Summary
Dieser Artikel beschreibt, wie die Maus embryonalen Hinterhirn als Modell für das Studium Entwicklungsstörungen Neurogenese im gesamten Organ und Gewebe Abschnitt Vorbereitungen verwendet werden kann.
Abstract
Die Maus-Embryo Vorderhirn ist die am meisten verwendeten System für das Studium von Säugetieren Neurogenese während der Entwicklung. Stark gefaltete Vorderhirn Neuroepithelium ist jedoch nicht zu Wholemount Analyse, Orgel-weite Neurogenese Muster zu untersuchen. Definieren die Mechanismen des Vorderhirns Neurogenese ist übrigens nicht unbedingt prädiktive der Neurogenese in anderen Teilen des Gehirns; zum Beispiel durch das Vorhandensein des Vorderhirns-spezifische Stammvater Subtypen. Die Maus Hinterhirn bietet ein alternatives Modell zur Erforschung embryonaler Neurogenese, die zu Wholemount Analyse sowie Gewebeschnitte, die räumlich-zeitliche Verteilung und das Verhalten von neuronalen Vorläuferzellen zu beobachten ist. Darüber hinaus ist es leicht für andere nachgeschaltete Anwendungen wie Isolation oder Molekularbiologie Zellanalyse seziert. Wie die Maus Hinterhirn leicht analysiert werden kann in die überwiegende Zahl der Zelle Abstammung Reporter und mutierte Maus-Stämmen, die verfügbar geworden sind, bietet es ein leistungsfähiges Modell für die Erforschung der zellulären und molekularen Mechanismen der Entwicklungsbiologie Neurogenese in einem Säugetier Organismus. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode, um die Maus Embryo Hinterhirn nutzen zur Auswertung von Säugetieren neuronalen Vorläuferzellen Zelle (NPC) Verhalten in Wholemount Vorbereitungen und Gewebeschnitte.
Introduction
Während der Säugetier-Embryonalentwicklung unterteilen NPCs in die ventrikuläre (VZ) und subventricular (SVZ) Zonen des expandierenden Neuroepithelium neue Neuronen in einem Prozess bezeichnet "Neurogenese" zu generieren. Die Generation der neuen Nervenzellen und deren Vorläufern NPC wurde ausgiebig im Vorderhirn1, untersucht, während weniger über diesen Prozess in anderen Regionen bekannt ist.
Das Vorderhirn ist eine komplexe und kunstvoll gefalteten Struktur, die weitgehend nach Gewebe zu schneiden, mit histologischen Methoden untersucht ist, die Verständnis Neurogenese Muster über das gesamte Organ anspruchsvoll macht. Darüber hinaus sind die Studien des Vorderhirns Neurogenese nicht unbedingt prädiktiv für neurogene Verhalten in anderen Regionen des Gehirns oder des Rückenmarks. Zum Beispiel fördern, Signaltechnik Hinweise über verschiedene CNS Regionen, unterschiedliche Reaktionen hervorrufen können, wie im Fall von ciliary Neurotrophic Factor und hemmender Faktor der Leukämie beobachtet, die Selbsterneuerung der NPCs in die seitliche ganglionic Eminenz, sondern Fahrt Differenzierung des Rückenmarks Stammväter2. Darüber hinaus eine Unterklasse von NPCs, die füllen die entwickelnden Vorderhirn und tragen wesentlich zum Ausbau der Großhirnrinde1 fehlen aus dem Hinterhirn und Rückenmark3. Umgekehrt ist es denkbar, dass das Rückenmark und Hinterhirn alternative NPC Subtypen nicht vorhanden in der Rinde enthalten.
Die Maus-Embryo-Hinterhirn ist evolutionär ältesten Umgebung: das Gehirn von Säugetieren und erzeugt das Kleinhirn und der Hirnstamm. Trotz seiner Erhaltung über Artgrenzen ist relativ wenig über Hinterhirn Neurogenese, einschließlich NPC Subtypen oder ihre Verordnung bekannt. Die Mehrheit der Hinterhirn Forschung in der Maus konzentriert sich auf den Prozess der Gewebe Segmentierung, Hox-Gene-4und die Strukturierung von Post-mitotische Neuronen5angetrieben. Darüber hinaus hat das Hinterhirn als Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Entwicklungsbiologie Angiogenese6verwendet worden.
Im Gegensatz zu der Maus Hinterhirn wurde Zebrafisch Hinterhirn ausgiebig zur NPC Differenzierung und Abstammung Progression in vertebrate Modellorganismus (z.B.7,8) folgen. Die Küken Hinterhirn wurde auch eingesetzt, um die Neurogenese während der vertebrate Entwicklung (z.B.9,10) zu studieren. Ähnlich wie bei der Zebrafisch Hinterhirn11, kann die Küken Hinterhirn spannungsführend sein abgebildet um NPC Verhalten und Verordnung über Zeit12zu studieren. Analog longitudinale Beobachtung von live Imaging kann nicht derzeit in Säugetieren Organismen, weil sie entwickeln in der Gebärmutter. Darüber hinaus gezielte Manipulation durch Techniken wie Elektroporation ohne weiteres auf freilebende Zebrafish Embryos oder Küken Embryonen in Ovo (z.B.13) angewendet werden kann, aber diese Techniken auch anspruchsvoller in sind Utero.
