Summary
Vi presenterer en metoden forbinder hele celle patch-klemme opptak og to-fotonet imaging å registrere Ca2 + transienter i neuronal dendrites i akutt hjernen skiver.
Abstract
Kalsium (Ca2 +) bildebehandling er et kraftig verktøy for å undersøke spatiotemporal dynamikken i intracellulær Ca2 + signaler i neuronal dendrites. Ca2 + svingninger kan oppstå gjennom en rekke membran og intracellulær mekanismer og spille en avgjørende rolle i induksjon av synaptiske plastisitet og regulering av dendrittiske excitability. Derfor er evnen å fortegnelse typer Ca2 + signaler i dendrittiske grener verdifulle for grupper studere hvordan dendrites integrere informasjon. Bruk av to-fotonet mikroskopi har gjort slike studier betydelig lettere ved å løse problemene bildebehandling i levende vev, som lysspredning og photodamage. Videre gjennom kombinasjon av konvensjonelle elektrofysiologiske teknikker med to-Foton Ca2 + imaging, er det mulig å undersøke lokale Ca2 + svingninger i neuronal dendrites parallelt med opptak av synaptic aktivitet i Soma. Her beskriver vi hvordan du bruker denne metoden til å studere dynamikken i lokale Ca2 + transienter (cat) i dendrites av GABAergic hemmende interneurons. Metoden kan også brukes til å studere dendrittiske Ca2 + signalering i neuronal forskjellige i akutt hjernen skiver.
Introduction
Bidrag av en Nevron nettverk aktivitet avhenger i stor grad av dynamikken i synaptic innganger den mottar. Tradisjonelt avhengig den dominerende metoden for å karakterisere synaptic aktivitet i neurons somatiske hele celle patch-klemme opptak av postsynaptic strøm fremkalt av elektrisk stimulering av axons av passasje. Imidlertid er bare aktivitet av proximally ligger synapser sannferdig rapportert i dette tilfellet1. I tillegg for å vurdere synapse-spesifikke mekanismene, har innspillinger fra par av neurons og dendrites på et bestemt sted blitt brukt mot synapser rundt og mekanismer for dendrittiske integrasjon, henholdsvis. Et stort gjennombrudd innen synaptic fysiologi ble oppnådd gjennom et ekteskap av optisk og elektrofysiologiske. To-fotonet eksitasjon laserskanning mikroskopi (2PLSM) i kombinasjon med Ca2 + bildebehandling og optogenetic verktøy kan avsløre enorm detaljer om dynamisk organiseringen av synaptic aktivitet på bestemte nevrale forbindelser i hjernen stykker i vitro og i vivo.
Flere viktige fordeler gjort 2PLSM skiller seg ut fra de konvensjonelle, ett-fotonet eksitasjon mikroskopi2: (1) et ikke-lineære naturen av to-fotonet eksitasjon til fluorescens genereres bare i fokal volumet, og alle slippes ut fotoner representerer nyttig signaler (ikke behov for pinhole); (2) lengre bølgelengder, brukes i 2PLSM, trenge spredning vevet mer effektivt; i tillegg er spredte fotoner også fortynne to-fotonet eksitasjon og bakgrunn fluorescens; (3) photodamage og Phototoksisitet er også begrenset til fokalplanet. Derfor til tross for den høye prisen av 2-fotonet systemer med konvensjonelle AC confocal mikroskop fortsatt 2PLSM en metoden for valg for høy oppløsning undersøkelse av neuronal struktur og funksjon i tykke levende vev.
Den første anvendelsen av 2PLSM i spredning vev var å image struktur og funksjon av dendrittiske spines3. 2PLSM i kombinasjon med Ca2 + bildebehandling har avslørt at spines funksjon som isolert biokjemiske avdelinger. Siden i mange neuronal typer det er en en korrespondanse mellom spines og personlige synapser4, ble to-Foton Ca2 + imaging snart en nyttig verktøyet rapportering aktiviteten til individuelle synapser i intakt vev5, 6,7,8. Videre ble 2PLSM-baserte Ca2 + imaging brukt til å overvåke enkelt kalsium kanaler og ikke-lineære samspillet mellom de indre og synaptic conductances, samt å vurdere tilstanden - og aktivitet-avhengige regulering av Ca2 + signalering i neuronal dendrites5,6,7,8,9,10,11.
