Summary
Vi præsenterer en metode, der kombinerer hele-celle patch-klemme optagelser og to-foton imaging for at registrere Ca2 + transienter i neuronal dendritter i akut hjernen skiver.
Abstract
Calcium (Ca2 +) imaging er et kraftfuldt værktøj til at undersøge spatiotemporelle dynamikken i intracellulære Ca2 + signaler i neuronal dendritter. Ca2 + udsving kan opstå gennem en række membran og intracellulære mekanismer og spiller en afgørende rolle i induktion af synaptisk plasticitet og regulering af dendritiske ophidselse. Derfor, evnen til at registrere forskellige typer af Ca2 + signaler i dendritiske grene er værdifulde for grupper at studere, hvordan dendritter integrere oplysninger. Fremkomsten af to-foton mikroskopi har foretaget sådanne undersøgelser betydeligt lettere ved at løse problemerne forbundet med billedbehandling i levende væv, såsom lysspredning og solskader. Derudover gennem kombinationen af konventionelle elektrofysiologiske teknikker med to-foton Ca2 + imaging, er det muligt at undersøge lokale Ca2 + udsving i neuronal dendritter parallelt med optagelser af synaptic aktivitet i Soma. Vi beskriver her, hvordan du bruger denne metode til at studere dynamikken i lokale Ca2 + transienter (katte) i dendritter af GABAergic hæmmende interneurons. Metoden kan også anvendes til at studere dendritiske Ca2 + signalering i forskellige neuronal typer i akut hjernen skiver.
Introduction
Bidrag af en neuron netværk aktivitet er i vid udstrækning bestemt af den dynamiske natur af synaptic indgange det modtager. Traditionelt har påberåbt den fremherskende metode til kendetegner synaptic aktivitet i neuroner somatiske hele-celle patch-clamp optagelser af postsynaptiske strømninger fremkaldt af elektrisk stimulation af axoner af passage. Dog er kun aktiviteten af proksimalt beliggende synapser sandfærdigt rapporteret i denne sag1. Derudover for at vurdere synapse-specifikke mekanismer, har optagelser fra par af neuroner og fra dendritter på en bestemt placering været anvendt til at målrette synapser af interesse og mekanismer for dendritiske integration, henholdsvis. Et stort gennembrud inden for synaptic fysiologi blev opnået gennem et ægteskab af optiske og elektrofysiologiske teknikker. To-foton excitation laser scanning mikroskopi (2PLSM) i kombination med Ca2 + imaging og optogenetic værktøjer kan afsløre enorme detaljer af den dynamisk organisation af synaptic aktivitet på bestemte neuronal forbindelser i hjerne skiver i vitro og i vivo.
Flere vigtige fordele lavet 2PLSM skiller sig ud fra de konventionelle, one-foton excitation mikroskopi2: (1) som følge af en ikke-lineære karakter af to-foton excitation, fluorescens genereres kun i den fokale volumen, og alle udsendte fotoner repræsenterer nyttige signaler (ikke behov for pinhole); (2) længere bølgelængder, bruges i 2PLSM, trænge spredning væv mere effektivt; Derudover er spredte fotoner også fortyndes til at producere to-foton excitation og baggrunden fluorescens; (3) solskader og fototoksicitet er også begrænset til brændplanet. Derfor, trods den høje pris på 2-foton systemer i forhold til konventionelle Konfokal mikroskoper, 2PLSM stadig en metode til høj opløsning undersøgelse af neuronal struktur og funktion i tyk levende væv.
Den første anvendelse af 2PLSM i spredning væv var. struktur og funktion af dendritiske pigge3billedet 2PLSM i kombination med Ca2 + imaging har afsløret at pigge fungerer som isolerede biokemiske rum. Da der er en en til en-korrespondance mellem pigge og individuelle synapser4i mange neuronal typer blev to-foton Ca2 + imaging snart en nyttig værktøj rapportering aktivitet af individuelle synapser i intakt væv5, 6,7,8. Desuden blev 2PLSM-baserede Ca2 + imaging med succes brugt til at overvåge aktiviteten på enkelt calcium kanaler og ikke-lineære samspillet mellem de iboende og synaptic conductances, samt at vurdere stat - og aktivitet-afhængige regulering af Ca2 + signalering i neuronal dendritter5,6,7,8,9,10,11.
