Summary
Her presenterer vi en protokoll for å øke chimera produksjon uten bruk av nytt utstyr. En enkel retning endring av embryoet for injeksjon kan øke antall embryo produsert, og potensielt redusere tidslinjen germline overføring.
Abstract
I et forsøk på å øke effektiviteten i etableringen av genmodifiserte mus via ES celle metoder, presenterer vi en tilpasning til gjeldende blastocysten injeksjon protokollen. Her har vi rapportere at en enkel rotasjon av embryoet og injeksjon gjennom Trans-indre cellemasse (TICM) økte andelen chimeric mus fra 31% til 50%, uten ekstra utstyr eller ytterligere spesialisert opplæring. 26 forskjellige innavlede kloner, og 35 totale kloner ble injisert over en periode på ni måneder. Det var ingen signifikant forskjell i svangerskapet rate eller utvinningsgraden av embryo mellom tradisjonelle injeksjon teknikker og TICM. Derfor uten noen store endringer i injeksjon prosessen og en enkel plassering av blastocysten og sprøytebruk gjennom ICM, kan slippe ES celler i blastocoel hulrom potensielt forbedre antallet chimeric produksjon og påfølgende germline overføring.
Introduction
For nesten 25 år er etableringen av genetisk målrettet mus en langsom prosess, ofte hindret av en flaskehals på blastocysts ES celle microinjection scenen for generering av germline overføring av chimeras. Nylige fremskritt, inkludert CRISPR/Cas91,2 målretting i ES celler og høy gjennomstrømming ES celle generasjon konsortier som KOMP, har forbedret generasjon/tilgjengeligheten av genmodifiserte ES celler. Generering av germline chimeras imidlertid en flaskehals i å skape genmodifiserte mus fra ES celler3,4. Høy gjennomstrømming ES celle generasjon prosjekter har vært plaget av høye variasjon i ES celle kvalitet, som er avgjørende for vellykket etablering av germline chimeras. I tillegg er noen av de ofte benyttet ES linjene kjent for høy aneuploidy og vanskelig produksjon germline kompetent chimeras5.
Mange metoder har blitt utviklet for å lage mus med enten en høyere chimera, eller helt ES celle avledet mus,6,,7,,8,,9,,10. Mens hver av disse systemene har egne meritter, har de også sine svakheter. Generasjonen av tetraploid chimeras, mens generere 100% ES celle avledet mus, er ineffektiv, og vanligvis begrenset til outbred linjer 5,6. Nyere metoder sprøytebruk morulastadiet kan gi høy andel chimeras, nærmer seg 100%, men krever vanligvis betydelige ekstra utstyr (lasere eller piezos) og trening10,11. I laboratorier hvor disse teknikkene er allerede på plass, kan denne nye metodikken ikke være nødvendig.
Denne studien mål var å finne en metode som bruker vanlig teknikker og lett tilgjengelig utstyr for å øke frekvensen av chimera generasjon, øke sjansen for germline overføring av det muterte allelet å etablere den påfølgende mus kolonien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle operasjoner ble gjort som en del av normal drift av NIEHS banke ut musen kjernen. Alle mus ble holdt på en 12:12 h lys: mørke syklus, og var en diett av NIH-31 og vann ad lib. Alle eksperimentene ble utført i henhold til Animal Care og bruk komiteen av National Institute of Environmental helse Sciences.
1. dyr forberedelse
- Rase donor mus, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J kvinnelige mus for 8-10 ukens av alderen naturlig til B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J mannlige mus mellom 8 og 26 uker gammel. Sjekk plugger visuelt morgenen (E0.5).
- Rase mottaker mus, sveitsiske Webster kvinnelige mus mellom 6 og 9 ukens av alderen er naturlig oppdrettet til vasectomized sveitsisk Webster mannlige mus. Sjekk plugger visuelt morgenen (E0.5).