Kalsium er en allestedsnærværende intracellulær andre messenger og sin subcellular spatiotemporal organisasjon bestemmer fysiologiske reaksjoner, fra endringer i synaptiske styrke reguleringen av ion kanaler, dendrite og ryggraden vekst, som celledød og overlevelse. Dendrittiske Ca2 + elevations oppstå via aktivering av flere veier. Handlingen potensialer (APs), backpropagating til dendrites, åpne spenning-gated kalsium kanaler12 og produsere relativt globale Ca2 + transienter (cat) i dendrites og spines13. Synaptiske overføring er forbundet med aktivering av postsynaptic Ca2 +-permeable reseptorer (NMDA, Ca2 +-permeable AMPA og kainate), utløser synaptic kattene6,14,15. Endelig kan supralinear Ca2 + hendelser genereres i dendrites under visse forhold11,12,13,16.
To-fotonet Ca2 + imaging i kombinasjon med patch-klemme elektrofysiologiske opptak bruker syntetiske Ca2 +-sensitive fluorescerende indikatorer, som vanligvis leveres gjennom oppdateringen elektroden under hele celle opptak . En standardmetode for kvantifisering av Ca2 + dynamics er basert på dobbelt indikator metoden17,18. Den bruker to fluorophores med godt adskilt utslipp spectra (f.eks, en kombinasjon av en rød Ca2 +-ufølsom fargestoff med grønne Ca2 + indikatorer, som Oregon Green BAPTA-1 eller Fluo-4) og har flere fordeler sammenlignet med den enkelt indikatoren metode. Først, en Ca2 +-ufølsom fargestoff brukes til å finne små strukturer rundt (dendrittiske grener og spines) der Ca2 + imaging utføres. Det andre beregnes forholdet mellom endringen i grønne og røde fluorescens (ΔG/R) som et mål på [Ca2 +], som er hovedsakelig ufølsom for endringer i planlagt fluorescens på grunn av svingninger i [Ca2 +]017 , 18. videre fluorescens endringer kan kalibreres i absolutt Ca2 + konsentrasjoner19.
En generell bekymring når du kjører to-fotonet Ca2 + tenkelig eksperimenter i akutt skiver er cell helse og stabilitet av bildeopptak fordi at høy laser brukes vanligvis. Ca2 + tenkelig eksperimenter er det også bekymring om forstyrrelsene og betydelig overvurdering av subcellular Ca2 + dynamics skyldes at Ca2 + indikatorer fungere som svært mobile eksogene Ca2 + buffere. Dermed valget av Ca2 + indikatoren og konsentrasjonen avhenger av hvilken neuronal, forventet amplituden av katter, og eksperimentelle spørsmålet.
Vi tilpasset metoden av to-fotonet Ca2 + imaging for undersøkelse av Ca2 + svingninger i dendrites GABAergic interneurons9,10,11,20,21 , 22. mens mesteparten av Ca2 + imaging studier ble gjort i viktigste nerveceller, hemmende interneurons presentere en rekke funksjonelle Ca2 + mekanismer som er forskjellige fra de i pyramideformet celler20 , 23 , 24. disse interneuron-spesifikke mekanismene (f.eks, Ca2 + permeable AMPA reseptorer) kan spille spesifikke roller i å regulere celle aktivitet. Mens dendrittiske Ca2 + signalering i interneurons er en fristende mål for videre etterforskning, presenterer to-Foton Ca2 + bildebehandling i dendrites av disse cellene flere utfordringer, fra tynnere diameter dendrites og mangel på spines til spesielt endogene Ca2 + bindende bæreevne. Som vår forskningsinteresser fokus på studiet av hippocampus interneurons, var følgende protokollen, mens gjelder for ulike neuronal befolkningsgrupper, tilpasset å håndtere disse utfordringene.
Denne protokollen ble utført med en kommersiell AC confocal to-fotonet mikroskop, som var utstyrt med to eksterne, ikke-descanned detektorer (NDDs), elektro-optiske modulator (EOM) og en Dodt skanning gradient kontrast (SGC), og installert på en optisk tabell. Mikroskopet ble kombinert med en Ti:Sapphire multiphoton laser modus-låst på 800 nm (> 3 W, 140 fs pulser, 80 Hz gjentakelseshastigheten). Bildebehandling systemet var utstyrt med en standard elektrofysiologi rigg, inkludert en perfusjonsmåling kammer med temperaturkontroll, en oversette plattform med to micromanipulators, en datastyrt microelectrode forsterker, en digitaliseringsenhet, en stimulering enheten, og programvare for oppkjøpet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene ble utført i henhold til dyrevelferd veiledning av dyr beskyttelse komiteen av Université Laval og kanadiske Rådet for Animal Care.