Dennoch eignet sich die Maus Embryo Hinterhirn exquisit, die molekularen und zellulären Mechanismen zu definieren, die Neurogenese regieren. Erstens, Analyse der Maus Hinterhirn in vielen Fällen liefern Informationen, die für Menschen Entwicklungen relevanter als die durch das Studium der unteren Wirbeltiere erhalten ist. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von genetisch veränderte Mausstämme, dass entweder für Schicksal mapping murinen NPCs oder Regulationsmechanismen mit konstitutiven oder bedingte mutierten Allele Gene verändern verwendet werden kann. Schließlich, es wurde kürzlich gezeigt, dass Mikroinjektion von ventrikulären Hinterhirn Stammväter ex Vivo ermöglicht zumindest eine kurze Prüfung von Hinterhirn NPC Kinetik14. Noch heute ist sehr wenig bekannt über die räumlich-zeitliche Organisation und das Verhalten von Hinterhirn NPCs in einem Kontext des gesamten Organs.
Hier zeigen wir eine einfache und schnelle Methode um das Hinterhirn als ein leistungsfähiges Modell für die Analyse von Säugetieren NPC Verhalten in Wholemount Vorbereitungen und Gewebeschnitte zu verwenden. Wir bieten weitere Protokolle, um Immunolabeling nutzen für das Studium verschiedener Neurogenese Parameter und Prozessproben Hinterhirn weiter für nachgeschaltete molekularen Anwendungen wie quantitative Reverse Transkriptase (qRT)-PCR.
Protocol
Alle tierische Arbeit wurde nach UK Home Office und lokalen ethischen Richtlinien durchgeführt.
1. Zusammenfassung der Schritte und Timing
- Führen Sie zeitgesteuerte Paarungen erwachsener Mäuse aus einem Stamm geeignet, die biologische Frage untersuchten embryonalen Tag (e) 9,5-e13.5 Schwangerschaften zu erhalten; 12-15 Tage erfordert.
- Bereiten Sie optional, 5-Bromo-2'-Deoxyuridine (BrdU) / 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine (EdU) Lösung, und führen Sie Injektion (Protokoll Abschnitt 2); erfordert ~ 1 h am Vortag oder am Tag der Embryo isoliert, abhängig von der gewünschten Länge der EdU/BrdU Beschriftung.
- Führen Sie Embryo isoliert und Hinterhirn Dissektion (Protokoll Abschnitt 3); erfordert ~ 10 min/Embryo.
- Führen Sie Wholemount Immunfluoreszenz Kennzeichnung (Protokoll Abschnitt 4); 3 Tage benötigt.
- Abschnitt mit einer Vibratome und schwimmenden Abschnitt Immunfluoreszenz Kennzeichnung (Protokoll Abschnitt 4) durchführen: dauert 2 Tage.
- Abschnitt mit einem Kryostaten und führen Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Cryosections (Protokoll Abschnitt 5); 2 Tage benötigt.
2. Spritzen Sie schwangere weibliche Maus mit BrdU oder EdU (Optional)
- Lösen Sie auf, BrdU oder EdU in sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu einer Konzentration von 10 mg/mL und 1 mg/mL, beziehungsweise.
Achtung: BrdU und EdU sind giftig; angemessenen Schutz zu tragen. - Wiegen die schwangere Maus und berechnen Sie das Volumen der BrdU oder EdU-Lösung, die verabreicht werden sollten, um 100 mg/kg BrdU zu erreichen bzw. 5 mg/kg EdU.
- BrdU oder EdU-Lösung durch die intraperitoneale Route entweder 1 h oder 1 Tag vor dem Sammeln der Embryonen, abhängig von der erforderlichen Länge der Beschriftung zu injizieren.
Hinweis: Kennzeichnung für 1 h Hinterhirn Zellen in der S-Phase visualisiert. Kennzeichnung für 1 Tag visualisiert die Nachkommen von Hinterhirn NPCs.
3. Zerlegung des Hindbrains aus e9.5 - e13.5-Maus-Embryonen
- Einschläfern Sie eine zeitlich-schwangeren weiblichen Maus mit einem ethisch genehmigten Verfahren in der erforderlichen Schwangerschafts Stadium (z.B. zervikale Dislokation). Mit einer scharfen Schere aufschneiden der Bauchhöhle und sorgfältig Verbrauchsteuern die Gebärmutter. Legen Sie die ausgeschnittene Gebärmutter mit den Embryonen in einer 60 mm Plastikschale mit 20 mL eiskaltem PBS.
Hinweis: Aseptischer Technik ist nicht erforderlich. - Führen Sie alle weiteren Dissektion mit einem sezierenden Mikroskop. Verwendung von Uhrmacher Pinzette Nummer 5, reißen Sie die uterine Muskelwand zu entlarven die Embryonen, lösen Sie jedes Embryo durch die Nabelschnur durchtrennen und Entfernen der Dottersack.