Calcium er en allestedsnærværende intracellulære anden budbringer, og dens subcellulært spatiotemporelle organisation bestemmer retningen af fysiologiske reaktioner fra ændringer i synaptisk styrke på reguleringen af ion-kanaler, dendrit og rygsøjlen vækst, som samt celledød og overlevelse. Dendritiske Ca2 + stigninger opstår via aktivering af flere veje. Handling potentialer (APs), backpropagating til dendritter, åbne spænding-gated calcium kanaler12 og producerer relativt globale Ca2 + transienter (katte) i dendritter og pigge13. Synaptisk transmission er forbundet med aktivering af postsynaptiske Ca2 +-gennemtrængelige receptorer (NMDA, Ca2 +-gennemtrængelige AMPA og kainate), udløse synaptic katte6,14,15. Endelig kan supralinear Ca2 + begivenheder genereres i dendritter under visse betingelser11,12,13,16.
To-foton Ca2 + imaging i kombination med patch-clamp elektrofysiologiske optagelser beskæftiger syntetiske Ca2 +-følsomme fluorescerende indikatorer, der typisk leveres gennem patch elektrode under hele-celle optagelser . En standard metode til kvantificering af Ca2 + dynamics er baseret på dual indikator metode17,18. Det bruger to fluorophores med godt adskilt emission spektre (f.eks, en kombination af en rød Ca2 +-ufølsom farvestof med grønne Ca2 + indikatorer, såsom Oregon Green BAPTA-1 eller Fluo-4) og har flere fordele sammenlignet med den enkelt indikator metode. Første, en Ca2 +-ufølsom farvestof bruges til at finde små strukturer af interesse (dendritiske grene og pigge) hvor Ca2 + billedbehandling vil blive udført. For det andet beregnes forholdet mellem ændringen i grønne og røde fluorescens (ΔG/R) som en foranstaltning af [Ca2 +], som er i vid udstrækning ufølsom over for ændringer i baseline fluorescens på grund af udsving i [Ca2 +]017 , 18. Endvidere fluorescens ændringer kan kalibreres med hensyn til absolutte Ca2 + koncentrationer19.
En generel bekymring, når du kører to-foton Ca2 + imaging eksperimenter i akut skiver er celle sundhed og stabilitet af image erhvervelse på grund af den høje laser power typisk bruges. Derudover i Ca2 + imaging eksperimenter er der bekymring om undertrykkelse af netbårne og betydelig overvurdering af subcellulært Ca2 + dynamics at Ca2 + indikatorer fungere som meget mobile eksogene Ca2 + buffere. Således valget af Ca2 + indikator og dets koncentration afhænger af typen neuronal, den forventede amplitude af katte, og den eksperimentelle spørgsmål.
Vi tilpasset to-foton Ca2 + billedbehandling metode til undersøgelse af Ca2 + udsving i dendritter GABAergic interneurons9,10,11,20,21 , 22. mens hovedparten af tidlige Ca2 + billeddiagnostiske undersøgelser blev udført i vigtigste neuroner, hæmmende interneurons fremvise en lang række funktionelle Ca2 + mekanismer, der adskiller sig fra dem i pyramideformet celler20 , 23 , 24. disse interneuron-specifikke mekanismer (fx, Ca2 + gennemtrængelig AMPA-receptorer) kan spille bestemte roller i regulerer celleaktivitet. Mens dendritiske Ca2 + signalering i interneurons er et fristende mål for yderligere undersøgelse, giver to-foton Ca2 + imaging i dendritter af disse celler yderligere udfordringer, fra en tyndere diameter af dendritter og mangel på pigge til en særlig høj endogene Ca2 + bindende kapacitet. Som vores forskningsinteresser fokuserer på studiet af hippocampus interneurons, blev følgende protokol, mens gælder for forskellige neuronal populationer, tilpasset til at håndtere disse udfordringer.
Denne protokol blev udført med en kommerciel Konfokal to-foton mikroskop, som var udstyret med to eksterne, ikke-descanned detektorer (NDDs), elektro-optiske modulator (EOM) og et Dodt scanning gradient kontrast (SGC), og installeret på en optisk tabel. Mikroskopet blev kombineret med en Ti:Sapphire multiphoton laser mode-låst på 800 nm (> 3 W, 140 fs pulser, 80 Hz gentagelseshyppighed). Den imaging system var udstyret med en standard Elektrofysiologi rig, herunder en perfusion kammer med temperaturkontrol, en oversætte platform med to micromanipulators, en computer-styrede mikroelektrode forstærker, en digitizer, en stimulation enheden, og data erhvervelse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne dyrevelfærd dyr beskyttelse Udvalget af Université Laval og den canadiske Rådet på Animal Care.
