Summary
हम एक पूरे सेल पैच-दबाना रिकॉर्डिंग और दो फोटॉन इमेजिंग तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉन dendrites में Ca2 + यात्रियों को रिकॉर्ड करने के लिए संयोजन की विधि पेश करते हैं ।
Abstract
कैल्शियम (ca2 +) इमेजिंग intracellular Ca के spatiotemporal गतिशीलता की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है2 + संकेत में ंयूरॉन dendrites । Ca2 + उतार चढ़ाव झिल्ली और intracellular तंत्र की एक किस्म के माध्यम से हो सकता है और synaptic प्लास्टिक की प्रेरण और वृक्ष उत्तेजितता के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इसलिए, Ca के विभिंन प्रकार के रिकॉर्ड करने की क्षमता2 + वृक्ष शाखाओं में संकेतों का अध्ययन कैसे dendrites जानकारी एकीकृत समूहों के लिए मूल्यवान है । दो के आगमन-फोटॉन माइक्रोस्कोपी ऐसे प्रकाश बिखरने और धूप के रूप में रहते ऊतक में इमेजिंग करने के लिए निहित समस्याओं को हल करके इस तरह के अध्ययनों से काफी आसान बना दिया है । इसके अलावा, दो फोटॉन ca के साथ पारंपरिक electrophysiological तकनीक के संयोजन के माध्यम से2 + इमेजिंग, यह स्थानीय Ca की जांच संभव है2 + में synaptic गतिविधि की रिकॉर्डिंग के साथ समानांतर में ंयूरॉंस dendrites में उतार चढ़ाव सोमा. यहां, हम का वर्णन कैसे इस विधि का उपयोग करने के लिए स्थानीय Ca की गतिशीलता का अध्ययन2 + यात्रियों (बिल्लियों) GABAergic निरोधात्मक न्यूरॉन्स के dendrites में. विधि भी वृक्ष Ca का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है2 + तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में विभिन्न न्यूरॉन प्रकार में संकेत.
Introduction
नेटवर्क गतिविधि के लिए एक ंयूरॉन का योगदान काफी हद तक यह प्राप्त synaptic आदानों की गतिशील प्रकृति द्वारा निर्धारित है । परंपरागत रूप से, निस्र्पक synaptic गतिविधि के न्यूरॉन्स में प्रमुख विधि दैहिक पूरे सेल पैच पर भरोसा किया postsynaptic धाराओं की रिकॉर्डिंग दबाना बीतने के axons की विद्युत उत्तेजना द्वारा पैदा की । हालांकि, केवल समीपस्थ स्थित synapses की गतिविधि सच्चाई से इस मामले में रिपोर्ट है1। इसके अलावा, synapse-विशिष्ट तंत्र का आकलन करने के लिए, ंयूरॉंस के जोड़े से और एक विशिष्ट स्थान पर dendrites से रिकॉर्डिंग के लिए ब्याज की synapses और वृक्ष एकीकरण के तंत्र, क्रमशः लक्ष्य किया गया है । synaptic फिजियोलॉजी के क्षेत्र में एक बड़ी सफलता ऑप्टिकल और electrophysiological तकनीकों की एक शादी के माध्यम से हासिल किया गया था । दो-फोटॉन उत्तेजना लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (2PLSM) के साथ संयोजन में Ca2 + इमेजिंग और optogenetic उपकरण में मस्तिष्क स्लाइस में विशिष्ट न्यूरॉन कनेक्शन पर synaptic गतिविधि के गतिशील संगठन के जबरदस्त विवरण प्रकट कर सकते हैं इन विट्रो और vivo में।
कई प्रमुख लाभ बनाया 2PLSM पारंपरिक, एक-फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी से बाहर खड़े हो जाओ2: (1) दो फोटॉन उत्तेजना के एक गैर रेखीय प्रकृति के कारण, प्रतिदीप्ति केवल फोकल मात्रा में उत्पन्न होता है, और सभी उत्सर्जित फोटॉनों का प्रतिनिधित्व उपयोगी संकेतों (pinhole के लिए कोई ज़रूरत नहीं है); (2) अब तरंग दैर्ध्य, 2PLSM में इस्तेमाल किया, तितर बितर ऊतक घुसना अधिक कुशलता से; इसके अलावा, बिखरे फोटॉनों भी दो-फोटॉन उत्तेजना और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति उत्पादन करने के लिए पतला कर रहे हैं; (३) धूप और phototoxicity भी फोकल हवाई जहाज तक ही सीमित हैं. इसलिए, पारंपरिक फोकल सूक्ष्मदर्शी के साथ तुलना में 2-फोटॉन प्रणालियों की उच्च लागत के बावजूद, 2PLSM के उच्च संकल्प जांच के लिए विकल्प की एक विधि बनी हुई है ंयूरॉन संरचना और समारोह में मोटी रहने वाले ऊतक ।
ऊतक बिखरने में 2PLSM के पहले आवेदन संरचना और वृक्ष के समारोह छवि के लिए किया गया था3स्पिन । 2PLSM Ca2 + इमेजिंग के साथ संयोजन में पता चला है कि पृथक जैव रासायनिक डिब्बों के रूप में कार्य spins । के बाद से कई ंयूरॉंस प्रकार में एक एक के लिए spins और व्यक्तिगत synapses4, दो फोटॉन Ca2 + इमेजिंग जल्द ही एक उपयोगी बरकरार ऊतक5में व्यक्तिगत synapses की गतिविधि रिपोर्टिंग उपकरण बन गया के बीच एक पत्राचार है, 6,7,8. इसके अलावा, 2PLSM-आधारित Ca2 + इमेजिंग सफलतापूर्वक एकल कैल्शियम चैनलों की गतिविधि और आंतरिक और synaptic conductances के बीच गैर रेखीय बातचीत, साथ ही राज्य और गतिविधि पर निर्भर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था Ca के विनियमन2 + में संकेतन न्यूरॉन dendrites5,6,7,8,9,10,11.