1. foreløpige forberedelse (valgfritt: forberede 1 dag i forveien)
- Forberede tre typer kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) løsning (Normal, sukrose og gjenopprettingsløsninger, 1 L hver, se tabell 1). Justere osmolality av løsninger til 300 ± 10 mOsm25 og kul ACSF-sukrose ned nær frysepunktet (0-4 ° C).
Merk: Bruk av en lav-natrium kutte løsning (ACSF-sukrose) bidrar til å bevare levedyktigheten til nerveceller i overfladisk lagene akutt skiver26. - Forberede 0,75 mL patch-løsning som inneholder en rød fluorophore (f.eksAlexa-594) og en grønn syntetiske kalsium indikator (f.eksOregon Green BAPTA-1, se tabell 1). Inkluderer biocytin (se tabell 1) i patch-løsningen hvis du bokfører hoc morfologiske identifikasjon av innspilte celler.
- Justere osmolality av løsningen på 280 ± 5 mOsm og pH til 7.35 ± 0,5. Holde løsningen i kjøleskapet eller på is til alle tider.
Merk: Valg av indikatoren kalsium bør være predicated på dens dynamiske område og natur undersøkte Ca2 + hendelsene. - Bruker en brønnene avtrekker, forberede oppdateringen Pipetter fra Borosilikatglass kapillærene (se Tabell for materiale) med et ≈ 2 µm tips (pipette motstand av 3-5 MΩ) og stimulering Pipetter fra borosilicate theta-glass kapillærene (se tabell av Materialer) med en 2-5 µm tips.
Merk: Innstillingen avtrekker å gjøre Pipetter av en gitt diameter og form avgjøres av hvilken avtrekker filament og rampe testresultatene for en gitt type glass.
2. hippocampus skive forberedelse
- Bedøve musen (P13-20; påkjenningen og sex museklikk bestemmes av det eksperimentelle spørsmålet blir adressert) med 1 mL av isoflurane på et papirhåndkle i en innånding narkose kammer. Når Dyret er dypt anesthetized, som dokumentert av mangel på bevegelse og langsom åndedrett, fjerne den fra narkose kammeret og halshugge bruker en giljotinen.
- Utsett skallen ved å kutte huden med en liten saks fra baksiden av skallen til nesen. Bruk en liten par mini bein rongeurs til å lage et hull på bregma nivå. Deretter bruke saksen for å gjøre et caudal til rostral kutt langs den sagittal Sutur. Med rongeurs gripe baksiden av hver skallen klaff og heis oppover og utover for å fjerne skallen dekker hver halvkule.
- Etter at hjernen er fullt eksponert, undergrave optikk nerver med en liten spatel. Fjerne hjernen fra skallen og legg den i en Petriskål inneholder kontinuerlig oksygenrikt, kalde ACSF-sukrose (se tabell 1 for sukrose konsentrasjon).
- Hvis vev fra eldre mus, utføre en intracardiac perfusjon bruker en sprøyte (25G) fylt med 20 mL av iskalde ACSF-sukrose før hjernen utvinning for å få god kvalitet skiver.
- Forberede hippocampus skiver fra utdraget dyr hjernen.
- La hjernen chill for rundt 2 min. filter papir på en is-pakket Petriskål, overføre hjernen på papiret filter. Dissekere de to halvkulene.
- Lim dissekert halvkuler (retning bestemmes av eksperimentelle målet å få Koronal, tverrgående eller horisontal skiver) på en vibratome tabell og Dynk kjeden i vibratome skuffen fylt med iskald oksygenrikt ACSF-sukrose. Gjør 300-µm tykke skiver ved en temperatur på ca 1 ° C ved hjelp av en vibratome kjøligere eller plassere isen rundt vibratome skuffen.