1. indledende forberedelse (valgfri: forberede 1 dag i forvejen)
- Forberede tre typer af kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) løsning (Normal, saccharose og Recovery-løsninger, 1 L hver, se tabel 1). Justere osmolalitet af løsninger til 300 ± 10 mOsm25 og cool ACSF-saccharose ned til nær frysepunktet (0-4 ° C).
Bemærk: Brugen af en lav-natrium skæring løsning (ACSF-saccharose) hjælper med at bevare levedygtigheden af neuroner i de overfladiske lag af akut skiver26. - Forberede 0,75 mL af lappe-løsning indeholder en rød fluorophore (fx, Alexa-594) og en grøn syntetiske calcium indikator (fx, Oregon Green BAPTA-1, se tabel 1). Omfatter biocytin (Se tabel 1) i den lappe-løsning, hvis post hoc morfologiske identifikation af optagne celler er påkrævet.
- Justere osmolalitet løsning til 280 ± 5 mOsm og pH til 7.35 ± 0,5. Holde løsningen i køleskabet eller på is på alle tidspunkter.
Bemærk: Valg af calcium-indikatoren bør være baseret på dets dynamikområde og arten af de undersøgte Ca2 + begivenheder. - Med en mikropipette puller, forberede patch pipetter fra borsilikatglas kapillærer (Se Tabel af materialer) med et ≈ 2 µm tip (pipette modstand af 3-5 MΩ) og stimulation pipetter fra borosilicate theta-glas kapillærer (Se tabel af Materialer) med en 2-5 µm spids.
Bemærk: Indstillingerne aftrækker at gøre pipetter af en given diameter og form vil blive bestemt af typen puller glødetråd og rampe testresultaterne for en given type af glas.
2. hippocampus skive forberedelse
- Bedøver musen (P13-20; stamme og sex med musen bestemmes af den eksperimentelle spørgsmål) med 1 mL af isofluran placeret på et stykke køkkenrulle inden for en indånding narkose kammer. Når dyret er dybt bedøvede, som det fremgår af en mangel på bevægelse og langsom respiration, fjerne det fra narkose kammer og Hug hovedet ved hjælp af en guillotine.
- Udsætte kraniet ved at skære huden med en lille saks fra bagsiden af kraniet til næsen. Bruge et par små mini knogle rongeurs til at lave et hul på bregma niveauet. Derefter bruge saksen til at gøre en caudale til rostralt snit langs den sagittal sutur. Tag fat på bagsiden af hver kraniet klap og løft opad og udad at fjerne kraniet dækker hver halvkugle med rongeurs.
- Efter at hjernen er fuldt eksponeret, underbyde synsnerverne med en lille spatel. Fjerne hjernen fra kraniet og sætte det ind i en petriskål, som indeholder løbende iltet, kold ACSF-saccharose (Se tabel 1 for saccharose).
- Hvis væv fra ældre mus er påkrævet, udføre en intracardiac perfusion ved hjælp af en sprøjte (25G) fyldt med 20 mL iskold ACSF-saccharose før hjernen udvinding for at opnå god kvalitet skiver.
- Forberede hippocampus udsnit fra den udpakkede dyrs hjerne.
- Lad hjernen chill i ca 2 min. Læg et stykke filtrerpapir på en is-pakket petriskål, overføre hjernen på filtrerpapir. Dissekere de to hjernehalvdele.
- Lim de dissekerede hjernehalvdele (orientering er bestemt af den eksperimentelle mål at opnå koronale, tværgående eller horisontale skiver) ned på et vibratome bord og fordybe den i vibratome magasinet fyldt med iskolde iltet ACSF-saccharose. Gøre 300 µm tykke skiver ved en temperatur på omkring 1 ° C ved hjælp af en vibratome køligere eller placere isen omkring bakken vibratome.
- Ved hjælp af en flad pensel, ophobes de udsnit, der indeholder hippocampus (op til 6 skiver pr. halvkugle) i et bad, der indeholder iltet ACSF-Recovery opvarmet til 37 ° C.