कैल्शियम एक सर्वव्यापी intracellular दूसरा दूत है, और इसके सेलुलर spatiotemporal संगठन शारीरिक प्रतिक्रियाओं की दिशा निर्धारित करता है, synaptic शक्ति में परिवर्तन से आयन चैनलों के विनियमन के लिए, dendrite और रीढ़ की वृद्धि, के रूप में अच्छी तरह से सेल मौत और अस्तित्व के रूप में । वृक्ष Ca2 + उन्नयन कई रास्ते के सक्रियण के माध्यम से होते हैं । कार्रवाई की क्षमता (एपीएस), dendrites, खुले वोल्टेज-gated कैल्शियम चैनल12 backpropagating और dendrites में अपेक्षाकृत वैश्विक सीए2 + यात्रियों (बिल्लियों) का उत्पादन और13spins । Synaptic संचरण postsynaptic ca के सक्रियकरण के साथ जुड़ा हुआ है2 +-पारगंय रिसेप्टर्स (मोर्फिन, ca2 +-पारगंय AMPA और kainate), ट्रिगर Synaptic बिल्लियों6,14,15. अंत में, supralinear Ca2 + घटनाओं कुछ शर्तों के तहत dendrites में उत्पन्न किया जा सकता है11,12,13,16.
दो-फोटॉन ca2 + पैच के साथ संयोजन में इमेजिंग-क्लैंप electrophysiological रिकॉर्डिंग सिंथेटिक सीए2 +-संवेदनशील फ्लोरोसेंट संकेतक, जो आम तौर पर पूरे सेल रिकॉर्डिंग के दौरान पैच इलेक्ट्रोड के माध्यम से दिया जाता है कार्यरत . Ca2 + dynamics के ठहराव के लिए एक मानक विधि दोहरी संकेतक विधि17,18पर आधारित है । यह अच्छी तरह से अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ दो fluorophores का उपयोग करता है (उदा, एक लाल ca के संयोजन के साथ2 +-असंवेदनशील डाई ग्रीन ca के साथ2 + संकेतक, जैसे ओरेगन ग्रीन BAPTA-1 या Fluo-4) और जब की तुलना में कई फायदे हैं एकल संकेतक विधि । सबसे पहले, एक ca2 +असंवेदनशील डाई ब्याज की छोटी संरचनाओं का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है (वृक्ष शाखाओं और spins) जहां Ca2 + इमेजिंग किया जाएगा । दूसरा, हरे और लाल प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के बीच अनुपात (ΔG/आर) [ca2 +], जो बड़े पैमाने पर में उतार चढ़ाव के कारण आधारभूत प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के लिए काफी हद तक असंवेदनशील है के एक उपाय के रूप में गणना की है [ca2 +]017 , 18. इसके अलावा, प्रतिदीप्ति परिवर्तन निरपेक्ष Ca2 + सांद्रता19के मामले में तुले किया जा सकता है ।
एक सामांय चिंता का विषय है जब दो फोटॉन Ca चल रहा है2 + तीव्र स्लाइस में इमेजिंग प्रयोगों सेल स्वास्थ्य और छवि अधिग्रहण की स्थिरता के कारण उच्च लेजर आम तौर पर इस्तेमाल किया शक्ति है । इसके अतिरिक्त, सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों में, गड़बड़ी और उपसेलुलर सीए2 + गतिशीलता तथ्य यह है कि सीए2 + संकेतक अत्यधिक मोबाइल exogenous ca2 + के रूप में कार्य करने के लिए के कारण की पर्याप्त अनुमान के बारे में चिंता का विषय है थें. इस प्रकार, Ca के विकल्प2 + संकेतक और उसकी एकाग्रता पर निर्भर करता है ंयूरॉन प्रकार, बिल्लियों के प्रत्याशित आयाम है, और प्रयोगात्मक प्रश्न पर ।
हम दो फोटॉन ca के विधि अनुकूलित2 + ca की जांच के लिए इमेजिंग2 + GABAergic ंयूरॉंस की dendrites में उतार चढ़ाव9,10,11,20,21 , 22. जबकि जल्दी Ca के थोक2 + इमेजिंग अध्ययन के प्रधानाचार्य ंयूरॉंस में किया गया, निरोधात्मक ंयूरॉंस कार्यात्मक Ca2 + तंत्र की एक बड़ी विविधता है कि पिरामिड कोशिकाओं20 में उन से अलग है प्रदर्शन , 23 , 24. ये न्यूरॉन-विशिष्ट तंत्र (उदा., सीए2 + पारगंय AMPA रिसेप्टर्स) सेल गतिविधि को विनियमित करने में विशिष्ट भूमिका निभा सकते हैं । जबकि वृक्ष ca2 + ंयूरॉंस में संकेत आगे की जांच के लिए एक आकर्षक लक्ष्य है, दो फोटॉन Ca2 + इन कोशिकाओं के dendrites में इमेजिंग अतिरिक्त चुनौतियां प्रस्तुत करता है, dendrites के एक पतले व्यास और spins की कमी से एक विशेष रूप से उच्च अंतर्जात Ca2 + बाध्यकारी क्षमता । के रूप में हमारे अनुसंधान हितों हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित, निंनलिखित प्रोटोकॉल, जबकि विभिंन ंयूरॉंस आबादी के लिए लागू है, उन चुनौतियों से निपटने के लिए अनुकूलित था ।
इस प्रोटोकॉल एक वाणिज्यिक फोकल दो फोटॉन माइक्रोस्कोप, जो दो बाहरी, गैर स्कैन डिटेक्टरों (NDDs), इलेक्ट्रो ऑप्टिकल मॉडुलन (EOM), और एक Dodt स्कैनिंग ढाल कंट्रास्ट (SGC), और एक ऑप्टिकल मेज पर स्थापित के साथ सुसज्जित किया गया था के साथ मार डाला गया था । माइक्रोस्कोप एक तिवारी के साथ युग्मित किया गया था: नीलमणि multiphoton लेजर मोड-800 एनएम (> 3 डब्ल्यू, 140 एफएस दालों, 80 हर्ट्ज पुनरावृत्ति दर) पर बंद कर दिया । इमेजिंग प्रणाली एक मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग, तापमान नियंत्रण के साथ एक छिड़काव कक्ष, दो micromanipulators, एक कंप्यूटर नियंत्रित microelectrode एम्पलीफायर, एक डिजिटलर, एक उत्तेजना के साथ एक अनुवाद मंच सहित सुसज्जित किया गया था इकाई, और डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर ।
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Protocol
सभी प्रयोगों का प्रदर्शन एनिमल वेलफेयर विश्विद्यालय के पशु संरक्षण समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था लवल एंड कैनेडियन काउंसिल ऑन एनिमल केयर.