- Bruke en flat pensel, samle skiver som inneholder hippocampus (opptil 6 stykker per halvkule) i et bad som inneholder oksygenrikt ACSF-utvinning oppvarmet til 37 ° C.
- Lar skiver i ACSF-utvinning badet i minst 45 min.
3. hele celle Patch-klemme opptak
- Etablert en hippocampus skive badekar plassert mål (forstørrelse: 40 x, numerisk aperture: 0,8) av laserskanning to-fotonet mikroskop. Kontinuerlig perfuse bad med oksygenrikt ACSF normalt oppvarmet ved 30-32 ° C med en hastighet på 2,5-3 mL/min.
- Bruke infrarød differensial interferens kontrast (IR-DIC) eller Dodt-SGC mikroskopi for å finne en celle rundt med sin størrelse, form og plassering.
Merk: Avhengig av befolkningen målrettet Nevron, en transgene musemodell kan brukes å lett finne cellene rundt. I dette tilfellet kan dette trinnet erstattes med bruk av en fluorescerende lyskilde. - Fyll en stimulering pipette med en ACSF-Normal løsning som inneholder de røde fluorophore (f.eksAlexa-594).
- Angi stimulering Pipetter (koblet til en elektrisk stimulering enhet) på sektoren slik at spissen er i samme område som cellen rundt.
- Etter fylle oppdateringen pipette med oppdateringen løsning og feste den til en leder scenen, sette den over sektoren slik at dens tips er direkte over cellen rundt.
- En sprøyte tilpasses en treveis stopcock og koble den til patch-pipette gjennom plast røret. Injisere konstant positivt trykk i oppdateringen Pipetter (≈ 0,1 mL) bruker sprøyten. Vær stopcock "Lukk" posisjon.
- Aktiver modulen forsterker kontroll programvare og bytte til spenning-klemme modus ved å klikke på knappen "VC". Åpne den elektrofysiologi oppkjøp programvaren (f.eks, clampex) for kjøp av elektrofysiologiske signaler og klikk på ikonet "Membran Test" ha det stadig sende ut en firkantet spenning puls (5 mV, 10 ms), som er nødvendig å overvåke endringer i pipette motstanden.
- Lavere oppdateringen pipette før det er rett på toppen av målrettet cellen. Ved å lage kontakt med cellemembranen, fjerne trykket ved å slå av stopcock i "åpen" stilling.
Merk: Kontakt med cellemembranen oppdages når en liten økning i pipette motstanden (≈ 0,2 MΩ) er sett og en liten hakk på cellen skyldes positivt trykk. - Bruke en liten negative trykket oppdateringen pipette bruker en tom sprøyte passet inn i stopcock til pipette motstanden av programvaren når 1 GΩ. I vinduet "Membran Test" av den oppkjøp programvaren klemme cellen i-60 mV.
- Fortsette å bruke negative trykket til cellen åpnes og hele celle konfigurasjonen er oppnådd. Oppdagelsen av cellen tilstanden er basert på plutselige endringen i pipette motstand (fra 1 GΩ til 70-500 MΩ avhengig interneuron) og utseendet på store kapasitiv transienter i vinduet "Membran Test".
4. to-fotonet Ca2 + Imaging
- Hvis interessert i eksitatoriske postsynaptic svarene, legge til GABAA reseptor blokkering gabazine (10 µM) og GABAB reseptor blokkering CGP55845 (2 µM) i ACSF-badekar.
- Forsterker programvare kontrollmodulen, angir oppdateringen konfigurasjonen til gjeldende-klemme ved å klikke på knappen "CC" og registrere cellens avfyring mønster svar somatiske injeksjoner av depolarizing gjeldende (0,8-1.0 nA, 1 s). Vent minst 30 min for cellen skal fylles med indikatorene i oppdateringen løsningen.
Merk: Cellens avfyring mønster og aktive egenskaper kan brukes til å identifisere cellens undertype; f.eksrask-skyter celler. Det er viktig for indikator konsentrasjonen å stabilisere gjennom diffusjon før posten katter (se tabell 2 for feilsøking). - AP-utløste katter
- Ved hjelp av image oppkjøpet programvare, starte henting av bilder. Finn en dendrite rundt med røde fluorescens signalet. For å sikre synlig svar, først Velg en proksimale dendrite (≤ 50 µm) som effektiviteten av AP backpropagation kan betydelig nedgang med avstand i GABAergic interneurons22.