- Lad skiverne i ACSF-Recovery badekar i mindst 45 min.
3. hele-celle Patch-klemme optagelser
- Angive en hippocampus skive på plads i et badekar placeret under målet (forstørrelse: 40 x, numerisk blænde: 0,8) af en laser-scanning to-foton mikroskop. Løbende perfuse badet med iltet ACSF-Normal opvarmet ved 30-32 ° C med en hastighed på 2,5-3 mL/min.
- Brug infrarød differential interferens kontrast (IR-DIC) eller Dodt-SGC mikroskopi til at finde en celle af interesse ved hjælp af dens størrelse, form og placering.
Bemærk: Afhængig af befolkningens målrettede neuron transgene musemodel kan bruges til at nemt finde celler af interesse. I dette tilfælde, kan dette trin erstattes med brug af en fluorescerende lyskilde. - Fyld en stimulation pipette med en ACSF-Normal løsning indeholdende den røde fluorophore (fx, Alexa-594).
- Angive stimulation pipette (tilsluttet en elektrisk stimulation enhed) oven på skive, så spidsen er i samme region som celle af interesse.
- Efter påfyldning patch pipette med lappe løsning og knyttet det til et hoved fase, indstille det over skive så dens spids er direkte over celle af interesse.
- Passer en sprøjte ind i en tre-vejs stophane og Tilslut den til patch-pipette gennem den plastikrør. Injicere konstant overtryk i patch pipette (≈ 0,1 mL) ved hjælp af sprøjten. Hold hanen i "lukke" holdning.
- Aktivere forstærker kontrol software modul og skifte til spænding-clamp tilstand ved at klikke på knappen "VC". Åbn Elektrofysiologi data erhvervelse software (fx, clampex) for erhvervelse af elektrofysiologiske signaler og klik på ikonet "Membran Test" at have det hele tiden sender en firkantet spænding pulse (5 mV, 10 ms), som er nødvendige for at overvåge ændringer i pipette modstand.
- Lavere patch pipette, indtil det er lige på toppen af den målrettede celle. Ved at gøre kontakt med cellemembranen, fjerne presset ved at dreje hanen i "åben" position.
Bemærk: Kontakt med cellemembranen er opdaget, når en lille stigning i pipette modstand (≈ 0,2 MΩ) ses og en lille fordybning på cellen er forårsaget af overtryk. - Anvende en lille undertryk til patch pipette ved hjælp af en tomme sprøjte monteret i hanen, indtil pipette modstand, som softwaren når 1 GΩ. I vinduet 'Membran Test' data erhvervelse software klemme celle på -60 mV.
- Fortsætte med at anvende undertryk indtil cellen er åbnet og hele-celle konfiguration er opnået. Opdagelse af denne celle stat bygger på den pludselige ændring i pipette modstand (fra 1 GΩ til 70-500 MΩ afhængigt af hvilken interneuron) og udseendet af stor kapacitiv transienter i vinduet 'Membran Test'.
4. to-foton Ca2 + Imaging
- Hvis du er interesseret i de excitatoriske postsynaptiske svar, tilføje GABAA receptor blokker gabazine (10 µM) og GABAB receptor blokker CGP55845 (2 µM) i ACSF bad.
- I forstærker kontrol software modul, patch konfiguration til aktuelle-klemme ved at klikke på knappen "CC" og registrerer den celle fyring mønster i svar på somatiske injektioner af depolariserende strøm (0,8-1,0 nA, 1 Sørensen). Vent i mindst 30 min. for celle skal udfyldes med de indikatorer, der er til stede i den lappe løsning.
Bemærk: Cellen fyring mønster og aktive egenskaber kan bruges til at identificere den celle subtype; f.eks.fast-spiking celler. Det er vigtigt, at indikatoren koncentration at stabilisere gennem diffusion før du begynder at optage katte (Se tabel 2 for fejlfinding). - AP-fremkaldte katte
- Ved hjælp af billede erhvervelse softwaren, starte hentning af billeder. Find en dendrit af interesse ved hjælp af den røde fluorescens signal. For at sikre en synligt svar, først skal du vælge en proksimal dendrit (≤ 50 µm) som effektiviteten af AP backpropagation kan væsentligt forringes med afstanden i GABAergic interneurons22.