1. प्रारंभिक तैयारी (वैकल्पिक: अग्रिम में 1 दिन तैयार)
- तीन प्रकार के कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) समाधान तैयार करें (सामान्य, सुक्रोज और वसूली समाधान, 1 L प्रत्येक; तालिका 1देखें) । 300 ± 10 mOsm25 के लिए समाधान के परासरणीयता समायोजित करें और एक के पास ठंड बिंदु (0-4 ° c) के लिए नीचे ACSF-सुक्रोज शांत ।
नोट: एक कम सोडियम काटने समाधान (ACSF-सुक्रोज) के उपयोग में मदद करता है तीव्र स्लाइसें के सतही परतों में न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता की रक्षा26. - एक लाल fluorophore (उदा, Alexa-594) और एक हरे सिंथेटिक कैल्शियम संकेतक (उदा, ओरेगन ग्रीन BAPTA-1; तालिका 1देखें) युक्त पैच-समाधान के 0.75 मिलीलीटर तैयार करें । यदि रिकॉर्ड किए गए कक्षों की पोस्ट हॉक रूपात्मक पहचान की आवश्यकता है तो biocytin ( तालिका 1देखें) को पैच-समाधान में शामिल करें ।
- परासरणीयता के समाधान के लिए 280 ± 5 mOsm और पीएच को ७.३५ ± 0.5 समायोजित करें । फ्रिज में या बर्फ पर हर समय समाधान रखें ।
नोट: कैल्शियम सूचक की पसंद अपनी गतिशील सीमा पर और खोजी Ca2 + घटनाओं की प्रकृति पर predicated होना चाहिए । - एक micropipette खींचने का प्रयोग, borosilicate कांच केशिकाओं से पैच पिपेट तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) एक ≈ 2 µm टिप के साथ (3-5 पिपेट के MΩ प्रतिरोध) और उत्तेजना पिपेट से borosilicate थीटा-कांच केशिकाओं ( तालिका देखें सामग्री) एक 2-5 µm टिप के साथ ।
नोट: एक दिया व्यास और आकार के पिपेट बनाने के लिए खींचने सेटिंग्स खींचने रेशा प्रकार और कांच के एक प्रकार के लिए रैंप का परीक्षण परिणाम द्वारा निर्धारित किया जाएगा ।
२. हिप्पोकैम्पस स्लाईस वडा
- Anesthetize माउस (P13-20; तनाव और माउस के सेक्स प्रयोगात्मक प्रश्न द्वारा निर्धारित किया जाता है) एक सांस narcosis चैंबर के भीतर एक कागज तौलिया पर रखा isoflurane के 1 मिलीलीटर के साथ संबोधित किया जा रहा है । जब पशु गहरी anesthetized है, के रूप में आंदोलन की कमी और धीमी श्वसन के सबूत के रूप में, यह narcosis कक्ष से हटा दें और एक गिलोटिन का उपयोग कर decapitate ।
- खोपड़ी के पीछे से नाक के पास से कैंची की एक छोटी सी जोड़ी के साथ त्वचा को काटने के द्वारा, बेनकाब । bregma स्तर पर एक छेद बनाने के लिए मिनी बोन rongeurs की एक छोटी जोड़ी का प्रयोग करें । फिर sagittal टांका के साथ एक caudal-टू-rostral कट बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें । साथ rongeurs प्रत्येक खोपड़ी प्रालंब के पीछे समझ और ऊपर और जावक लिफ्ट प्रत्येक गोलार्द्ध को कवर खोपड़ी को हटाने के लिए ।
- के बाद मस्तिष्क पूरी तरह से उजागर होता है, एक छोटे रंग के साथ ऑप्टिक नसों तुर्रा । खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें और इसे लगातार oxygenated, शीत ACSF-सुक्रोज (सुक्रोज एकाग्रता के लिए तालिका 1 देखें) युक्त एक पेट्री डिश में डाल दें.
- पुराने चूहों से ऊतक की आवश्यकता है, तो अच्छी गुणवत्ता के स्लाइस प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क निष्कर्षण करने से पहले एक सिरिंज (25G) बर्फ ठंड ACSF-सुक्रोज के 20 मिलीलीटर से भरा का उपयोग कर एक intracardiac छिड़काव प्रदर्शन.
- निकाले हुए पशु मस्तिष्क से हिप्पोकैम्पस स्लाइस तैयार करें.