- Bruker det rektangulære verktøyet i bildet oppkjøpet programvaren, zoome inn på det målrettede området og bytte til den "xt" (linescan)-modus. Plasser skanningen over dendrittiske grenen av interesse. Med laser intensitet styrerne i oppkjøpet programvaren, kan du angi to-fotonet laser på et minimalt nivå der planlagte grønne fluorescens er litt synlig, unngå Phototoksisitet.
- I den elektrofysiologi oppkjøp programvaren "Protocol" vinduet og bilde oppkjøpet-programvare, lage en innspilling prøveversjon av inn ønsket varighet inneholder en somatiske gjeldende injeksjon av ønsket amplituden.
- Bruker bilde oppkjøpet programvaren, klikk "Start posten" og få fluorescens kontinuerlig for 1-2 s. Gjenta bildeopptak 3 - 10 ganger. Vent minst 30 s mellom enkelt skanner å unngå photodamage. Hvis anskaffe linescans på flere punkter langs en dendrite, ta dem i tilfeldig rekkefølge å unngå effekter.
- Synaptically utløste katter
- Finn en dendrite rundt med røde fluorescens signalet.
- Angi stimulering pipette på overflaten av stykket over dendrite av interesse. Sakte senke stimulering pipette på plass, minimere bevegelse for å unngå å forstyrre hele celle konfigurasjonen. Plasser pipette på 10-15 µm fra dendrite.
- For å visualisere hvor synaptic microdomains i aspiny dendrites, i bildet oppkjøpet programvaren bytte til den "xt' (linescan)-modus og plasserer langs dendrittiske grenen av interesse.
- I "Protocol" vinduet (av elektrofysiologi oppkjøpet programvare) og image oppkjøpet programvare, kan du opprette en innspilling rettssak som utløser stimulering enheten etter rettssaken startet.
- Bruke oppkjøpet-programvaren og klikk "Start posten" skanne langs dendrite kontinuerlig for 1-2 s. Gjenta Kjøp 3 - 5 ganger, venter 30 s mellom skanninger å hindre photodamage.
Merk: Lengden på skanning kan justeres avhengig av evoked hendelsen kinetikk, men bør minimaliseres for å unngå photodamage (se tabell 2 for feilsøking). - Gjenta trinn 4.5.5 i ulike forhold (f.eks, forskjellig intensitet/lengde av stimulering, innføring av en farmakologisk blokkering, etc.) avhengig av spesifikke spørsmål blir adressert.
- Stoppe oppkjøpet når cellen viser tegn til stadig dårligere helse: depolarization under -45 mV, økning i opprinnelige Ca2 + nivå, morfologiske forverring av dendrites (f.eks, blebbing, fragmentering, se tabell 2 for feilsøking).
- Skaff deg forberedende informasjon på cellens morfologi og holde oversikt over plasseringen av stimulering pipette, erverve en Z -stabel cellen i den røde kanalen. Med oppkjøpet programvaren 'xyz " modus, sette øvre og nedre stabel grensene til bildet hele cellen med alle prosesser inkludert. Angi ' trinn ' på 1 µm og starte stabel oppkjøpet ved hjelp av knappen "Start posten".
- Når Z-stakken er fullført, velger du "Maksimal projeksjon" i programvaren å sammenligne alle fokal planer av stabelen og kontrollere kvaliteten på oppkjøpet. Så, sakte trekke oppdateringen pipette av stykket.
- For å fikse sektoren for post hoc morfologiske identifikasjon, raskt fjerne stykket fra bad med en flat pensel, og plasser den mellom to filter papir, i et ACSF-fylt Petriskål. Erstatte ACSF med en 4% paraformaldehyde (PFA) løsning og la fatet i en 4 ° C eller kjøleskap over natten.
5. Immunohistochemistry for innlegget Hoc morfologiske identifikasjon av innspilte celler
Merk: Etter 1 natt med fixation i PFA, sektoren kan lagres i fosfatbuffer (PB) med Natriumazid (0,5%) for opptil 1 måned.
- Sette skive i Tris-bufret saltvannsoppløsning (TB) med Triton X-100 (0,3%) og utføre 4 vasker (5-10 min hver).
- Sette skive i TBS-Triton 0,3% med 10% normal geit serum (NGS) 1t.
