10% 或 20% 胎牛血清（FBS），并新鲜添加 2 mM L-谷氨酰胺、1× PBS 和 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。
- 在含 10% FBS 的 DMEM 培养基中，于 37 °C 培养细胞，直至培养皿中细胞融合度达到 70–80%。
- 从培养皿中移除培养基（DMEM），随后用 2 mL 无菌 1× PBS 洗涤两次。
- 向培养皿中加入 1 mL ....
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结果
在执行之前 体内 如图所示的肺部定植实验 图1A 为了检测悬浮肿瘤细胞上的多聚纤维连接蛋白（polyFN）是否在促进转移过程中介导肺部定植和/或外渗，我们首先对CFSE（一种可穿透细胞膜并共价结合细胞内含胺分子的荧光化合物）的不同浓度进行了滴定。26,27 在悬浮的肿瘤细胞中，荧光标记物可有效进入细胞并长时间保留在其中。我们发现，肿瘤细胞对CFSE的标记效果呈剂量依赖性，如图所示。 图1B. 6 x10⁶ 细胞的 CFSE 标记5 每毫升LLC细胞数几乎达到平台期 20 µM 如图所示 图1C.
由于肺部血管中存在大量狭.......
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讨论
结合长期肺部定植实验，我们在此采用的短期方法用于评估 体内 循环肿瘤细胞在远端器官中的肺部定植清晰揭示并区分了循环肿瘤细胞表面组装的多聚纤连蛋白在肺部定植中的特异性作用，进而导致肿瘤细胞渗出血管并启动转移过程18,19,20,21尽管使用长期细胞示踪剂CFSE标记细胞可使我们追踪静脉注射后的循环肿瘤细胞（CTCs）长达三天，并在肺灌注前保留足够的绿色荧光以进行定量分析，但无法直接确定肿瘤细胞是位于血管腔内还是已经从血管中渗出。为解决这一问题，可在肺灌注过程中使用红色荧光罗丹明偶联葡聚糖，该分子可非特异性结合内皮细胞表面表达的凝集素，从而标记肺血管系统28,29,30尽管CFSE是一.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢张明民博士和郑雅馨女士提供的技术支持。本研究由台湾科技部（MOST-103-2325-B-006-009、MOST-104-2325-B-006-001、MOST-105-2325-B-006-001 和 MOST-106-2320-B-006-068-MY3）以及卫生福利部（MOHW106-TDU-B-211-144004）资助。同时，我们感谢国立成功大学医学院核心研究实验室提供多光子共聚焦显微镜的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料 | |||
| 牛血清白蛋白 （BSA） | Cyrusbioscience（中国台湾台北） | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC（医疗化学品公司）/毒物 | 456-A-1GL | |
| CFSE 增殖染料 | ebiosciences | 65-0850-85 | 全名：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | （Gibco）赛默飞世尔科技 | 12100-061 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Cyrusbioscience（中国台湾台北） | 101-6381-92-6 | 用于配制胰蛋白酶-EDTA 溶液（终浓度：0.53 mM） |
| 胎牛血清（FBS） | （Gibco）赛默飞世尔科技 | 10437-028 | |
| 路易斯肺癌（LLC） | ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯 | CRL-1642 | |
| L-谷氨酰胺，USP | （Gibco）赛默飞世尔科技 | 21051-024 | |
| 氯化钾（KCl） | Cyrusbioscience（中国台湾台北） | 101-7447-40-7 | 对于已配制的1×PBS（终浓度：2.7 mM） |
| 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4) | Cyrusbioscience（中国台湾台北） | 101-7778-77-0 | 对于已配制的1× PBS（终浓度：1.8 mM） |
| 氯化钠（NaCl） | Cyrusbioscience（中国台湾台北） | 101-7647-14-5 | 对于已配制的1× PBS（终浓度：137 mM） |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4) | Cyrusbioscience（中国台湾台北） | 101-10039-32-4 | 对于配制好的1×PBS（终浓度：10 mM） |
| 台盼蓝 | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g 与 100 mL 1×PBS 混合 |
| 胰蛋白酶 | Sigma Aldrich | T4799 | 用于配制胰蛋白酶-EDTA 溶液（终浓度：5 g/L） |
| Zoletil 50 | Virbac | 用 1X PBS 稀释 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>仪器设备 | |||
| 紧凑型台式离心机 2420 | 久保田公司 | 2420 | |
| 培养皿（6 cm） | 无锡巢生生物科技有限公司 | 705001 | |
| 一次性注射器（带针头） | 完美医疗产业有限公司 | 24G/3 cm；3 ml & 26G/0.5 cm；1 ml | |
| 末端翻转混合器 | C.T.I 杨陈 | TS-20 | 用于悬浮细胞的回收 |
| FACSCalibur（FACS） | BD生物科学 | ||
| 镊子 | Dimeda | 10.102.14 | |
| 直接加热型 CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技公司 | HEPA 100级 | |
| 小鼠固定器（圆柱形固定器 15-30 克） | 斯托尔廷 | 51338 | |
| 多光子共聚焦显微镜 BX61WI | 奥林巴斯 | FV1000MPE | |
| 血细胞计数板 | 马里恩费尔德-高级 | 640010 | |
| 手术剪 | Dimeda | 08.370.11 | |
| 外科缝线 | UNIK 外科缝合线制造公司 | 编号 0034 | 黑色编织丝线；不可吸收（25码；美国药典 4/0） |
| 1.5 mL 微量离心管 | 无锡巢生生物科技有限公司 | 615001 | |
| 15 mL Greiner 管 | Greiner bio-one | 188271 |
参考文献
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K.
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重印与许可
