Summary
Her præsenterer vi en protokol for at øge chimera produktion uden brug af nyt udstyr. En simpel orientering ændring af embryo til injektion kan øge antallet af embryoner produceret og potentielt reducere tidslinjen til kønscelleoverførsel transmission.
Abstract
I et forsøg på at øge effektiviteten i skabelsen af genmodificerede mus via ES celle metoder, præsenterer vi en tilpasning til de nuværende blastocyst injektion protokol. Vi rapporterer her, en enkel rotation af embryo og injektion gennem Trans-indre cellemasse (TICM) steg andelen af kimære Mus fra 31% til 50%, uden ekstra udstyr eller yderligere specialuddannelse. 26 forskellige indavlede kloner, og 35 samlede kloner blev injiceret over en periode på 9 måneder. Der var ingen signifikant forskel i enten graviditetsrate eller genfindingsprocenten for embryoner mellem traditionelle injektionsteknik og TICM. Derfor uden større ændring i indsprøjtningssystem processen og en simpel positionering af blastocyst og indsprøjte gennem ICM, kan frigive ES-celler i blastocoel hulrum potentielt forbedre mængden kimære produktion og efterfølgende kønscelleoverførsel transmission.
Introduction
I næsten 25 år, har oprettelsen af genetisk målrettede mus været en langsommelig proces, ofte hæmmet af en flaskehals på stadiet blastocyster ES celle mikroinjektion for generation af kønscelleoverførsel sender kimærer. De seneste fremskridt, herunder CRISPR/Cas91,2 målretning i ES-celler og høj overførselshastighed ES celle generation konsortier som KOMP, har forbedret generation/tilgængelighed af genetisk modificerede celler, ES. Generation af kønscelleoverførsel kimærer er imidlertid fortsat en flaskehals i at skabe genetisk modificerede mus fra disse ES celler3,4. Høj overførselshastighed ES celle generation projekter har været plaget af høj variabilitet i ES celle kvalitet, som er afgørende for vellykket skabelse af kønscelleoverførsel kimærer. Derudover er nogle af de almindeligt udnyttede ES cellelinjer kendt for høj aneuploidi og vanskelig produktion af kønscelleoverførsel kompetente kimærer5.
Mange metoder er blevet udviklet for at skabe mus med enten en højere chimera, eller helt ES celle afledte mus6,7,8,9,10. Mens hver af disse systemer har sine egne meritter, har de også deres svagheder. Generation af tetraploide kimærer, mens generere 100% ES celle afledte mus, er ineffektive, og er generelt begrænset til outbred linjerne 5,6. Nyere metoder til indsprøjtning morula kan give høj procentdel kimærer, nærmer sig 100%, men generelt kræver betydelige yderligere udstyr (lasere eller piezos) og uddannelse10,11. I laboratorier, hvor disse teknikker er allerede på plads, kan denne nye metode ikke være nødvendigt.
Denne undersøgelse mål var at finde en metode, der bruger almindelige teknikker og let tilgængelige udstyr til at øge hastigheden af chimera generation, øge chancen for kønscelleoverførsel transmission af den mutante allel at etablere efterfølgende mus koloni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle operationer blev udført som en del af den normale drift af NIEHS Knock Out mus Core facilitet. Alle mus blev holdt på en 12:12 h lys: mørke cyklus, og var affodre en kost af NIH-31 og vand ad libitum. Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med Animal Care og brug Udvalget af National Institute of miljømæssige sundhed Sciences.
1. animalsk forberedelse
- Racen donor mus, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J hunmus på 8-10 uger af alder naturligvis til B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J mandlige mus mellem 8 og 26 ugers alder. Kontrollere stik visuelt den følgende morgen (E0.5).
- Opdrætte recipient mus, schweiziske Webster hunmus mellem 6 og 9 ugers alderen er naturligt avlet til vasectomized schweiziske Webster mandlige mus. Kontrollere stik visuelt den følgende morgen (E0.5).
2. ES celle forberedelse
- For 129-derieved AB2.2 ES-celler, kultur celler i DMEM suppleret med 15% FBS, 1% glutamin, 1% Penn/strep og 0,1% β-mercaptoethanol. Kultur alle andre ES celler pr. ES celle leverandørens anvisninger, ved hjælp af deres anbefalede protokoller.