- Mit einer sterilen Pasteurpipette mit Wide-Bohrung öffnen jedes Embryo übertragen Sie in eine saubere Kunststoff Schale mit eiskaltem PBS.
- Trennen Sie Uhrmacher Pinzette Nummer 55 verwenden, den Kopf (Abbildung 1E).
- Ein kleines Stück des Gewebes (z. B.¼ der einen Dottersack oder ca. 2 mm Schwanzspitze) für genomische DNA-Isolierung und anschließende Genotypisierung optional zu behalten.
- Mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, Verbrauchsteuern des Gewebes mit dem Hinterhirn parallel und gleich unter dem Hinterhirn Neuroepithelium es Gesichts- und Vorderhirn Gewebe (Abb. 1F) getrennt.
- Positionieren Sie das Hinterhirn und kaudalen Kopf Gewebe Rückenseite oben und identifizieren Sie die 4th Ventrikel, die durch eine dünne Gewebeschicht (Dach Platte) abgedeckt ist. Sorgfältig die Dach-Platte mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55 (Abbildung 1) durchbohren und schälen entfernt überschüssiges Gewebe mit der Pinzette, das Mittelhirn, Rostral entlang der Mittellinie überfahren und dann kaudal über den hinteren Hinterhirn und des Rückenmarks (Abbildung 1 ); Das Hinterhirn sollten jetzt in ein offenes Buch-Vorbereitung (Abbildung 1 H) ausgesetzt werden.
- Bereiten Sie Hindbrains für Wholemount Immunolabeling (Option 1).
- Necken Sie mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, sorgfältig entfernt restlichen Kopf Mesenchym und jede Hirnhaut pial seitlich von dem Hinterhirn mit Pinzette (Abbildung 1I) befestigt. Entfernen Sie das Mittelhirn und Rückenmark Gewebe (Abbildung 1J) um nur das Hinterhirn Gewebe (Abbildung 1 K) zu verlassen.
Hinweis: Dieser Schritt des Verfahrens sollte nicht bei e9.5 oder e10.5, zurückgegriffen werden, da Versuch, dazu wahrscheinlich das Hinterhirn Neuroepithelium beschädigen würde. Entfernen der Hirnhäute ist übrigens nicht erforderlich, weil das Hinterhirn Neuroepithelium zum jetzigen Zeitpunkt effiziente Eindringen von Antikörpern für Immunolabeling ausreichend dünn ist. Dieser Schritt sollte jedoch, von e11.5 ab, verfolgt werden, wenn die meningealen Gewebe festigt um Antikörper Eindringen in das Hinterhirn Neuroepithelium zu verbessern. Dissektion ist am einfachsten, wenn Sie in eiskaltem PBS (Nutzung sauber PBS für jedes Hinterhirn) durchgeführt.
- Necken Sie mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, sorgfältig entfernt restlichen Kopf Mesenchym und jede Hirnhaut pial seitlich von dem Hinterhirn mit Pinzette (Abbildung 1I) befestigt. Entfernen Sie das Mittelhirn und Rückenmark Gewebe (Abbildung 1J) um nur das Hinterhirn Gewebe (Abbildung 1 K) zu verlassen.
- Hindbrains für Vibratome und Kryoschneiden (Option 2) vorbereiten
- Mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, entfernen Sie das Mittelhirn und Rückenmark Gewebe (Abbildung 1J).
Hinweis: Es ist nicht notwendig, Mesenchym und Hirnhäuten des Hindbrains für den Schnitt (siehe Abbildung 1I) zu entfernen.
- Mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, entfernen Sie das Mittelhirn und Rückenmark Gewebe (Abbildung 1J).
- Hindbrains aus der Plastikschale auf Runde Talsohle 2 mL Röhrchen mit einer Pasteurpipette übertragen, aspirieren Sie alle PBS und fix für 2 h bei 4° C mit sanft-Agitation in frisch aufgetauten 4 % w/V Formaldehyd in PBS aufgelöst.
Achtung: Formaldehyd ist giftig; angemessenen Schutz zu tragen. - Waschen Sie Hindbrains 3 X mal mit PBS. Bei 4 ° C mit PBS-Puffer zu speichern, wenn Immunolabeling wird innerhalb von 2-3 Tagen beginnen oder PBS mit 50 % methanol/50% PBS für 5 min ersetzen vor der Übertragung zu 100 % Methanol für eine längere Lagerung bei-20° C.
4. Wholemount Immunfluoreszenz
- Bei Bedarf, rehydrieren Hindbrains in abnehmender seriell Verdünnungen von Methanol mit PBS-Puffer (z. B.75 % Methanol, 50 % Methanol, 25 % Methanol) bei Raumtemperatur (RT) für 5 min und dann übertragen auf PBS.
Hinweis: Eine abgestufte Reihe von Methanol ist erforderlich, um sanft rehydrieren Hindbrains und richtige Gewebe Erhaltung zu gewährleisten. - Permeabilize Hindbrains für 30 min bei 4 ° C in PBS mit 0,1 % Triton x-100 (PBT) mit sanften Agitation.