- लगभग 2 मिनट के लिए मस्तिष्क सर्द चलो । एक बर्फ पैक पेट्री डिश पर फिल्टर कागज का एक टुकड़ा प्लेस, फिल्टर कागज पर मस्तिष्क हस्तांतरण । दो गोलार्द्धों को काटना ।
- गोंद विच्छेदित गोलार्द्धों (अभिविंयास प्रयोगात्मक लक्ष्य द्वारा निर्धारित किया जाता है राज्याभिषेक, आड़ा, या क्षैतिज स्लाइसें प्राप्त करने के लिए) एक vibratome मेज पर और यह बर्फ ठंडा oxygenated ACSF-सुक्रोज से भरा vibratome ट्रे में विसर्जित कर दिया । एक vibratome कूलर का उपयोग करके या vibratome ट्रे के चारों ओर बर्फ रखने के द्वारा के बारे में 1 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 300-µm मोटी स्लाइस बनाओ ।
- एक फ्लैट पेंट ब्रश का उपयोग करना, हिप्पोकैम्पस से युक्त स्लाइस जमा (प्रति गोलार्द्ध 6 तक) एक स्नान युक्त में oxygenated ACSF-वसूली 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गरम ।
- ACSF-वसूली स्नान में स्लाइसें कम से कम 45 मिनट के लिए छोड़ दें ।
3. पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग
- एक लेजर-दो फोटॉन माइक्रोस्कोप स्कैनिंग के उद्देश्य (आवर्धन: 40x, संख्यात्मक एपर्चर: 0.8) के तहत तैनात स्नान में जगह में एक हिप्पोकैम्पस टुकड़ा सेट करें । oxygenated ACSF के साथ स्नान लगातार perfuse-३०-३२ डिग्री सेल्सियस पर सामान्य गरम, 2.5-3 मिलीलीटर की दर से/
- अवरक्त विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (IR-उद्योग) या Dodt-SGC माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए अपने आकार, आकार, और स्थिति का उपयोग कर ब्याज की एक सेल का पता लगाने ।
नोट: लक्षित ंयूरॉन जनसंख्या के आधार पर, एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल को आसानी से ब्याज की कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस मामले में, इस कदम एक फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत के उपयोग के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है । - एक ACSF-सामांय लाल fluorophore युक्त समाधान (उदा, Alexa-594) के साथ एक उत्तेजना पिपेट भरें ।
- उत्तेजना पिपेट सेट (एक विद्युत उत्तेजना इकाई से जुड़ा) टुकड़ा के शीर्ष पर इतना है कि टिप ब्याज की कोशिका के रूप में एक ही क्षेत्र में है ।
- पैच समाधान के साथ पैच पिपेट भरने और यह एक सिर मंच को संलग्न करने के बाद, यह टुकड़ा पर सेट इतना है कि इसकी नोक ब्याज की कोशिका के ऊपर सीधे है ।
- एक तीन तरह टोंटी में एक सिरिंज फ़िट और यह पैच करने के लिए कनेक्ट-प्लास्टिक ट्यूब के माध्यम से पिपेट. पैच पिपेट में लगातार सकारात्मक दबाव सुई (≈ 0.1 एमएल) सिरिंज का उपयोग कर । टोंटी को "बंद" स्थिति में रखें ।
- एम्पलीफायर नियंत्रण सॉफ्टवेयर मॉड्यूल को सक्रिय करने और "कुलपति" बटन पर क्लिक करके वोल्टेज दबाना मोड के लिए स्विच. electrophysiological संकेतों के अधिग्रहण के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (उदा., clampex) खोलें और "झिल्ली परीक्षण" आइकन पर क्लिक करें यह लगातार एक वर्ग वोल्टेज पल्स बाहर भेजने के लिए (5 एमवी, 10 ms), जो निगरानी के लिए आवश्यक है पिपेट प्रतिरोध में परिवर्तन ।
- पैच पिपेट जब तक यह लक्षित सेल के शीर्ष पर सही है कम है । सेल झिल्ली के साथ संपर्क बनाने पर, "खुला" स्थिति में टोंटी मोड़ से दबाव हटा दें ।
नोट: पिपेट प्रतिरोध (≈ 0.2 MΩ) में एक छोटी सी वृद्धि देखी है और सेल पर एक छोटे से इंडेंट सकारात्मक दबाव के कारण होता है जब कोशिका झिल्ली के साथ संपर्क का पता चला है । - एक खाली टोंटी में लगे सिरिंज का उपयोग कर पिपेट पैच करने के लिए एक मामूली नकारात्मक दबाव लागू करें जब तक पिपेट प्रतिरोध सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की गई 1 GΩ तक पहुँचता है. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की ' झिल्ली परीक्षण ' खिड़की में,-60 एमवी पर सेल दबाना ।
- कक्ष खोलने और पूरे-कक्ष कॉन्फ़िगरेशन प्राप्त होने तक ऋणात्मक दबाव लागू करना जारी रखें. इस सेल राज्य का पता लगाने के पिपेट प्रतिरोध में अचानक परिवर्तन पर आधारित है (1 GΩ से 70-500 MΩ के लिए न्यूरॉन प्रकार के आधार पर) और ' झिल्ली परीक्षण ' खिड़की में बड़े समाई यात्रियों की उपस्थिति.
4. दो-फोटॉन Ca2 + इमेजिंग
- यदि उत्तेजक postsynaptic प्रतिक्रियाओं में रुचि, गाबा में CGP55845 स्नान मेंएक रिसेप्टर ब्लॉकर gabazine (10 µ एम) और गाबाबी रिसेप्टर ब्लॉकर µ (2 ACSF एम) जोड़ें.