3. embryonopsamlingsteam
-
Animalske dissektion
- Forbered flere 60 mm retter, ca. 1 pr. 5 mus plus 3 ekstra, med 10 mL blast samling medier (BCM) (10% FBS i DMEM), og en 4 godt parabol med 0,5 mL BCM pr. brønd. Blandingen henstår ved 37 ° C, 5% CO2.
- Aflive B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J hunmus på E3.5 ved hjælp af CO2 kvælning, med en væskehastighed på 10%.
- Efter euthanizing, placere mus i den liggende stilling og våde maven grundigt med 70% ethanol.
- Gøre den første snit gennem huden kun, i midten af maven, gør åbningen så bredt som muligt. Næste åbne gennem bugvæggen, igen gøre indsnit så bredt som muligt.
Bemærk: Gør dette i to trin hjælper med at reducere eller eliminere pels forurening. - Startende fra en æggestok, og holde det fedt pad i æggestokkene med stumpe pincet, fjerne forsigtigt æggestokken, oviduct og livmoderen, at tage ekstra pleje at holde fedtvæv på et minimum. Fjerne livmoderen, som en enkelt enhed, eller som individuelle Horn, med ingen ændring i følgende procedure.
- Efter fjernelse, skal du placere livmoderen i en 60 mm skål indeholdende blast samling medier.
-
Embryo fjernelse
- Forberede en 10 mL sprøjte fyldt med BCM, og passer med en 25 G kanyle.
- En livmoderen ad gangen, fjerne dem fra bedriften parabol af BCM, dup dem på en væv til at fjerne overskydende blod, og placere i en 60 mm parabol under en lav forstørrelse dissekere mikroskop.
- Mens du omhyggeligt og forsigtigt holder livmoderen lige under den distale ende (nær oviduct) med dissekere pincet, indsætte nålen i midten af livmoderen i som parallel et fly som muligt. Indsætte nålen lige over spidsen af pincet.
- Anvende pres på pincet til at holde livmoderen til nålen, og udvise ca. 1 mL af BCM gennem horn af livmoderen.
Bemærk: Pleje skal tages på dette trin, da for meget pres på sprøjten vil medføre en ukontrollerbar strøm af medier, ofte forlader fadet. - Efter skylning i livmoderen, op til 5 hele livmoder pr. 60 mm parabol, Placer fadet tilbage i inkubatoren indtil samling.
-
Embryonerne blev indsamlet
- Brug en hånd trukket glas pipette og en mund pipette apparater, indsamle blastocyster under et dissekere muligheder, ligger mellem 25 X og 35 X. (Figur 1).
Bemærk: Mund pipette apparatet består af 30-40 cm af fleksible slanger, under 5 mm I.D. indsætte en 1 000 µL pipette tip, peg først i til den ene ende, og anbringer glas pipette i det. Tilføje en sprøjte filteret til anden enden, med en vedhæftet 1 cc sprøjte tønde, ingen stemplet til at fungere som et mundstykke. - At fjerne retter fra rugemaskinen, og ved hjælp af et gittermønster, undersøge hver del af parabol for embryoner. Embryoner er plukket op individuelt og placere på dråbe af BCM i en sekundær parabol.
- Efter indsamling fra alle retter, vask embryoner endnu engang i en dråbe frisk BCM, og derefter placere i 4 godt parabol til venter på injektion.
- Brug en hånd trukket glas pipette og en mund pipette apparater, indsamle blastocyster under et dissekere muligheder, ligger mellem 25 X og 35 X. (Figur 1).
4. embryo injektion
- Samle op ES-celler individuelt med indsprøjtning nålen baseret på bekræftelse.
- Forberede en injektion parabol ved tilsætning af 5-7 mL af injektion media (DMEM, 10% FBS og 20 mM HEPES) til et glas bund injektion parabol. Injektioner foretages ved stuetemperatur.
- Med enten en luft eller olie microinjector, anvende vakuum til injektion nålen henlede ES-celler. Sørge for at holde så lidt plads som muligt mellem celler. Tælle ES-celler, her, eller ved indsprøjtning skridt.