- Brug det rektangulære værktøj i image erhvervelse software, zoome ind på den målrettede region og skifte til den "xt" (linescan) tilstand. Placer scanningen på tværs af den dendritiske gren af interesse. Med laser intensitet controllere i erhvervelse software, skal du angive to-foton laser med en minimal effekt hvor baseline grønne Fluorescens er bare lidt synlige, at undgå fototoksicitet.
- Opret en optagelse prøveversion af den ønskede varighed indeholdende en somatisk nuværende injektion af den ønskede amplitude i Elektrofysiologi data erhvervelse software «Protokollen» vindue og image erhvervelse software.
- Bruger image erhvervelse software, skal du klikke på knappen "Start record" og erhverve fluorescens uafbrudt i 1-2 s. Gentag billede erhvervelse 3 - 10 gange. Vent mindst 30 s mellem enkelt scanninger til at undgå solskader. Hvis erhverve linescans på flere punkter langs en dendrit, tage dem i tilfældig rækkefølge at undgå ordre virkninger.
- Synaptically fremkaldte katte
- Find en dendrit af interesse ved hjælp af den røde fluorescens signal.
- Indstille stimulation pipette på overfladen af skive ovenfor dendrit af interesse. Langsomt sænke stimulation pipette på plads, minimere bevægelse for at undgå at forstyrre hele-celle konfiguration. Placer pipetten på 10-15 µm fra dendrit.
- For at visualisere placeringen af synaptic microdomains i aspiny dendritter, i image erhvervelse software skifte til den "xt' (linescan) mode, og Placer linjen langs den dendritiske gren af interesse.
- I "Protokol" vinduet (af Elektrofysiologi data erhvervelse software) og image erhvervelse software, oprette en optagelse retssag, der udløser enheden efter den retssag start.
- Ved hjælp af erhvervelse softwaren, klik på knappen "Start record" at scanne langs dendrit uafbrudt i 1-2 s. Gentag erhvervelse 3 - 5 gange, venter 30 s mellem scanninger til at undgå solskader.
Bemærk: Længden af scanning kan justeres afhængigt af evoked begivenheden kinetik, men bør minimeres for at undgå solskader (Se tabel 2 for fejlfinding). - Gentag trin 4.5.5 under forskellige forhold (f.eks., forskellig intensitet/længde af stimulation, indførelsen af et farmakologisk blocker, osv.) afhængigt af de specifikke spørgsmål.
- Stop erhvervelse, når cellen viser tegn på forringet sundhed: depolarisering under -45 mV, stigning i baseline Ca2 + niveau, morfologiske forringelse af dendritter (f.eks., blebbing, fragmentering, se tabel 2 for fejlfinding).
- At opnå foreløbige oplysninger om den celle morfologi og registrerer placeringen af stimulation pipette, erhverve en Z -stak af cellen i den røde kanal. Ved hjælp af erhvervelse software i 'xyz' mode, indstille øvre og nedre stak grænser til billede hele cellen med alle processerne. Indstille trin-størrelse på 1 µm og indlede stakken erhvervelsen ved hjælp af knappen "Start post".
- Når Z-stakken erhvervelsen er fuldført, skal du bruge indstillingen "Maksimalt projektion" i softwaren til at indsætte alle fokale planer i stakken og kontrollere kvaliteten af erhvervelse. Derefter, langsomt trække patch pipette ud af udsnittet.
- For at løse skive for post hoc morfologiske identifikation, hurtigt fjerne udsnittet fra badet med en flad pensel, og Placer den mellem to papirfiltre, i en ACSF-fyldte petriskål. Erstatte ACSF med en 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) løsning og lad fadet i en 4 ° C værelse eller køleskab natten over.
5. Immunohistokemi til Post Hoc morfologiske identifikation af optagne celler
Bemærk: Efter 1 nat af fiksering i PFA, skive kan opbevares i fosfat buffer (PB) med natriumazid (0,5%) i op til 1 måned.
- Sætte en skive i Tris-buffered saltopløsning (TBS) med Triton X-100 (0,3%) og udføre 4 vasker (5-10 min).
- Sætte en skive i TBS-Triton 0,3% med 10% normalt ged serum (NGS) til 1 h.