- एम्पलीफायर नियंत्रण सॉफ्टवेयर मॉड्यूल में, "प्रतिलिपि" बटन पर क्लिक करके वर्तमान दबाना करने के लिए पैच विन्यास सेट और वर्तमान ध्रुवीकरण के दैहिक इंजेक्शन के जवाब में सेल की फायरिंग पैटर्न रिकॉर्ड (0.8-1.0 nA, 1 s). पैच समाधान में मौजूद संकेतक से भरे जाने वाले कक्ष के लिए कम से 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें ।
नोट: सेल के फायरिंग प्रतिमान और सक्रिय गुणों का उपयोग कक्ष के उपप्रकार को पहचानने के लिए किया जा सकता है; उदा, फ़ास्ट-spiking सेल. यह सूचक एकाग्रता प्रसार के माध्यम से बिल्लियों रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करने से पहले स्थिर करने के लिए महत्वपूर्ण है ( तालिका 2 देखें समस्या निवारण के लिए) । - एपी पैदा बिल्लियों
- छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, चित्र प्राप्त करना शुरू करते हैं । लाल प्रतिदीप्ति संकेत का उपयोग करके रुचि के dendrite का पता लगाएँ. एक दृश्य प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए, पहले, एक समीपस्थ dendrite (≤ 50 µm) एपी backpropagation की क्षमता के रूप में चुनें काफी GABAergic न्यूरॉन्स में दूरी के साथ गिरावट आ सकती है22.
- छवि प्राप्ति सॉफ़्टवेयर में ' आयताकार उपकरण ' का उपयोग करके, लक्षित क्षेत्र पर ज़ूम इन करें और "xt" (linescan) मोड में जाएं । ब्याज की वृक्ष शाखा में स्कैन की स्थिति । अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में लेजर तीव्रता नियंत्रकों के साथ, एक न्यूनतम शक्ति के स्तर पर दो फोटॉन लेजर सेट जहां आधारभूत हरी प्रतिदीप्ति सिर्फ थोड़ा दिखाई है, phototoxicity से बचने के लिए ।
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर ' प्रोटोकॉल ' विंडो और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में वांछित आयाम के एक दैहिक वर्तमान इंजेक्शन युक्त इच्छित अवधि के एक रिकॉर्डिंग परीक्षण बनाने के लिए ।
- छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, "शुरू रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करें और प्रतिदीप्ति के लिए लगातार प्राप्त 1-2 s. दोहराने छवि अधिग्रहण 3-10 बार । धूप से बचने के लिए सिंगल स्कैन के बीच कम से 30 एस रुको । यदि एक dendrite साथ कई बिंदुओं पर linescans प्राप्त करने, उंहें यादृच्छिक क्रम में लेने के लिए आदेश प्रभाव से बचने के ।
- Synaptically-पैदा बिल्लियों
- लाल प्रतिदीप्ति संकेत का उपयोग करके रुचि के dendrite का पता लगाएँ.
- उत्तेजना के dendrite के ऊपर स्लाइस की सतह पर पिपेट सेट करें । धीरे जगह में उत्तेजना पिपेट कम, आंदोलन को कम करने के लिए पूरे सेल विंयास परेशान से बचने के लिए । dendrite से 10-15 µm पर पिपेट की स्थिति ।
- के लिए aspiny dendrites में synaptic microdomains के स्थान कल्पना, छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में स्विच करने के लिए 'xt ' (linescan) मोड और ब्याज की वृक्ष शाखा के साथ लाइन की स्थिति ।
- ' प्रोटोकॉल ' विंडो में (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की) और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, एक रिकॉर्डिंग परीक्षण है कि उत्तेजना इकाई शुरू करने के बाद परीक्षण शुरु बनाते हैं ।
- अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, पर क्लिक करें "शुरू रिकॉर्ड" बटन के लिए लगातार dendrite साथ स्कैन करने के लिए 1-2 s. दोहराने अधिग्रहण 3-5 बार, प्रतीक्षा 30 एस स्कैन के बीच धूप को रोकने के लिए.
नोट: स्कैन की लंबाई पैदा की गई घटना के कैनेटीक्स के आधार पर समायोजित किया जा सकता है, लेकिन धूप को रोकने के लिए छोटा किया जाना चाहिए (देखें तालिका 2 समस्या निवारण के लिए) । - दोहराएं विभिंन स्थितियों में कदम 4.5.5 (उदा, विभिंन तीव्रता/उत्तेजना की लंबाई, एक औषधीय अवरोधक की शुरूआत, आदि) विशिष्ट प्रश्न के आधार पर संबोधित किया जा रहा है ।
- अधिग्रहण बंद करो जब सेल बिगड़ती स्वास्थ्य के लक्षण दिखाता है: ध्रुवीकरण नीचे-45 एमवी, आधारभूत Ca में वृद्धि2 + स्तर, dendrites के रूपात्मक गिरावट (उदा, blebbing, विखंडन; तालिका 2 देखें समस्या निवारण के लिए) ।
- सेल आकृति विज्ञान पर प्रारंभिक जानकारी प्राप्त करने के लिए और उत्तेजना पिपेट के स्थान का एक रिकॉर्ड रखने के लिए, लाल चैनल में सेल के एक Z-स्टैक प्राप्त करें । 'xyz ' मोड में अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, सभी प्रक्रियाओं के साथ पूरे सेल शामिल छवि के लिए ऊपरी और निचले स्टैक सीमा निर्धारित करें । 1 µm पर ' चरण आकार ' सेट करें और "रिकॉर्ड प्रारंभ करें" बटन का उपयोग करके स्टैक प्राप्ति आरंभ करे ।
- जब Z-स्टैक प्राप्ति पूर्ण हो जाती है, तो स्टैक की सभी फोकल योजनाओं को मिलाना करने और प्राप्ति की गुणवत्ता सत्यापित करने के लिए सॉफ़्टवेयर में "अधिकतम प्रोजेक्शन" विकल्प का उपयोग करें । फिर, धीरे से टुकड़ा से बाहर पैच पिपेट वापस लेना ।