- Inkubieren Sie Hindbrains für 1 h bei 4 ° C im PBT mit 10 % Hitze-inaktivierten Ziegenserum unter schonenden rühren.
Hinweis: Verwenden Sie Serum aus der Wirtsarten, denen die sekundäre Antikörper in erhoben wurden. Für Primärantikörper angehoben Ziege, brüten in serumfreien Protein blockieren, zum Beispiel 5 % Rinderserumalbumin in PBS oder eine kommerzielle Alternative (siehe Tabelle der Materialien). Dadurch verringert sich unspezifische Färbung häufig zu beobachten, wenn Sie Primärantikörper angehoben Ziege verwenden. - Hindbrains über Nacht bei 4 ° C im PBT mit 1 % Hitze-inaktivierten Serum und primären Antikörper mit sanften Agitation inkubieren (z.B., Kaninchen-Anti-Phospho-Histon H3 [pHH3] verdünnt 1: 400).
Hinweis: Für Primärantikörper angehoben Ziege, nutzen Sie PBT ohne Serum. - Waschen Sie die Hindbrains bei 4 ° C 5 X mit PBT für 1 h.
- Inkubieren Sie Hindbrains über Nacht bei 4 ° C im PBT mit entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (z.B. Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488) bei 1: 200 in PBT gezielt gegen die primäre Antikörper verwendet. Halten Sie Hindbrains in der Dunkelheit von hier aus auf Immunofluoreszenz Fluorophore schützen.
Hinweis: Für Primärantikörper angehoben Ziege, verwenden Sie Anti-Ziege Fab-Fragmente der Sekundärantikörper, um unspezifische Färbung zu reduzieren. - Waschen Sie die Hindbrains bei 4 ° C 5 X mit PBT für 1 h.
- Die Hindbrains in 4 % Formaldehyd in PBS für 15 min bei RT für dauerhafte Erhaltung der Antikörperbindung Postfix. Spülen Sie kurz zweimal mit PBS-Puffer.
- Decken Sie einen Glas-Objektträger mit zwei Schichten schwarzes Isolierband und Verbrauchsteuern ein kleines Quadrat aus geschichteten Band erstelle ich eine Tasche groß genug für eine Hinterhirn.
- Übertragen Sie jedes Hinterhirn in eine Tasche mit einer Pasteurpipette, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit zu und fügen Sie eines entsprechenden antifade Reagenz in der Tasche vor dem abdecken es langsam mit einem Glas Deckgläschen Trapping Luftblasen unter dem Deckglas zu vermeiden hinzu. Versiegeln Sie das Deckglas und kleben Sie es auf die Folie mit einer dünnen Schicht des Nagellacks. Folie bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Bildaufnahme (Protokoll Abschnitt 7) lagern.
5. Vibratome schneiden und schwimmende Abschnitt Immunfluoreszenz
- Falls erforderlich, rehydrieren Sie Hindbrains aus Methanol wie unter Punkt 4.1 beschrieben.
- Betten Sie Hindbrains in geschmolzenem 3 % w/V Agarose in destilliertem Wasser zubereitet.
Hinweis: Lassen Sie flüssige Agarose auf ca. 55 ° C abkühlen, kurz vor dem Einbetten um Hinterhirn Hitzeschäden zu vermeiden. - Schnitt quer Hinterhirn Abschnitten bis zu einer Dicke von 70 µm mit einer Vibratome. Übertragen Sie frisch geschnittene Abschnitte mit einem Pinsel in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte mit eiskaltem PBS.
- Die schwimmenden Abschnitte zu kennzeichnen, wie in 4.2-4.7 beschrieben, aber ändern Sie die Schritte wie folgt: Waschen der schwimmenden Abschnitte bei 4 ° C 3 X mit PBT jeweils 15 min Inkubationszeit für Sekundärantikörper 2 h zu verringern und in Sekundärantikörper bei RT inkubieren
- Optional nach Kennzeichnung mit Antikörpern für andere Epitope, wie unter Punkt 5.4 beschrieben, EdU+ Kerne mit einer EdU labeling Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erkennen. Inkubieren Sie die schwimmenden Abschnitte in der Reaktion cocktail für 30 min bei 37 ° C im Dunkeln. Waschen Hinterhirn Abschnitte 3 X mit PBT für 15 min bei 4 ° C.
- Optional nach Kennzeichnung für andere Epitope, wie unter Punkt 5.4 beschrieben, erkennen Sie BrdU+ Kerne wie folgt.
- Inkubieren Sie schwimmende Abschnitte in 2 N Salzsäure bei 37 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.
- Inkubieren Sie schwimmende Abschnitte in 0,1 M Natrium Borat Puffer pH 8,5 zweimal für jeweils 5 min bei RT in der Dunkelheit, die Salzsäure zu neutralisieren.
- Schwimmende Abschnitte 3 x kurz mit PBS-Puffer bei 4 ° c zu waschen
- Durchführen Sie Immunfluoreszenz labeling für BrdU wie unter Punkt 5.4 beschrieben.