- Sætte en skive i TBS-Triton 0,3% med 1% NGS og en Streptavidin-konjugeret fluorophore (fx, Alexa Fluor 546-konjugeret Streptavidin, 1:200) i natten inkubation.
- Vaske 4 gange (5-10 min) i TBS.
- Montere skiver på objektglas og billedet ved hjælp af en Konfokal mikroskop. Hvis du vil have en komplet celle genopbygning, erhverve en Z-stak (trin størrelse: 1 µm) ved hjælp af en 20 x mål. For imaging en Alexa-546-konjugeret etiket, brug en 543 nm laser og en 515-560 nm påvisning filter sæt.
6. analyse af katte
- Uddrag fluorescens værdierne fra regionerne af interesse (ROIs) i linescan billeder fra de røde og grønne kanaler og middelværdier af de flere gentagelser for hver betingelse til at reducere støj.
Bemærk: Når linescan erhvervelse udføres langs dendrit, det er muligt at udtrække data fra flere ROIs, som kan svare til dendritiske microdomains (2-5 µm), og dermed give mulighed for undersøgelse af Ca2 + signal opdelingen. - For hver ROI, express ændringer i Ca2 + amplitude som:
Bemærk: Her G er fluorescens værdien fra den grønne kanal; G0 er den oprindelige fluorescens værdi fra den grønne kanal i perioden før stimulation; R er værdien, fluorescens fra den røde kanal18. Som to-foton excitation er stærkt lokaliseret og genererer ikke en væsentlig baggrund, er subtraktion af baggrunden fluorescens ikke påkrævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af protokollen præsenteres her, opnåede vi katte fremkaldt af somatiske nuværende injektion og elektrisk stimulation i dendritter af oriens/alveus interneurons i området CA1 hippocampus. Efter lappe en neuron, identificeret baseret på dens form og stilling, vi overtog linescans på tværs af en proksimal dendrit på flere punkter på givet afstande fra soma (figur 1A). Vi observeret et fald i amplitude af katte induceret af backpropagating APs som afstanden fra soma steg (vejledende reducerede AP amplitude eller en afstand-afhængige tilbagegang i calcium kanal distribution, figur 1B). Efter Immunhistokemi (ved hjælp af Streptavidin-konjugeret Alexa Fluor 546), var vi i stand til at hente biocytin mærkning af cellen og identificere den registrerede neuron som en bistratified celle med en axon besætter stratum oriens og stratum radiatum (figur 1 C). I det andet forsøg, stimulation pipette blev bragt til en distal dendritiske site. Scanning langs dendrit, har vi så kunnet vurdere amplituden af de postsynaptiske Ca2 + signaler i en given dendritiske gren (figur 2A-C) som svar på elektrisk stimulation af axoner af passage. De postsynaptiske katte adskilte sig mellem tilstødende dendritiske microdomains (segment 1 til 6; Figur 2D), som kunne være forbundet med en spredning af Ca2 + signal fra zonen for indledningen og/eller forskellige postsynaptiske mekanismer involveret.
Figur 1: Repræsentativt eksempel på AP-fremkaldte Ca2 + transienter. (A) maksimalt projektion af en to-foton Z-stak (13 µm) af en lappet interneuron fyldt med Alexa-594 (20 µM). Hvide linjer angiver placeringen af og længden af linescans. (B) spor viser kattene fremkaldte steder vist i A. Top spor viser kort AP toget genereret gennem somatiske nuværende indsprøjtning under optagelsen retssag. Tidsskalaen er den samme på alle spor vist. (C) maksimalt projektion af en Konfokal Z-stak, viser biocytin mærkning af cellen. O/A: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Stratum Radiatum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Postsynaptiske Ca2 + transienter fremkaldt af en byge af elektrisk stimulation (3 stimuli på 100 Hz). (A) maksimalt projektion af en to-foton Z-stak (148 µm) viser en lappet interneuron fyldt med Alexa-594. Hvid pilespidser peger på placeringen af cytoskeletale terminaler inden for den pyramideformede lag, tyder på interneuron er en kurv celle. (B) enkelt brændplanet illustrerer den dendritiske gren hvor stimulation elektrode var placeret. Stiplet linje viser placeringen af linescan vist i (C1 og C2). (C) billeder illustrerer resultatet af en linescan i røde (1; Alexa-594; 20 µM) og grønne (2; Oregon grøn Bapta-5N; 300 µM) kanaler. Billederne blev arkiveret lodret i mindre segmenter til at analysere udbredelsen af svar over 30 µm. (D) spor viser Ca2 + transienter (katte) fremkaldte i segmenter vises i C2. Top spor viser spænding svar på elektrisk stimulation indspillet på den somatiske niveau under imaging retssagen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning | Komponent | Koncentration (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1,25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glukose | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| ACSF-Recovery | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1,25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glukose | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ACSF-saccharose | KCl | 2 |
| NaH2PO4 | 1,25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glukose | 10 | |
| Saccharose | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-baseret lappe løsning | K+- gluconat | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Phosphocreatin di (tris) salt | 10 | |
| ATP-Tris | 2 | |
| GTP-Tris | 0,2 | |
| Biocytin | 72 | |
| Alexa-594 | 0.02 | |
| Oregon Green-BAPTA-1 | 0,2 |
Tabel 1: løsning opskrifter. Forbindelser og koncentrationer for løsninger, der anvendes under protokollen.