- Sette skive i TBS-Triton 0,3% 1% NGS og en Streptavidin-konjugerte fluorophore (f.eksAlexa Fluor 546-konjugerte Streptavidin, 1:200) for natten inkubasjon.
- Vask 4 ganger (5-10 min) i TBS.
- Montere skiver på objektglass og bilde ved hjelp av en AC confocal mikroskop. For å ha en komplett celle rekonstruksjon, erverve en Z-stakken (trinn størrelse: 1 µm) ved hjelp av en 20 x målsetting. Bruk en 543 nm laser og en 515-560 nm oppdagelsen filter angi for imaging en Alexa-546-konjugerte etikett.
6. analyse av katter
- Ekstra fluorescens verdiene fra regionene rundt (ROIs) i linescan bilder fra de røde og grønne kanalene og gjennomsnittlige verdier for flere gjentakelser for hver tilstand å redusere støy.
Merk: Når linescan oppkjøpet utføres langs dendrite, er det mulig å trekke ut data fra flere ROIs, som kan tilsvare dendrittiske microdomains (2-5 µm), og dermed gir studiet av Ca2 + signal compartmentalization. - For hver avkastning, uttrykke endringene i Ca2 + amplituden som:
Merk: Her G er fluorescens verdien fra den grønne kanalen; G0 er opprinnelige fluorescens verdien fra den grønne kanalen i pre stimulering perioden; R er fluorescens verdien fra den røde kanal18. To-fotonet eksitasjon er svært lokalisert og genererer ikke en betydelig bakgrunn, kreves ikke subtraksjon av bakgrunnen fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen som presenteres her, fikk vi kattene fremkalt av somatiske aktuell sprøytebruk og elektrisk stimulering i dendrites av oriens/alveus interneurons innen CA1 hippocampus. Etter patching en Nevron, identifiseres basert på dens form og stilling, vi kjøpte linescans over en proksimale dendrite på flere punkter på gitt avstander fra soma (figur 1A). Observerte vi en nedgang i amplituden til katter indusert av backpropagating APs som avstanden fra soma økt (indikativ av redusert AP amplituden eller en avstand-avhengige nedgang i kalsium kanal distribusjon, figur 1B). Etter immunohistochemistry (med Streptavidin-konjugerte Alexa Fluor 546), var vi kan hente biocytin merkingen av cellen og identifiserer innspilte Nevron som en lagdelte celle med en axon opptar stratum oriens og stratum radiatum (figur 1 C). I andre forsøket, en stimulering pipette ble brakt til et distale dendrittiske område. Skanning langs dendrite, kunne vi deretter vurdere amplituden av postsynaptic Ca2 + signaler i en gitt dendrittiske gren (figur 2A-C) svar på elektrisk stimulering av axons av passasje. Postsynaptic kattene differansen imellom nærliggende dendrittiske microdomains (segment 1 til 6; Figur 2D), som kan være knyttet til en spredning av Ca2 + signalet fra sonen for initiering og/eller annen postsynaptic mekanismer involvert.
Figur 1: Representativt eksempel på AP-utløste Ca2 + transienter. (A) maksimal projeksjon av en to-fotonet Z-stabel (13 µm) med en lappet interneuron fylt med Alexa-594 (20 µM). Hvite linjer betegne plasseringen og lengden på linescans. (B) spor viser kattene skapte på steder i A. toppen spor viser kort AP toget generert gjennom somatiske aktuell sprøytebruk under innspillingen prøve. Tidsskalaen er den samme på alle spor vises. (C) maksimal projeksjon av en AC confocal Z-stack viser biocytin merkingen av cellen. O/A: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Stratum Radiatum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Postsynaptic Ca2 + transienter fremkalt av et utbrudd av elektrisk stimulering (3 stimuli på 100 Hz). (A) maksimal projeksjon av en to-fotonet Z-stakken (148 µm) viser en oppdatert interneuron fylt med Alexa-594. Hvit pilspisser peker til plasseringen av axonal terminaler i pyramideformet laget, antyder at interneuron er en kurv celle. (B) enkelt fokalplanet illustrerer dendrittiske grenen hvor stimulering elektroden var plassert. Stiplet linje viser linescan (C1 og C2). (C) bilder illustrerer resultatet av en linescan i rødt (1; Alexa-594; 20 µM) og grønn (2; Oregon grønn Bapta-5N; 300 µM) kanaler. Bildene var binned i mindre segmenter å analysere spredning av responsen over 30 µm. (D) spor viser Ca2 + transienter (cat) skapte i segmenter i C2. Topp spor viser spenning svaret elektrisk stimulering registrert på somatiske nivå under tenkelig rettssaken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Løsning | Komponent | Konsentrasjon (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glukose | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| ACSF-gjenoppretting | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glukose | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ACSF-sukrose | KCl | 2 |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glukose | 10 | |
| Sukrose | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-basert Patch løsning | K+- gluconate | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Phosphocreatin di (tris) salt | 10 | |
| ATP-Tris | 2 | |
| GTP-Tris | 0,2 | |
| Biocytin | 72 | |
| Alexa-594 | 0,02 | |
| Oregon Green-BAPTA-1 | 0,2 |
Tabell 1: løsning oppskrifter. Forbindelser og konsentrasjoner løsninger brukes under protokollen.