2. ES celle forberedelse
- For 129-derieved AB2.2 ES celler, kultur celler i DMEM med 15% FBS, 1% glutamin, 1% Penn/strep og 0,1% β-mercaptoethanol. Kultur alle ES celler per ES celle leverandørens instrukser, bruker sine anbefalte protokoller.
3. embryo samling
-
Dyr disseksjon
- Forbered flere 60 mm retter, ca 1 per 5 mus pluss 3 ekstra, med 10 mL blast samling media (BCM) (10% FBS i DMEM), og en 4 vel rett med 0,5 mL BCM per brønn. Equilibrate ved 37 ° C, 5% CO2.
- Euthanize B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J kvinnelige mus ved E3.5 CO2 kvelning, med en flow rate på 10%.
- Etter euthanizing, plassere musene i supine posisjon og våt magen grundig med 70% etanol.
- Gjør den første snittet gjennom huden, midt i magen, å gjøre åpningen så bredt som mulig. Neste åpne gjennom bukveggen, igjen gjør innsnitt så bredt som mulig.
Merk: Dette i to trinn hjelper redusere eller eliminere pels forurensning. - Starter på en eggstokk og holde fett puten av eggstokkene med sløv tang, fjerne nøye eggstokk, oviduct og livmoren, ta ekstra forsiktighet å holde fettvev til et minimum. Fjerne livmoren som én enkelt enhet, eller som individuelle horn, med ingen endring i fremgangsmåten nedenfor.
- Etter fjerning, plassere livmoren i 60 mm parabol inneholder blast samling media.
-
Fosteret fjerning
- Forberede en 10 mL sprøyte fylt med BCM, og passer med en 25 G nål.
- En livmor gangen, fjerne dem fra holde parabolen av BCM, blot dem på en vev å fjerne overflødig blod og plasser i en 60 mm rett under en lav forstørrelse dissekere mikroskop.
- Mens du forsiktig og forsiktig holder livmoren like nedenfor den klubbeformede enden (nær oviduct) med dissekere tang, setter du inn nålen i midten av livmoren i som parallell et fly som mulig. Sett inn nålen like utenfor tips av tang.
- Bruke litt press på tang å holde livmoren nålen og utvise ca 1 mL av BCM gjennom Hornet av livmor.
Merk: Må være forsiktig på dette trinnet som for mye press på sprøyten vil føre en ukontrollerbar strøm av media, ofte forlater parabolen. - Etter spyling livmoren, opptil 5 hele uteri per 60 mm parabol, plass rett tilbake i inkubator til samlingen.
-
Fosteret samling
- Bruke en hånd trukket glass pipette og en munn pipette apparater, samle blastocysts under en dissecting omfang, 25 X og 35 X. (Figur 1).
Merk: Munnen pipette apparater består av 30-40 cm fleksible rør, under 5 mm ID sett 1, 000 µL pipette tips, Velg først i ene enden og påføre glass Pipetter i den. Legge til en sprøyte-filteret i den andre enden, med en vedlagt 1 cc syringe fat, ingen ventilen for å fungere som en munnstykket. - Fjerne retter settefiskanlegg, og bruke et rutenettmønster undersøke hver eneste del av parabolen for embryoer. Embryo blir plukket opp individuelt og plassere på slipp av BCM i en sekundær form.
- Etter samle fra alle retter, vaske embryoene igjen i en dråpe friskt BCM, og plasser i 4 godt parabolen å avvente injeksjon.
- Bruke en hånd trukket glass pipette og en munn pipette apparater, samle blastocysts under en dissecting omfang, 25 X og 35 X. (Figur 1).
4. embryo injeksjon
- Plukk opp ES celler individuelt med injeksjon nålen basert på bekreftelse.
- Forberede en injeksjon rett ved å legge til 5-7 mL injeksjon media (DMEM, 10% FBS og 20 mM HEPES) til et glass bunn injeksjon rett. Injeksjoner utføres ved romtemperatur.
- Bruker en luft eller olje microinjector, bruke vakuum injeksjon nålen å trekke ES celler i. Pass på å holde så lite plass som mulig mellom celler. Telle ES celler her, eller ved injeksjon trinn.