| Problem | Løsning |
| Stand til at lappe sund neuron | Indskrive nemlig tegn på, at skiverne er usunde: skrumpet eller hævede celler, synlige kerner, osv. Hvis ja, smid skiver. Også kontrollere patch-pipette modstand og lappe-løsning osmolalitet; erstatte dem hvis værdierne ikke er i det relevante udvalg. |
| Fluorescens signal fra dendritter er lav | Vente længere på cellen for at fylde. Hvis en forhindring er at holde den lappe-løsning fra spreder ind i cellen, forsøge at anvende en lille mængde af undertryk i patch-pipette. |
| Elektrisk stimulation ikke fremkalde en Ca2 + svar | Check for tilstedeværelse af en artefakt i den elektrofysiologiske optagelse. Hvis fraværende, check for en kortsigtede-circuit/stimulere enhed funktionsfejl. Hvis den nuværende, hæve stimulation intensitet eller flytte stimulation pipette tættere til dendrit. Det er værd at bemærke, at afstanden mellem stimulation elektrode og en dendrit ikke må overstige 8 um for at forhindre direkte depolarisering af dendritter, når man studerer synaptic svar. |
| Evoked Ca2 + signal er alt for høj/mætter Ca2 + indikator | Reducere laser power. Hvis problemet fortsætter i flere celler, bruge en anden Ca2 + indikator, med en lavere Ca2 + affinitet. |
| Baseline Ca2 + signal er gradvist stigende under eksperimentet | Vent for en længere periode mellem individuelle scanninger. Hvis den oprindelige plan er stadig stigende, stop erhvervelse Det angiver, at cellens sundhed sandsynligvis er faldende. |
| Ca2 +-signalets amplitude falder under scanninger | Reducere laser power eller zoome ud (hvis relevant). |
| Dendrit fragmentering ("blebbing") efter scanning | Reducere laser power eller zoome ud. Hvis blebbing er begrænset til den målrettede dendrit, vælge en anden dendrit og reducere laser power / zoom. Hvis flere dendritter blebbing, stoppe erhvervelse. |
| Fluorescens signaler er "drifting" ud af scan line efter fejer | Reducere bevægelse i Skive ved at reducere hastigheden af ACSF perfusion. Før patching, skal sikker på, at udsnittet kraftigt fast på plads af et net. |
Tabel 2: fejlfinding tabel. Løsninger på fælles problemer, der måtte opstå under en Ca2 + imaging eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden vist her demonstrerer, hvordan kombinationen af to-foton Ca2 + imaging og patch-clamp Elektrofysiologi kan bruges til at studere dendritiske Ca2 + signalering i neuronal dendritter i akut hjernen skiver. Denne metode giver mulighed for overvågning af både de lokale Ca2 + stigninger fremkaldt af elektrisk stimulation eller backpropagating AP i dendritiske segmenter, og cellens somatiske svar. Dette gør det et fremragende værktøj til at undersøge hvordan forskellige dele af træet dendritiske integrere indgange og kommunikerer med soma. Men i betragtning af længden af eksperimentet, særlig vægt skal lægges celle sundhed ved at begrænse brugen af laser power til imaging for at undgå solskader af dendritter. Dette kan opnås også ved faldende zoomniveauet, faldende varigheden af scanning og øge scanning hastighed under image erhvervelse. Imaging interneuron dendritter introducerer yderligere udfordringer. Som dendrites af disse celler har ikke pigge, anbefales scanning langs dendrit at lette lokaliseringen af postsynaptiske Ca2 + microdomains. Derudover er gives en høj endogene Ca2 + bindende kapacitet, Ca2 + stigninger i interneuron dendritter mindre og langsommere end dem, der genereres i dendritter pyramideformet celler. Dette kræver, at erhverve flere linescan billeder til gennemsnit samt en tilstrækkelig lang varighed af enkelte linescans for at beskrive Ca2 + signal kinetik korrekt.