- पोस्ट हॉक रूपात्मक पहचान के लिए टुकड़ा ठीक करने के लिए, जल्दी से एक फ्लैट पेंट ब्रश का उपयोग कर स्नान से टुकड़ा हटाने के लिए, और यह दो फिल्टर कागज के बीच जगह, एक ACSF-पेट्री डिश भर में । ACSF को 4% paraformaldehyde (पीएफए) सॉल्यूशन से बदलें और डिश को 4 ° c कमरे या फ्रिज में रात भर छोड़ दें ।
5. दर्ज कक्षों की पोस्ट हॉक रूपात्मक पहचान के लिए Immunohistochemistry
नोट: पीएफए में निर्धारण की 1 रात के बाद, स्लाइस फॉस्फेट बफर (पंजाब) में सोडियम azide के साथ (0.5%) 1 महीने तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
- ट्राइटन X-100 (0.3%) और प्रदर्शन 4 बहाकर (5-10 मिनट प्रत्येक) के साथ Tris में टुकड़ा डाल-खारा समाधान (टीबीएस) ।
- 1 एच के लिए 10% सामांय बकरी सीरम (NGS) के साथ टीबीएस-ट्राइटन 0.3% में टुकड़ा रखो ।
- 1% NGS और एक Streptavidin-संयुग्मित fluorophore (जैसे, Alexa Fluor 546-संयुग्मित Streptavidin, 1:200) रात भर के लिए मशीन के साथ टीबीएस-ट्राइटन 0.3% में टुकड़ा रखो ।
- टीबीएस में 4 बार (5-10 min) धो लें ।
- एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर माइक्रोस्कोप स्लाइड और छवि पर स्लाइस माउंट । एक पूर्ण कक्ष पुनर्निर्माण करने के लिए, 20x उद्देश्य का उपयोग करके Z-स्टैक (चरण आकार: 1 µm) प्राप्त करें । इमेजिंग के लिए एक Alexa-546-संयुग्मित लेबल, एक 543 एनएम लेजर और एक 515-560 एनएम का पता लगाने फिल्टर सेट का उपयोग करें ।
6. बिल्लियों का विश्लेषण
- लाल और हरे चैनलों से linescan छवियों में ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों से प्रतिदीप्ति मूल्यों को निकालने और शोर को कम करने के लिए प्रत्येक शर्त के लिए कई दोहराने के मूल्यों औसत ।
नोट: जब linescan अधिग्रहण dendrite के साथ किया जाता है, यह एकाधिक ROIs, जो वृक्ष microdomains (2-5 µm) के अनुरूप हो सकता है से डेटा निकालने के लिए संभव है, और इस तरह के अध्ययन की अनुमति Ca2 + संकेत compartmentalization । - प्रत्येक रॉय के लिए, Ca2 + आयाम में परिवर्तन के रूप में व्यक्त:
नोट: यहां जी ग्रीन चैनल से प्रतिदीप्ति मूल्य है; G0 पूर्व-उत्तेजना अवधि के दौरान ग्रीन चैनल से आधारभूत प्रतिदीप्ति मान है; R लाल चैनल18से प्रतिदीप्ति मान है । के रूप में दो-फोटॉन उत्तेजना उच्च स्थानीयकृत है और एक महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि उत्पन्न नहीं करता है, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के घटाव की आवश्यकता नहीं है.
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Representative Results
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में oriens/alveus न्यूरॉन्स के dendrites में दैहिक वर्तमान इंजेक्शन द्वारा और विद्युत उत्तेजना द्वारा पैदा की बिल्लियों प्राप्त की । एक ंयूरॉन patching के बाद, अपने आकार और स्थिति के आधार पर पहचान की, हम एक समीपस्थ dendrite भर में सोमा (चित्र 1a) से दी गई दूरी पर कई बिंदुओं पर linescans का अधिग्रहण किया । हम सोमा से दूरी के रूप में backpropagating ए पी एस द्वारा प्रेरित बिल्लियों के आयाम में कमी देखी बढ़ी (कम एपी आयाम या कैल्शियम चैनल वितरण में एक दूरी पर निर्भर गिरावट का संकेत, आंकड़ा 1b) । immunohistochemistry के बाद (Streptavidin का उपयोग-संयुग्मित Alexa Fluor 546), हम सेल के biocytin लेबल प्राप्त करने में सक्षम थे और एक bistratified सेल के रूप में दर्ज ंयूरॉन की पहचान एक axon के साथ एक परत पर कब्जा oriens और परत radiatum (चित्रा 1C). दूसरा प्रयोग में, एक उत्तेजना पिपेट एक बाहर वृक्ष साइट के लिए लाया गया था । dendrite के साथ स्कैनिंग, हम तो postsynaptic Ca के आयाम का आकलन करने में सक्षम थे2 + संकेत दिया वृक्ष शाखा में (चित्रा 2a-सी) बीतने के axons की विद्युत उत्तेजना के जवाब में । postsynaptic बिल्लियों पड़ोसी वृक्ष microdomains (खंड 1 से 6 के बीच मतभेद; चित्रा 2d), जो2 सीए के प्रसार के साथ संबद्ध किया जा सकता है दीक्षा और/या अलग postsynaptic तंत्र शामिल के क्षेत्र से संकेत ।