- Velg ES celler som er små i størrelsen sammenlignet med befolkningen generelt av celler, med en glatt overflate, og uten åpenbare feil som vacuoles medium.
Merk: ES celle populasjoner variere morfologiske kvalitet, og standardene som brukes må justere med dem.
- Injisere embryo med ca 15 ES celler (figur 1).
- Knytte en holde pipette tips til en andre luft-microinjector, og plassere et embryo nær åpningen av abonnenten. Bruke vakuum å sikre embryoet til abonnenten.
- Justere for z-aksen ved å bevege den holder pipette opp eller ned slik at fosteret bare berører lysbildet etterfulgt av fine fokuserer på zona. Deretter Juster Z-aksen for injeksjon nålen slik at ES celler nær spissen er i fokus.
- Juster embryoet nå ved å forsiktig trykke på injeksjon p på toppen eller bunnen, rotere det å sette ICM i ønsket posisjon.
- Sett inn injeksjon nålen gjennom zona, og ICM eller trophoblast, med en fast, men kontrollerte push. Bruk et lett trykk på microinjector injeksjon nålen for å holde blastocoel sammen.
- Når nålen har trengt blastocoel, legge press fra microinjector overføre ES celler til blastocoel av embryoet. Pause kort som skråkant nålen begynner å avslutte embryoet slik at trykket i embryo å gjensyn med normal, stund fremdeles retaining cellene.
Merk: Referanse gruppe ES celler ble injisert normalt, etter en tradisjonell ES celle injeksjon protokollen9, ta vare ikke for å berøre ICM. ES celler ble også injisert gjennom ICM, skyver nålen direkte gjennom den ICM (TICM) (figur 2ekstra film).
5. overføring av eEmbryos
- Overføre embryo til sveitsiske Webster mus på E2.5, bruker en ikke-kirurgisk embryoet overføring enhet, per produsentens prosedyrer. Denne ikke-kirurgiske prosedyren krever ingen anestesi eller post-op forsiktighet. Huset mus individuelt etter overføring av embryo, og gjennom levering og påfølgende avvenning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandle cellen linje som tilfeldig effekten, ble en blandet effekter lineær modell brukt til å analysere dataene i programvaren (f.eks SAS (versjon 9.2)). Hver analyse kontrollert av embryo overført og cellen linje. Andre analysen også kontrollert av pups det overlevde.
For denne studien, hver ES cellen linje og klone ble sprøytet både med tradisjonelle og TICM teknikker, alternerende mellom de to metodene etter hver fosteret. Etter injeksjon, ble embryo segregert på fatet og gruppert etter overføring, vanligvis mellom 12 og 15 embryo hver mottaker kvinnelige. Embryo som ikke har en tydelig blastocoel, manglet en Zona pellucida, eller hvor microinjected ES celler kan ikke angi blastocoel, ble eliminert fra dette eksperimentet.
Første data undersøkt var suksessrate. Som vist i Figur 3, var svangerskap priser uendret i gruppen TICM fra kontrollgruppen. I tillegg en lik andel av pups overlevde til avvenning (P = 0,50, Figur 4). Viktigst, mens antall mus på avvenning forblir uendret, antall pups vise belegge fargen chimerism økt fra 31% til 50% for gruppen TICM (p = 0.005, figur 5). Graden av frakken farge chimerism ble ansett for subjektiv vurderes i denne studien, og ikke virkelig relevant for germline chimerism.