- Markere ES-celler, der er medium til små i størrelse i forhold til den almindelige befolkning af celler, med en glat overflade, og uden åbenlyse fejl såsom vacuoles.
Bemærk: ES cellepopulationer varierer meget i morfologiske kvalitet og de standarder, som anvendes bliver nødt til at justere med dem.
- Injicere embryoner med ca 15 ES-celler (figur 1).
- Vedhæfte en bedrift pipette tip til en anden luft microinjector, og placere et embryo nær åbningen af indehaveren. Anvende vakuum for at sikre embryonet til indehaveren.
- Justere for z-aksen ved at flytte bedrift pipette op eller ned for at fosteret er lige rørende dias, efterfulgt af fine fokuserer på zona. Næste, Juster Z-akse på injektion nålen, så ES celler nær spidsen er i fokus.
- Justere embryonet nu ved forsigtigt at skubbe fra injektion nålen på toppen eller bunden, dreje den for at sætte ICM i den ønskede position.
- Indsæt injektion nålen gennem zona, og enten ICM eller trofoblast, ved hjælp af en fast, men kontrolleret push. Anvende et let tryk til microinjector af injektion nål til at holde blastocoel fra kollapse.
- Når nålen har trængt ind i blastocoel, anvende pres fra microinjector til at overføre ES-celler til blastocoel af embryoet. Pause kort som facet af nålen begynder at afslutte embryo så presset i embryonet til at vende tilbage til normal, men har bevaret cellerne.
Bemærk: Reference group ES-celler blev injiceret normalt, følge en traditionel ES celle indsprøjtning protokol9, pas på ikke for at røre ICM. ES-celler blev også injiceres gennem ICM, skubbe nål direkte gennem ICM (TICM) (figur 2supplerende film).
5. overførsel af eEmbryos
- Overføre embryoner til schweiziske Webster mus på E2.5, ved hjælp af en ikke-kirurgisk embryo transfer enhed, pr. producentens procedurer. Denne ikke-kirurgisk procedure kræver ingen anæstesi eller særlige post-op pleje. Hus mus individuelt efter overførsel af embryoner, og gennem levering og efterfølgende fravænning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandling af celle-linje som de tilfældige effekt, blev en blandet effekter lineær model brugt til at analysere dataene i software (f.eks. SAS (version 9.2)). Hver analyse kontrolleres for antallet af embryoner overført og cellelinie. Den anden analyse også kontrolleret for antallet af unger, der overlevede.
For denne undersøgelse, hvert ES cellelinie og klon blev sprøjtet både med traditionelle og TICM teknikker, vekslende mellem de to metoder efter hvert embryon. Efter injektion, blev embryoner adskilt på fadet og grupperet efter overførsel, normalt mellem 12 og 15 embryoner pr. modtager kvinde. Embryoner, der ikke har en klart synlig blastocoel, manglede en Zona pellucida, eller hvor de microinjected ES-celler ikke at indtaste blastocoel, blev fjernet fra dette eksperiment.
De første data undersøgt var graviditetsrate. Som vist i figur 3, var graviditet satser uændret i gruppen TICM fra kontrolgruppen. Derudover en lige andel af hvalpe overlevede til fravænning (P = 0,50, figur 4). Vigtigst, mens antallet af mus ved fravænning forbliver uændret, antallet af unger vise coat farve kimærisme steg fra 31% til 50% for gruppen TICM (p = 0,005, figur 5). Graden af coat farve kimærisme blev anset for alt for subjektiv at være vurderet i denne undersøgelse, og ikke virkelig relevant for kønscelleoverførsel kimærisme.