चित्रा 1: एपी के प्रतिनिधि उदाहरण-सीए पैदा2 + यात्रियों । (a) एक दो-फोटॉन Z-स्टैक (13 µm) का अधिकतम प्रक्षेपण Alexa-594 (20 µ m) के साथ भरा हुआ एक समझौता ंयूरॉन । सफेद लाइनें स्थान और linescans की लंबाई निरूपित । (ख) में दिखाए गए स्थानों में भाग लेकर बिल्लियों दिखा निशान । शीर्ष ट्रेस लघु एपी रिकॉर्डिंग परीक्षण के दौरान दैहिक वर्तमान इंजेक्शन के माध्यम से उत्पंन ट्रेन से पता चलता है । टाइम स्केल दिखाया सभी निशान पर एक ही है । (ग) एक फोकल जेडस्टैक के अधिकतम प्रक्षेपण सेल के biocytin लेबल दिखा । O/A: Oriens/Alveus; PYR: परत Pyramidale; रड: परत Radiatum. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: Postsynaptic सीए2 + विद्युत उत्तेजना के एक फट द्वारा पैदा यात्रियों (100 हर्ट्ज पर 3 उत्तेजनाओं). (a) एक दो-फोटॉन Z-स्टैक (148 µm) का अधिकतम प्रक्षेपण एक समझौता--594 के साथ भरा हुआ ंयूरॉन दिखा । सफेद ऐरोहेड बिंदु पिरामिडीय परत के भीतर axonal टर्मिनलों के स्थान के लिए, एक टोकरी सेल है ंयूरॉन सुझाव । (ख) एकल फोकल विमान वृक्ष शाखा जहां उत्तेजना इलेक्ट्रोड तैनात किया गया illustrating । डैश्ड रेखा (C1 और C2) में दिखाए गए linescan का स्थान दिखाता है । (ग) लाल (1 में किसी linescan के परिणाम को दर्शाने वाली छवियां; Alexa-594; 20 µ m) और हरा (2; ओरेगन ग्रीन Bapta-5N; 300 µ मी) चॅनेल. छवियों को छोटे खंडों में बिन्नी को 30 µm पर प्रतिक्रिया के प्रसार का विश्लेषण किया गया । (D) Ca2 + यात्रियों (बिल्लियों) को दिखा रहा है C2 में प्रदर्शित खंडों में पाई गई निशान । शीर्ष ट्रेस बिजली की उत्तेजना के लिए वोल्टेज की प्रतिक्रिया से पता चलता है इमेजिंग परीक्षण के दौरान दैहिक स्तर पर दर्ज की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| समाधान | घटक | एकाग्रता (मिमी) |
| ACSF-सामान्य | nacl | 124 |
| kcl | 2.5 | |
| णः2पो4 | सवा | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| ग्लूकोज | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| ACSF-रिकवरी | nacl | 124 |
| kcl | 2.5 | |
| णः2पो4 | सवा | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| ग्लूकोज | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ACSF-सुक्रोज | kcl | 2 |
| णः2पो4 | सवा | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| ग्लूकोज | 10 | |
| सुक्रोज | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-आधारित पैच समाधान | K+-gluconate | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Phosphocreatin di (tris) नमक | 10 | |
| एटीपी-Tris | 2 | |
| GTP-Tris | 0.2 | |
| Biocytin | 72 | |
| Alexa-594 | 0.02 | |
| ओरेगन ग्रीन-BAPTA-1 | 0.2 |
तालिका 1: समाधान रेसिपी. प्रोटोकॉल के दौरान उपयोग किए गए समाधानों के लिए यौगिक और सांद्रता ।
| समस्या | समाधान |
| स्वस्थ ंयूरॉन पैच करने में असमर्थ | संकेत है कि स्लाइस अस्वस्थ है के लिए जांच करें: सिकुड़ा या सूजन कोशिकाओं, दिखाई नाभिक, आदि यदि ऐसा है, तो स्लाइसें छोड़ें । इसके अलावा पैच-पिपेट प्रतिरोध और पैच-समाधान की परासरणीयता को सत्यापित करें; यदि मान उपयुक्त श्रेणी में नहीं हैं, तो उंहें प्रतिस्थापित करें । |
| dendrites से प्रतिदीप्ति संकेत कम है | कक्ष भरने के लिए अब प्रतीक्षा करें । यदि कोई बाधा पैच-समाधान को कक्ष में फैलाना से रोक रही है, तो पैच-पिपेट में नकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू करने का प्रयास करें । |
| विद्युत उत्तेजना एक Ca2 + प्रतिक्रिया पैदा नहीं कर रहा है | electrophysiological रिकॉर्डिंग में एक मूर्ति की उपस्थिति के लिए जांच करें । यदि अनुपस्थित, एक शॉर्ट सर्किट के लिए जांच/ यदि वर्तमान, उत्तेजना तीव्रता बढ़ाने या उत्तेजना पिपेट dendrite के करीब ले जाएं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उत्तेजना इलेक्ट्रोड और dendrite के बीच की दूरी 8 उम से अधिक नहीं होना चाहिए dendrites के प्रत्यक्ष ध्रुवीकरण को रोकने के लिए जब synaptic प्रतिक्रियाओं का अध्ययन. |
| पैदा Ca2 + संकेत भी उच्च है/Ca2 + संकेतक | लेजर शक्ति को कम । यदि समस्या एकाधिक कक्षों में बनी रहती है, तो भिंन Ca2 + संकेतक का उपयोग करें, के साथ एक कम Ca2 + संबध । |
| आधारभूत Ca2 + संकेत प्रयोग के दौरान धीरे-से बढ़ रहा है | व्यक्तिगत स्कैन के बीच एक लंबी अवधि के लिए प्रतीक्षा करें । आधार रेखा अभी भी बढ़ रही है, तो रोकें अधिग्रहण; इससे संकेत मिलता है कि सेल के स्वास्थ्य में गिरावट की संभावना है । |
| Ca2 + सिग्नल के आयाम स्कैन के दौरान घटाता है | लेजर शक्ति को कम करने या बाहर ज़ूम (यदि लागू हो) । |
| Dendrite स्कैनिंग के बाद ("blebbing") खंडित है | लेजर शक्ति को कम करने या बाहर ज़ूम । यदि blebbing लक्षित dendrite तक ही सीमित है, एक और dendrite चुनें और लेजर शक्ति को कम/ यदि मल्टीपल dendrites blebbing हैं, तो अधिग्रहण रोकें । |
| प्रतिदीप्ति संकेतों "बहती" कर रहे हैं बाहर झाडू के बाद स्कैन लाइन से | ACSF छिड़काव की गति को कम करके स्लाइस में मूवमेंट को कम करें । पैच करने से पहले, यकीन है कि टुकड़ा दृढ़ता से जगह में एक शुद्ध द्वारा तय की है । |
तालिका 2: समस्या निवारण तालिका. Ca2 + इमेजिंग प्रयोग के दौरान उत्पंन हो सकने वाली सामांय समस्याओं के समाधान ।
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Discussion