Figur 1: spesialisert utstyr. (Venstre) Injeksjon mikroskop installasjonen, inkludert (A) Micro Manipulators og (B) cellen trikk luft. (Høyre) Munnen pipette apparater, (C) tegnet glass pipette, (D) 1000µL pipette tips, (E) rør, (F) Filter og (G) sprøyte fat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempel på blastocysten embryoet injeksjon. (A, B) Tradisjonelle injeksjon metode, der injeksjon nålen inn overfor av ICM, unngå interaksjon med ICM. (C, D) TICM metode, der injeksjon nålen inn direkte gjennom ICM i å blastocoel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: graviditet raten. Svangerskapet rate viste ingen signifikant forskjell mellom tradisjonelle (39/50) og TICM (64/76). Gjennomsnitt pluss standard feil av gjsnitt (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: overlevelse. Er antall pups det overlevde til avvenning, der var en søppel å avvenne. Pups det ikke overlevde til avvenning og kull der ingen pups overlevde til avvenning, var ikke inkludert i disse dataene. Gjennomsnitt pluss standard feil av gjsnitt (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Chimerism rate. Dataene angir bare nummeret hvis chimeras produsert, og løser ikke kvaliteten på chimerism. I gruppen tradisjonelle 31% (34/110) av den viste chimerism, der gruppen TICM hadde et gjennomsnitt på 50% (79/158). Gjennomsnitt pluss standard feil av gjsnitt (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har lenge vært antatt at forstyrrelser av ICM kan føre til dødelighet, faktisk gjeldende blastocysten microinjection protokoller likevel advarer denne12,13. Hva vi har vist her er at microinjection gjennom ICM er ikke skadelig for fosteret, og øker avkastningen av chimeras.
Den eksakte mekanismen for denne effekten er ikke identifisert. Mekanisk avbrudd i ICM, og den tilhørende hypoblast, bør imidlertid øke forekomsten av ES celle integrering i den nyopprettede ICM etter microinjection. Siste arbeid innen iPSCs har vist at mekanisk stimulering hjelper i omprogrammering av menneskelig iPSC14. Hvis mekanisk manipulasjon har en lignende effekt i ICM av musen embryoet, kunne det ha effekten av retur celler med ICM som hadde potensielt begynt å skille, tilbake til pluripotent status, fjerne en potensiell 'forsprang"av blastocysten donor avledet celler i forming embryonale vevet. Til slutt, er det mulig at injeksjon gjennom ICM resultatene i døden av et ukjent antall celler i ICM, senke nivået av konkurranse for den microinjected genetisk endret ES celler.
De viktigste fordelene med denne metoden endringen er at det krever ingen nye læring, feilsøking, eller utstyr. Alle teknikker bære over fra standard blastocysten injeksjon. De viktigste trinnene også forblir uendret. riktig og rettidig samling av embryo og riktig kultur betingelser for embryo før, under og etter injeksjon. Når du bruker ikke-kirurgisk embryoet overføring teknikken, blir det mer viktig å velge riktig mottaker mus. Kirurgisk overføringer, kirurgen hadde muligheten til å undersøke for å bekrefte riktig reproduktive stat, der med ikke-kirurgisk overføringer, dette er ikke mulig. Mus bør være i førsteklasses reproduktiv alder (6-9 uker) og bare mus med synlige plugger bør brukes. Det viktigste aspektet ved denne teknikken, og alle ES cell injeksjoner, er kvaliteten på ES celler.
Når håndtere høy kvalitet, robust cellelinjer, denne teknikken kan gi bare minimal forskjeller, men med suboptimal ES cellelinjer eller vanskelig å jobbe med linjer, noen enda mindre forbedringer, kan være betydelig og gjøre forskjellen mellom prosjektet suksess og fiasko. Det er også Legg merke at i løpet av denne studien, flere kommersielt tilgjengelig ES cellelinjer generert germline chimeras, og nesten alle kommersielle ES linjene som genererte germline chimeras var TICM injeksjoner. Her har vi vist at en enkel endring i teknikken kan resultere i en betydelig forbedring i produktivitet, uten å pådra seg noen ekstra kostnader for nytt utstyr, opplæring og økt bruk av dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet [delvis] av programmet for Intramural forskning på NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Spesiell takk til Shyamal Peddada for statistisk analyse. Vi ønsker også å takke Humphrey Yao, Gary Bird og Yuki Arao for gjennomgang av dette manuskriptet, og Franco DeMayo for hans støtte og råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