Figur 1: specialiseret udstyr. (Venstre) Injektion mikroskop setup, herunder (A) Micro manipulatorer og (B) celle sporvogn luft. (Højre) Munden pipette apparater, med (C) trukket glas pipette, (D) 1000µL pipette tip, (E) slanger, (F) Filter og (G) sprøjte tønde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempel på blastocyst embryoner injektion. (A, B) Traditionelle injektion metode, hvor injektion nålen ind overfor af ICM, undgå enhver interaktion med ICM. (C, D) TICM metode, hvor injektion nålen ind direkte via ICM i til blastocoel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: graviditetsrate. Graviditetsrate viste ingen signifikant forskel mellem traditionelle (39/50) og TICM (64/76). Gennemsnittet plus standardafvigelsen for middelværdien (SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: overlevelsesraten. Overlevelsesraten er antallet af unger, at overlevet til fravænning, hvor der var et kuld at vænne. Unger, der ikke overlevede til fravænning og kuld hvor ingen hvalpe overlevede til fravænning, indgik ikke i disse data. Gennemsnittet plus standardafvigelsen for middelværdien (SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: kimærisme sats. Disse data repræsenterer kun antallet, hvis kimærer produceret, og omhandler ikke kvaliteten af kimærisme. I den traditionelle gruppe, 31% (34/110) af afkom viste kimærisme, hvor gruppen TICM havde et gennemsnit på 50% (79/158). Gennemsnittet plus standardafvigelsen for middelværdien (SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har længe været tænkt, at enhver forstyrrelse af ICM kunne føre til dødelighed, faktisk nuværende blastocyst mikroinjektion protokoller stadig advare denne12,13. Her har vi vist er der mikroinjektion gennem ICM er ikke skadeligt for fosteret, og øger udbyttet af kimærer.
Den nøjagtige mekanisme for denne effekt er ikke blevet identificeret. Den mekanisk afbrydelse af ICM, og den ledsagende hypoblast, bør imidlertid øge forekomsten af ES celle integration i den nydannede ICM efter mikroinjektion. Seneste arbejde inden for iPSCs har vist, at mekanisk stimulation hjælper i den omprogrammering af menneskelige iPSC14. Hvis mekaniske manipulation har en lignende virkning i ICM mus embryon, kunne det have effekt af regnskabsfoerende celler af ICM, som potentielt begyndte at skelne, tilbage til pluripotente status, at fjerne en potentiel forspring blastocyst donors afledte celler til at danne den embryonale væv. Endelig er det muligt, at injektion gennem ICM resultater i døden for et ukendt antal celler i ICM, sænke konkurrenceniveauet for den microinjected genetisk modificerede ES-celler.
De primære fordele ved denne metode ændring er, at det kræver ingen ny læring, fejlfinding eller udstyr. Alle teknikker fremførsel fra standard blastocyst injektion. De mest kritiske trin også forblive uændret; ordentlig og rettidig indsamling af embryoner, og ordentlig dyrkningsbetingelserne for embryoner før, under og efter injektion. Når du bruger ikke-kirurgiske embryo transfer teknik, bliver det mere kritisk at vælge ordentlig recipient mus. Med kirurgisk overførsler, kirurgen havde mulighed for at undersøge mus for at kontrollere ordentlige reproduktive stat, hvor med ikke-kirurgiske overførsler, dette er ikke muligt. Mus bør være førsteklasses reproduktive alder (6-9 uger) og kun mus med synlige stik bør anvendes. Det vigtigste aspekt af denne teknik, og alle ES celle injektioner, er kvaliteten af ES-celler.
Når beskæftiger sig med høj kvalitet, robust cellelinjer, denne teknik kan give kun minimale forskelle, men med suboptimal ES cellelinjer eller vanskeligt at arbejde med linjer, nogen, selv mindre forbedringer, kan være betydelige og gøre forskellen mellem projektets succes og svigt. Det er også at bemærke, at i løbet af denne undersøgelse, flere kommercielt tilgængelige ES cellelinjer genereret kønscelleoverførsel kimærer, og næsten alle de kommercielle ES linjer, der genereres kønscelleoverførsel kimærer var TICM injektioner. Her har vi vist, at en simpel ændring i teknik kan resultere i en betydelig forbedring i produktiviteten, uden at pådrage sig yderligere omkostninger for nye udstyr, uddannelse eller øge brugen af dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at videregive.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet [del] af murene forskningsprogrammet af NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Særlig tak til Shyamal Peddada for statistisk analyse. Vi vil også gerne takke Humphrey Yao, Gary fugl og Yuki Arao for gennemgang af dette manuskript og Franco DeMayo for hans fortsatte støtte og rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