| Problem | Løsning |
| Kan ikke oppdatere sunn Nevron | Kontroller for tegn at sektorene er usunn: krympet eller hovne celler, synlig kjerner, etc. Hvis så, kaste skiver. Også kontrollere oppdateringen-pipette motstand og patch-løsningen osmolality; erstatte dem hvis verdiene ikke er i det aktuelle området. |
| Fluorescens signalet fra dendrites er lav | Vente lenger cellen å fylle. Hvis en obstruksjon holder patch-løsningen fra spre inn i cellen, prøve å bruke en liten mengde negative trykket i patch-pipette. |
| Elektrisk stimulering er ikke fremkaller Ca2 + svar | Sjekk for tilstedeværelsen av en gjenstand i elektrofysiologiske innspillingen. Hvis denne ikke finnes, se etter et kort-circuit/stimulerende enhet funksjonsfeil. Hvis heve stimulering intensiteten eller Flytt stimulering pipette nærmere til dendrite. Det skal bemerkes at avstanden mellom stimulering elektroden og dendrite ikke må overstige 8 um for å hindre direkte depolarization for dendrites når studere synaptic svar. |
| Vakte Ca2 + signalet er for høy/saturates Ca2 + indikator | Redusere laser makt. Hvis problemet vedvarer i flere celler, bruke en annen Ca2 + indikator, med en lavere Ca2 + affinitet. |
| Planlagte Ca2 + signal øker gradvis under eksperimentet | Vente lengre mellom individuelle skanninger. Hvis opprinnelige øker fortsatt, stoppe oppkjøpet; Angir at cellens helse er sannsynlig synkende. |
| Amplituden av Ca2 + signal synker under skanner | Redusere laser makt eller zoom ut (hvis aktuelt) |
| Dendrite er fragmentering ("blebbing") etter skanning | Reduser laser makt eller zoom ut. Hvis blebbing er begrenset til målrettet dendrite, velge en annen dendrite og redusere laser makt / zoom ut. Hvis flere dendrites blebbing, stoppe oppkjøpet. |
| Fluorescens signaler flyter"" streken skanning etter feier | Redusere bevegelse i sektoren ved å redusere hastigheten på ACSF perfusjon. Før, oppdatering sikker på at stykket er sterkt fast på plass av nettet. |
Tabell 2: feilsøking tabell. Løsninger på vanlige problemer som kan oppstå under en Ca2 + imaging eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden vist her demonstrerer hvordan kombinasjonen av to-fotonet Ca2 + bildebehandling og patch-klemme elektrofysiologi kan brukes for å studere dendrittiske Ca2 + signalering i neuronal dendrites i akutt hjernen skiver. Denne metoden tillater overvåking av både den lokale Ca2 + høyder fremkalt av elektrisk stimulering eller backpropagating AP dendrittiske segmenter og celle somatiske respons. Dette gjør det et utmerket verktøy for å studere hvordan ulike deler av dendrittiske treet integrere innganger og kommunisere med soma. Men gitt lengden på eksperimentet, særlig oppmerksomhet må betales til celle helse ved å begrense bruk av laser makt for imaging for å unngå photodamage av dendrites. Dette kan også oppnås ved å redusere zoomenivået, redusere varigheten av skanning og øke skannehastighet under bildeopptak. Imaging interneuron dendrites introduserer ekstra utfordringer. Som dendrites av disse cellene har ingen tornar, anbefales skanning langs dendrite å lette lokalisering av postsynaptic Ca2 + microdomains. I tillegg er gitt endogene Ca2 + bindende bæreevne, Ca2 + høyder i interneuron dendrites mindre og tregere enn dem som genereres i dendrites av pyramideformet celler. Dette krever å anskaffe flere linescan bilder for snitt og en tilstrekkelig lang varighet av personlige linescans for å beskrive Ca2 + signal kinetics riktig.