- Inkubieren Sie die schwimmenden Abschnitte für 2 min bei RT in 10 µg/mL 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) mit PBS-Puffer, Zellkerne Gegenfärbung.
- Postfix die schwimmenden Abschnitte in 4 % Formaldehyd für 15 min bei RT
- Waschen Sie schwimmende Abschnitte kurz in PBS. Übertragen Sie schwimmende Abschnitte sorgfältig auf einen Glas-Objektträger mit einem Pinsel. Wischen Sie überschüssiges PBS rund um den Bereich mit Löschpapier oder Gewebe.
- Montieren Sie Abschnitte mit 80 % Glycerin in PBS und Abdeckung langsam mit einem Glas Deckgläschen Trapping Luftblasen zu vermeiden. Folie bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Bildaufnahme (Schritt 7) lagern.
6. Kryostat schneiden und Cryosection Immunfluoreszenz Kennzeichnung
- Falls erforderlich, rehydrieren Sie Hindbrains aus Methanol wie unter Punkt 4.1 beschrieben.
- Hindbrains in 30 % w/V Saccharose in PBS, Cryoprotect Hindbrains vor dem Einfrieren zu inkubieren.
Hinweis: Hindbrains sind bereit für das Einfrieren, wenn sie an der Unterseite des Rohres, versenkt haben, die dauert in der Regel ≤ 2 h für e9.5-10.5 Hindbrains und 3-6 h für e11.5-13.5 Hindbrains. - Tauchen Sie Hindbrains in optischen Schnitttemperatur zusammengesetzten (OCT) und frieren Sie schnell durch die Übertragung von Formen mit den Hindbrains im Okt. bis Isopentane auf-40 ° C bis-50 ° C auf Trockeneis gekühlt.
Hinweis: Bei-20 ° C kurzfristig und langfristig-80 ° C bis-Schnitt können gefroren, eingebettete Hindbrains gespeichert werden. - Schnitt quer Hinterhirn Abschnitten bis zu einer Dicke von 10 µm mit einem Kryostaten und Transfer zum elektrostatisch anhaftenden Objektträger.
Hinweis: Hinterhirn Cryosections können bei-20 ° C kurzfristig und langfristig-80 ° C bis Kennzeichnung gespeichert werden. - Inkubieren Sie Folien bei RT für 15 min Abschnitte zu den Folien zu trocknen. Cryosections mit PBS Waschen auflösen OCT und Mark eine hydrophobe Barriere rund um Cryosections mit einem PAP-Stift. Wiederholen Sie die Schritte 5.4-5.8.
- Wiederholen Sie Schritt 5.10 mit einem polyvinyl Alkohol basierenden Eindeckmedium anstelle von Glycerin.
7. die Bildaufnahme
- Bildbeispiele mit einem Epifluorescent oder konfokale Laserscanning-Mikroskop mit Linsen geeignet für wässrige Medien montierte Folien und optische Filter für die Fluorophore verwendet für Immunolabeling ausgestattet.
- Um das ganze Hinterhirn oder dem Hinterhirn Abschnitt Bild, verwenden Sie ein Objektiv für 10 X Vergrößerung (z.B. Abb. 2 b); Verwenden Sie um Hindbrains Bereiche für die Quantifizierung zu visualisieren, eine 40 X Vergrößerung (z.B. Abb. 2D) und zu visualisieren Einzelzellen, verwenden Sie ein Objektiv mit einer 63 X Vergrößerung (z.B. Abb. 2).
8. alternative Methoden
- Folgender Schritt 3,8 homogenisieren Sie unfixierten Hindbrains um eine einzelne Zelle Aufhängung für Durchflusszytometrie Anwendungen15zu produzieren.
- Folgender Schritt 3,8 homogenisieren Sie unfixierten Hindbrains zum Extrahieren von RNA aus einzelnen Zellsuspensionen für RT-qPCR (z.B. 16).
Hinweis: Stellen Sie sicher alle Reagenzien und Geräte sind gehalten, steril und RNase-kostenlos im gesamten Abbau der RNA zu verhindern. - Folgender Schritt 3,8 homogenisieren Sie unfixierten Hindbrains um NPCs zu isolieren und sie als Neurosphären für die Analyse von Hinterhirn NPC Verhalten17 in Vitro zu propagieren.
Hinweis: Stellen Sie sicher alle Reagenzien und Geräte sind steril, Bakterien-/Pilzbefall Neurosphäre Kulturen zu verhindern gehalten.
Representative Results
Dieser Abschnitt zeigt Beispiele für Ergebnisse, die bei der Neurogenese in der Maus embryonalen Hinterhirn durch Wholemount und Gewebe Abschnitt Analyse Untersuchung gewonnen werden können.