यहां दिखाया गया विधि कैसे दो फोटॉन ca के संयोजन2 + इमेजिंग और पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदर्शित करता है वृक्ष ca2 + तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉन dendrites में संकेतन. इस विधि दोनों स्थानीय Ca की निगरानी के लिए अनुमति देता है2 + वृक्ष क्षेत्रों में विद्युत उत्तेजना या backpropagating एपी द्वारा पैदा की ऊंचाई, और सेल दैहिक प्रतिक्रिया । यह यह एक उत्कृष्ट उपकरण का अध्ययन करने के लिए कैसे वृक्ष पेड़ के विभिंन भागों एकीकृत आदानों और सोमा के साथ संवाद बनाता है । लेकिन प्रयोग की लंबाई को देखते हुए, विशेष ध्यान के लिए इमेजिंग के लिए लेजर शक्ति का उपयोग सीमित द्वारा सेल स्वास्थ्य के लिए भुगतान किया जाना चाहिए ताकि dendrites के धूप से बचने के लिए । यह भी ज़ूम स्तर कम करके प्राप्त किया जा सकता है, स्कैन की अवधि को कम करने, और छवि अधिग्रहण के दौरान स्कैन की गति में वृद्धि. इमेजिंग न्यूरॉन dendrites अतिरिक्त चुनौतियों का परिचय. इन कोशिकाओं के dendrites के रूप में कोई spins है, dendrite साथ स्कैनिंग postsynaptic Ca के स्थानीयकरण की सुविधा के लिए सिफारिश की है2 + microdomains । इसके अलावा, एक उच्च अंतर्जात ca2 + बाध्यकारी क्षमता दी, ca2 + उंनयन में न्यूरॉन dendrites कम कर रहे है और पिरामिड कोशिकाओं के dendrites में उत्पंन उन से धीमी । यह औसत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत linescans की एक पर्याप्त लंबी अवधि के लिए Ca का वर्णन करने के लिए कई linescan छवियों को प्राप्त करने की आवश्यकता है2 + संकेत कैनेटीक्स उचित ।
स्थानीय विद्युत द्विध्रुवी थीटा-ग्लास इलेक्ट्रोड का उपयोग उत्तेजना वृक्ष postsynaptic Ca के लक्षण वर्णन के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है2 + microdomains । हालांकि, यह अभी भी अलग "en passed" axons किसी दिए गए क्षेत्र में स्थित सक्रिय हो सकता है । इस मामले में सक्रिय आदानों की संख्या अज्ञात है और केवल अतिरिक्त गणना उपकरणों का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है । दो-फोटॉन ग्लूटामेट uncaging27, जो एकाधिक व्यक्तिगत synapses की एक साथ उत्तेजना के लिए अनुमति देता है, स्थानीय वृक्ष Ca2 + प्रतिक्रियाओं को बेहतर करने के लिए एक अच्छा विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है । इस विधि का व्यापक रूप से प्रमुख कोशिकाओं है, जो स्पष्ट रूप से उत्तेजक postsynaptic संरचनाओं (spins) परिभाषित किया है के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन अच्छी तरह से नहीं है, जो कुल मिलाकर एक कम रीढ़ की हड्डी का घनत्व है ंयूरॉंस के अध्ययन के लिए अनुकूल । न्यूरॉन dendrite साथ Uncaging ग्लूटामेट के रूप में यह प्रमुख कोशिकाओं को लागू किया जाता है अपरिहार्य Ca के कई extrasynaptic तंत्र को सक्रिय करने के लिए2 + संकेतन9,10, यह मुश्किल व्याख्या करने के लिए बना टिप्पणियों.
पिछले दशक में, ऑप्टिकल प्रौद्योगिकियों में अग्रिम दो-फोटॉन Ca2 + इमेजिंग के लिए बेहतर लौकिक समाधान की पेशकश की । सबसे होनहार में से एक acousto ऑप्टिक deflectors (AODs) के माध्यम से यादृच्छिक-पहुंच माइक्रोस्कोपी (रैंप) है28,29। पारंपरिक रैस्टर स्कैनिंग के विपरीत, रैंप उच्च आवृत्ति पर ब्याज के चुनिंदा बिंदुओं को स्कैन करता है, जो जड़ता मुक्त AODs की तेज गति से सक्षम है । यह एकाधिक वृक्ष शाखाओं के एक साथ अध्ययन के लिए आदर्श है, के रूप में यह एक रैखिक पैटर्न में निर्धारित अंक तक ही सीमित नहीं है । हालांकि, उच्च लौकिक संकल्प AODs द्वारा की पेशकश की अनावश्यक हो सकता है जब इमेजिंग Ca2 + एक ही फोकल योजना के भीतर मिसे के सैकड़ों चलने की घटनाओं । इसके अलावा, ब्याज की एक ही संरचना के भीतर अंक स्कैनिंग के स्थान टुकड़ा एक उच्च छिड़काव दर है, जो अच्छा टुकड़ा गुणवत्ता के लिए आवश्यक है के साथ जुड़े की तैयारी में सूक्ष्म बहाव के कारण नियंत्रित करने के लिए मुश्किल हो सकता है । इसलिए, उच्च लौकिक संकल्प (500-700 हर्ट्ज) linescan-आधारित अधिग्रहण विधि इस आलेख में प्रस्तुत अभी भी बेहतर है जब इमेजिंग Ca2 + व्यक्तिगत वृक्ष शाखाओं में संकेत ।
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Disclosures
लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अंय संघर्ष किया है ।
Acknowledgments
यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान, प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC डिस्कवरी अनुदान) और Savoy फाउंडेशन के संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था । ओसी ने NSERC से पीएचई फेलोशिप का समर्थन किया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
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