Lokale elektrisk stimulation ved hjælp af bipolar theta-glas elektrode repræsenterer et nyttigt redskab for karakterisering af dendritiske postsynaptiske Ca2 + microdomains. Men det kan stadig aktivere forskellige "en passant" axoner beliggende i en given region. Antallet af indgange aktiveret i dette tilfælde er ukendt og kun kan vurderes ved hjælp af yderligere beregningsmæssige redskaber. To-foton glutamat uncaging27, som giver mulighed for samtidige stimulation af flere individuelle synapser, repræsenterer et godt alternativ til at fremkalde lokale dendritiske Ca2 + svar. Denne metode er meget udbredt til undersøgelse af principal celler, der har klart defineret excitatoriske postsynaptiske strukturer (pigge), men er ikke velegnet til studier af interneurons, som samlet har en lav ryg tæthed. Uncaging glutamat langs interneuron dendrit som anvendes til principal celler ville uundgåeligt aktivere flere extrasynaptic mekanismer af Ca2 + signalering9,10, hvilket gør det vanskeligt at fortolke den observationer.
I det sidste årti tilbydes forskud i optiske teknologier forbedret tidsmæssige opløsning for to-foton Ca2 + billeddannelse. En af de mest lovende er random-access mikroskopi (rampe) gennem akustisk-optisk deflektorer (delegation)28,29. I modsætning til konventionelle raster scanning, scanner rampe valgte punkter af interesse på høj frekvens, som er aktiveret af de hurtige hastighed af inerti-fri delegation. Den er ideel til den samtidige undersøgelse af flere dendritiske grene, da det ikke er begrænset til punkter i et lineært mønster. Den højere tidsmæssige opløsning, der tilbydes af delegation kan dog unødvendig når imaging Ca2 + begivenheder varig hundredvis af millisekunder inden for den samme fokale plan. Derudover kan placeringen af scanning point inden for den samme struktur af interesse være svært at kontrollere på grund af mikro-driver i Skive præparater er forbundet med en høj perfusion sats, som er nødvendige for god skive kvalitet. Metoden høj tidsmæssige opløsning (500-700 Hz) linescan-baserede erhvervelse præsenteret i denne artikel er derfor stadig at foretrække, når imaging Ca2 + signaler i individuelle dendritiske grene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det canadiske institutter for sundhedsforskning, naturvidenskab og Engineering Research Rådet (NSERC opdagelse Grant) og Savoy Foundation. OC blev støttet af et Ph.D.-stipendium fra NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Yuste, R., Denk, W. Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration. Nature. 375, 682-684 (1995).
- Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Structure and Function of Dendritic Spines. Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).
- Sabatini, B. L., Svoboda, K. Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis. Nature. 408, 589-593 (2000).
- Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated. Nature. 399, 151-155 (1999).
- Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Plasticity of calcium channels in dendritic spines. Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).
- Carter, A. G., Sabatini, B. L. State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons. Neuron. 44, 483-493 (2004).
- Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons. J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).
- Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons. J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).
- Camiré, O., Topolnik, L. Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons. J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).
- Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials. Neuron. 24, 727-737 (1999).
- Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons. J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics. J Physiol. 551, 67-78 (2003).
- Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting. J Physiol. 558, 465-478 (2004).
- Oertner, T. G. Functional imaging of single synapses in brain slices. Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 219, pl5 (2004).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing. Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).
- Camiré, O., Topolnik, L. Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons. Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).
- Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus. eNeuro. 3, 1-26 (2016).
- Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons. J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).
- Topolnik, L. Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons. Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).
- Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors. Front Physiol. 3, 259 (2012).
- Bourque, C. W. Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation. Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).
- Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors. Neuron. 19, 465-471 (1997).
- Salomé, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).
- Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector. Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).