Wir zeigen, dass Wholemount Immunolabeling der Microdissected Hinterhirn mit einem Antikörper für die mitotische Marker pHH3 visualisiert NPCs in der VZ ( – Abbildung 2 b D) dividiert. Wir zeigen pHH3+ NPCs bei hoher Vergrößerung, verschiedene Stadien der Mitose (Abbildung 2) hervorzuheben. Wir haben gezeigt, die diese Kennzeichnung Methode ist geeignet, um in mehreren aufeinander folgenden Phasen des Hinterhirn Entwicklung zu beobachten, den zeitlichen Verlauf der NPC Mitose in diesem Organ (Abb. 2D) durchgeführt werden.
Wir zeigen, dass imaging quer Immunolabeled Vibratome Abschnitte von Hinterhirn 1 h nach der Injektion der EdU, visualisiert die Spaltung Ausrichtung der mitotischen NPCs (Abb. 3 b), pseudostratified, interkinetic nuklearen Migration Muster des Radsports Stammväter18 (Abb. 3 b, D), und die allgemeine VZ-Struktur (Abb. 3 b – D). Beachten Sie, dass mitotischen pHH3+ NPCs sind nur an der ventrikulären Oberfläche und nicht mehr basaler (Abbildung 3), die Kontraste der basalen Bereich Muster engagiertere NPCs im Vorderhirn19.
Wir zeigen auch, wie Radfahren, NPCs und deren differenzierten Nachkommen mit BrdU oder EdU NPC Linie Fortschreiten (Abbildung 4) zu bewerten bezeichnet werden kann. Die Immunolabeling quer Cryosections der Maus Hinterhirn 1 Tag nach der Injektion von BrdU für BrdU und Ki67zeigt die Anzahl und Positionierung des Radsports NPCs in der Neuroepithelium (Abb. 4A, B), wobei der Anzahl der selbst erneuern NPCs kann definiert werden, durch die Berechnung des Anteils des Ki67+ + BrdU Zellen unter allen BrdU+ Zellen (Abbildung 4A, C).
Zu guter Letzt zeigen wir ein Beispiel für Immunolabeling Hinterhirn Vibratome Abschnitte für RC2, ein Antigen in der neuronalen-spezifische intermediate Filament nestin, um NPC Endfeet (Abb. 5 b) und Prozesse (Abbildung 5) zu visualisieren. Vibratome Abschnitte, sondern als dünne Cryosections ermöglichen bessere Beobachtung der stark verzweigte NPCs und auch der Gesamtstruktur Gliazellen.
Abbildung 1 : Wichtige Schritte in die Dissektion der ein Hinterhirn aus dem e11.5-Maus-Embryo. (A – D) Schematische Darstellung der Hinterhirn Mikrodissektion. (A) der kaudalen Kopf Gewebe wird durch Durchtrennung entlang der roten gepunkteten Linien entfernt. (B) die Dach-Platte ist durchbohrt und dann weggerissen in rostral und kaudalen Richtungen entlang der Mittellinie (vertikale rote Linie) und dann seitlich auf dem Hinterhirn Neuroepithelium offenbaren. (C) die Neuroepithelium ist von der Hirnhaut nach dem Einlegen der Zange zwischen beiden Strukturen aufgebrochen, und das Mittelhirn und Rückenmark Gewebe werden durch Abtrennen des Gewebes mit der Zange an den rot gestrichelten Linien entfernt. (D) dieses Verfahren ergibt eine abgeflachte Hinterhirn. (E–K) Bilderfassung von Schlüsselstellen im Hinterhirn Mikrodissektion Verfahren. (E) des Embryos wird durch Abtrennen entlang der gestrichelten Linie geköpft. (F) das Hinterhirn 4th Ventrikel, umgeben von der Dach-Platte herausgeschnitten und durch Durchtrennung entlang der gestrichelten Linien vom Kopf getrennt. (G) orientiert sich die 4th Ventrikel nach oben bevor ein kleines Loch in die Dach-Platte (Sternchen) durchbohrt ist. Das Loch wird erweitert durch schälen das Gewebe vorsichtig sowohl Rostral und kaudal entlang der Mittellinie (Pfeile), dem Hinterhirn verfügbar zu machen. Das Hinterhirn ist positionierte pial Seite nach unten und links in ein offenes Buch-Vorbereitung, Falten (H; schwarze Pfeilspitze zeigt Hinterhirn Nervengewebe). Wenn das Hinterhirn für Wholemount Immunolabeling erforderlich ist, wird die pial Membran durch sanft neugierigen Hinterhirn Neuroepithelium aus den umliegenden meningealen Membranen mit Pinzette (ich) entfernt. Überschüssige Mittelhirn (mb) und Rückenmark (sc) Gewebe wird entfernt (gepunktete Linien in J), das Hinterhirn (K) zu isolieren. Maßstabsleiste: 500 µm für (E), 300 µm (F – K). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Wholemount Immunolabeling kann verwendet werden, um die NPC Mitosen über das Hinterhirn quantifizieren. (A) schematische Darstellung En face Bildgebung der mitotischen NPCs im Hinterhirn ventrikuläre Layer. V, ventrikuläre Hinterhirn Seite; P, pial Hinterhirn Seite. (B) konfokale Fliese Scan Z-Stapel von e10.5 Hinterhirn nach Wholemount Immunolabeling für die mitotische Marker pHH3 (rot). Das weiße Feld zeigt den Bereich bei höherer Vergrößerung im zweiten Panel (D) gezeigt. (C) Pre-Anaphase (weiße Pfeilspitze) und Anaphase (schwarze Pfeilspitze) mitotischen Figuren unterscheiden sich innerhalb der insgesamt Kohorte der mitotischen NPCs. (D) zeitlichen Verlauf der Wholemount pHH3 aus e9.5-13.5 Kennzeichnung. Skalieren Sie Bars: 500 µm (B); 20 µm (C); 100 µm (D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Radsport NPCs innerhalb ihrer germinal-Zone in die rostral Hinterhirn. (A) schematische Darstellung der Position der mitotischen (grün) und S-Phase (rot) NPCs an der Hinterhirn ventrikuläre Oberfläche und in der periventrikulären Region, beziehungsweise. Ein virtuelle Querschnitt durch das Hinterhirn ist bei höherer Vergrößerung auf der rechten Seite angezeigt. Der schwarze Pfeil zeigt die Richtung der Migration der NPC-nachkommen, die den Zellzyklus in Richtung der Differenzierung Zone verlassen haben. (B) konfokale Z Stack eines schwimmenden 11,0 Hinterhirn Abschnitts aus dem Embryo, der einen 1 h EdU Puls erhalten; Immunolabeling für pHH3 und EdU wurde zur mitotischen (grün) und S-Phase (rot) NPCs, bzw. zu visualisieren. Hinterhirn Oberflächen werden durch punktierte Linien gekennzeichnet; V, ventrikuläre Hinterhirn Seite; P, pial Hinterhirn Seite. Der Bereich durch ein weißes Feld angegeben wird bei höherer Vergrößerung im Einschub dargestellt; Pfeile zeigen die Spaltung Flugzeug von einem NPC in Anaphase, relativ zur linksventrikulären Oberfläche. (C) Einkanal anzeigen pHH3 Immunolabeling nur. Mitotische NPCs sind durch Cyan Pfeilspitzen angezeigt; das Fehlen der basalen Divisionen wird durch Δ. (D) Einkanal EdU Kennzeichnung nur anzeigen angezeigt. EdU+ NPCs annehmen eine pseudostratified Verteilung aufgrund ihrer interkinetic nuklearen Migration. Die Distanz, die NPCs Weg von der ventrikulären Oberfläche migrieren kann gemessen werden, wie mit einer repräsentativen orange Linie angegeben. Skalieren Sie Bars: 100 µm im (B -D); 10 µm im Einschub in (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Kombination von BrdU mit Ki67 Kennzeichnung Hinterhirn NPC Selbsterneuerung Kapazität ermitteln. (A) konfokale Z-Stapel von ein e10.5 Hinterhirn Cryosection nach Kennzeichnung für Ki67 (grün) und BrdU (rot) nach einem 1 Tag BrdU Puls. Doppel-positiven Zellen in der ventrikulären Zone sind NPCs, die BrdU aufgenommen haben und immer noch bewegen sich durch den Zellzyklus, wie von Ki67 Kennzeichnung angegeben. Der Anteil der Doppel-markierten Zellen unter der Gesamtbevölkerung BrdU+ stellt den Prozentsatz der selbst erneuernde NPCs. (B, C) einzelne Kanäle anzeigen Ki67 (B) und (C) BrdU Immunolabeling nur. Eine BrdU+ -Zelle, die Ki67 fehlt und daher wurde wahrscheinlich beendet den Zellzyklus wird durch eine Cyan Pfeilspitze in (A,C). Hinterhirn Oberflächen werden durch punktierte Linien gekennzeichnet; V, ventrikuläre Hinterhirn Seite; P, pial Hinterhirn Seite. Maßstabsleiste: 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Nestin Immunolabeling visualisiert NPC Prozesse und Endfeet. (A – C) Immunfluoreszenz für RC2, die ein Epitop auf das neuronale intermediate Filament nestin erkennt, zeigt NPC Morphologie über das Hinterhirn Neuroepithelium. (A) konfokale Z-Stapel von schwimmenden Ausschnitt aus einem e11.5 Hinterhirn nach RC2 Immunolabeling; geschachtelte Bereiche werden bei höherer Vergrößerung in angezeigt (B, B'; apikale/ventrikuläre Region) und (C, C'; basale Region). Hinterhirn Oberflächen werden durch punktierte Linien gekennzeichnet; V, ventrikuläre Hinterhirn Seite; P, pial Hinterhirn Seite. (B, C) Konfokale Z-Stapel von geschachtelte Bereiche in (A); einzigen optischen Abschnitte werden in gezeigt (B', C'), beziehungsweise. Ein NPC apikalen Endfoot verankert an der ventrikulären Oberfläche wird durch einen Pfeil (B') angezeigt. Einzel- und fasciculated NPC-Prozesse sind gekennzeichnet durch weiße und schwarze Pfeilspitzen in (C'), beziehungsweise. Skalieren Sie Bars: 100 µm, (A); 25 µm (B, C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Maus embryonalen Hinterhirn als Modell verwenden, um die Mechanismen der Entwicklung Neurogenese zu studieren. Mit einer Vielzahl von verschiedenen Immunolabeling Methoden, Hinterhirn NPCs visualisiert werden und ihre Zahl quantifiziert in Gewebeschnitten oder über Orgel Wholemounts. Die Leichtigkeit der Dissektion und flache Anatomie sorgt dafür, dass das Hinterhirn in ein "offenes Buch" Vorbereitung zu sammeln Informationen über Orgel-weite Neurogenese Muster abgebildet werden kann.