Lokale elektrisk stimulering bruke bipolar theta-glass elektrode representerer et nyttig verktøy for karakteristikk av dendrittiske postsynaptic Ca2 + microdomains. Imidlertid kan det fortsatt aktivere forskjellige "en passant" axons ligger i et gitt område. Antall innganger aktivert i dette tilfellet er ukjent og kan estimeres bare bruke beregningsorientert tilleggsverktøy. To-fotonet glutamat uncaging27, som tillater samtidig stimulering av flere individuelle synapser, representerer et godt alternativ for fremlokkende lokale dendrittiske Ca2 + svar. Denne metoden er mye brukt for studiet av rektor celler, som har klart definerte eksitatoriske postsynaptic strukturer (spines), men er ikke egnet til studiet av interneurons, som samlet har en lav ryggraden tetthet. Uncaging glutamat langs interneuron dendrite som det brukes til oppdragsgiver celler ville uunngåelig aktivere flere extrasynaptic mekanismer av Ca2 + signalering9,10, gjør det vanskelig å tolke den observasjoner.
I det siste tiåret tilbød fremskritt innen optisk teknologi forbedret midlertidig løsning for to-fotonet Ca2 + bildebehandling. En av de mest lovende er tilfeldig tilgang mikroskopi (RAMPEN) gjennom acousto-optisk deflektorer (AODs)28,29. I motsetning til konvensjonelle raster skanning, skanner RAMPEN valgte interessepunkter på høy frekvens, som er aktivert av den raske hastigheten av treghet-fri AODs. Det er ideelt for samtidige studier av flere dendrittiske grener, så det ikke er begrenset til poeng lagt ut i en lineær mønster. Høyere timelige oppløsning tilbys av AODs kan imidlertid være unødvendig når imaging Ca2 + hendelser varig hundrevis av millisekunder i samme fokal plan. I tillegg kan plasseringen av skanning poeng i den samme strukturen av interesse være vanskelig å kontrollere på grunn av mikro-driver i skive preparater forbundet med en høy perfusjon rente, som er nødvendig for god skive kvalitet. Derfor er timelige høyoppløselig (500-700 Hz) linescan-baserte anskaffelsesmetoden presenteres i denne artikkelen fremdeles foretrekke når imaging Ca2 + signaler i individuelle dendrittiske grener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av kanadiske institutter for helseforskning, naturvitenskap og Engineering Research council (NSERC Discovery Grant) og Savoy Foundation. OC ble støttet av en Ph.D. fellowship fra NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Yuste, R., Denk, W. Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration. Nature. 375, 682-684 (1995).
- Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Structure and Function of Dendritic Spines. Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).
- Sabatini, B. L., Svoboda, K. Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis. Nature. 408, 589-593 (2000).
- Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated. Nature. 399, 151-155 (1999).
- Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Plasticity of calcium channels in dendritic spines. Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).
- Carter, A. G., Sabatini, B. L. State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons. Neuron. 44, 483-493 (2004).
- Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons. J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).
- Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons. J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).
- Camiré, O., Topolnik, L. Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons. J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).
- Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials. Neuron. 24, 727-737 (1999).
- Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons. J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics. J Physiol. 551, 67-78 (2003).
- Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting. J Physiol. 558, 465-478 (2004).
- Oertner, T. G. Functional imaging of single synapses in brain slices. Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 219, pl5 (2004).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing. Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).
- Camiré, O., Topolnik, L. Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons. Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).
- Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus. eNeuro. 3, 1-26 (2016).
- Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons. J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).
- Topolnik, L. Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons. Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).
- Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors. Front Physiol. 3, 259 (2012).
- Bourque, C. W. Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation. Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).
- Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors. Neuron. 19, 465-471 (1997).
- Salomé, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).
- Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector. Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).