Wir zeigen weiter, dass NPC Morphologie und Zellzyklus-bezogene NPC Positionierung leicht in schwimmenden visualisiert werden können- oder Cryosections von dem Hinterhirn. Beide Verhaltensweisen können ausgenutzt werden, um neue Stammvater Bevölkerungen zu definieren, wie zuvor in den Säugetieren Telencephalon20durchgeführt wurde. Zum Beispiel frühen gebildet Sox2+ Neuroepithelia und apikalen radialen Glia Pax6+ sind in das Hinterhirn21,22, aber das Hinterhirn fehlt Tbr2+ basalen Vorfahren3 .
Das hier beschriebene Protokoll kann auch zu beobachten das Verhalten von bestimmten NPC Subpopulationen von fluoreszierenden Kennzeichnung für live Imaging und/oder Linie Ablaufverfolgung in festen Gewebe angepasst werden. Dies kann beispielsweise erreicht werden, durch das Studium der Hindbrains von Mäusen mit dem Tamoxifen-induzierbaren Sox1-iCreERT2 -Transgen und Rosa26TdTomato Reporter23.
Neben der Verbesserung der Kenntnisse der murinen Neurogenese, kann studieren das Hinterhirn aufzuklären im großen und ganzen relevante neurogene Mechanismen, die über Artgrenzen, geteilt werden weil das Hinterhirn eine hoch konservierte Gehirnregion ist, die ähnlicher werden voraussichtlich zwischen Wirbeltierarten als Vorderhirn.
Da Hinterhirn Neurogenese über eine vergleichsweise kürzere Zeitfenster als Vorderhirn Neurogenese23stattfindet, ist es wichtig zu berücksichtigen, dass die Notwendigkeit für den Vergleich von ausreichend Embryonen inszeniert. Dementsprechend ist experimentelle Verzerrungen vermieden durch zählen und aufzeichnen, die Anzahl der Somiten Paare in einem Embryo vor seiner Hinterhirn zu isolieren. Das Hinterhirn Gewebe selbst ist zerbrechlich und Zange sollte deshalb sorgfältig behandelt werden, wenn das Hinterhirn Gewebe aus dem Kopf Mesenchym und Hirnhäute zu trennen; ein paar "Praxis läuft" könnte daher ratsam sein, bevor Dissektion wertvolle Embryonen versucht wird. Zudem sollten Hindbrains aus einem Rohr übertragen werden, zum anderen mit einer Pasteurpipette weite Bohrung und nicht mit einer Pinzette, um Schäden zu vermeiden (die Pipette Eröffnung durch Schneiden der Spitze mit einer sauberen Schere verbreiterbar). Zu guter Letzt kann obwohl selten, das Ausmaß der EdU/BrdU-Aufnahme in S-Phase NPCs variabel, insbesondere während kurzer (d.h., 1 h) Impulse sein. Zur Verbesserung der Kennzeichnung zu gewährleisten Sie, dass EdU/BrdU richtig aufgelöst wird, bevor Sie die Lösung in die Spritze laden und injizieren Sie sorgfältig in die Bauchhöhle. Armen Injektionen, wie Sie subkutan durch Unfall, werden verlieren oder Überfüllung der EdU/BrdU Lösung führen und verhindern, dass es in den Kreislauf.
Disclosures
Die Autoren keine konkurrierenden Interessen oder widersprüchliche Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Vasiliki Chantzara zur Durchführung zeitlich Paarungen und die Mitarbeiter des Referats biologische Ressourcen am UCL Institute of Ophthalmology für Maus Tierhaltung. Diese Studie wurde unterstützt durch ein Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z CR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
| Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
| Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
| 29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
| Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
| Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
| Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
| Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
| 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
| Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
| Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
| Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
| Mowiol | Millipore | 475904 | |
| OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
| Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
| Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
| Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Thermometer | VWR | 620-0858 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |
References
- Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).
- Gregg, C., Weiss, S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain. Development. 132 (3), 565-578 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).
- Krumlauf, R. Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments. Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).
- Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).
- Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis. Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).
- Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors. Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).
- Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS. Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).
- Jacob, J., et al. Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1. Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Peretz, Y., et al. A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2. BMC Biol. 14, 57 (2016).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hutton, S. R., Pevny, L. H. SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon. Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).
- Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex. Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nat Commun. 4, 2125 (2013).
- Fantin, A., et al. Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction. Blood. 116 (5), 829-840 (2010).
- Kayam, G., et al. A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain. Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).
- Tata, M., et al. Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).
