本文展示了通过植物维管组织口服递送双链RNA（dsRNA）以实现韧皮部汁液取食昆虫RNA干扰（RNAi）的新型技术。
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本文内容
摘要
摘要
韧皮部及植物汁液取食性昆虫通过侵入农作物和果实以获取营养，在此过程中对粮食作物造成损害。半翅目昆虫是一类重要的农业害虫，通过取食韧皮部汁液对作物造成破坏。其中，褐臭蝽（BMSB）， Halyomorpha halys （异翅亚目：蝽科）和亚洲柑橘木虱（ACP）， Diaphorina citri Kuwayama（半翅目：Liviidae）是一类被引入北美的半翅目昆虫害虫，在当地已成为多种高价值经济作物、大田作物、主粮作物以及柑橘类水果的重要入侵性农业害虫；当其在室内聚集时，亦成为令人困扰的滋扰性害虫。由于多种害虫已对杀虫剂产生抗性，促使人们开发替代性的害虫管理策略。双链RNA（dsRNA）介导的RNA干扰（RNAi）是一种用于功能基因组学研究的基因沉默机制，同时具备作为害虫管理工具的应用潜力。外源合成的双链RNA或小干扰RNA（siRNA）可通过降解与之序列同源的内源RNA，引发高效特异的基因沉默。要将RNAi有效且环境友好地应用于半翅目昆虫的生物防治，作为分子生物杀虫剂使用，需要 体内 通过饲喂方式递送dsRNA。本文展示了将dsRNA递送至昆虫的方法：通过浸渍法将dsRNA载入青豆，以及通过口服摄入吸收基因特异性dsRNA。我们还概述了非转基因植物递送策略，包括叶面喷施、根部浇灌、树干注射以及黏土颗粒载体，这些方法均有助于dsRNA的持续释放。经口服摄入递送dsRNA被证实可有效达到剂量要求，显著降低靶基因的表达水平，例如保幼激素酸O-甲基转移酶（JHAMT）和卵黄原蛋白（Vg）。这些创新性方法为利用dsRNA进行作物保护及应对害虫治理中的环境挑战提供了可行策略。 关键词：dsRNA递送，饲喂法，青豆浸渍，口服摄入，叶面喷施，根部浇灌，树干注射，黏土颗粒，非转基因植物，RNA干扰，作物保护，害虫管理
引言
半翅目昆虫因其能够迅速大量繁殖并在植物间传播病害，已成为对农业具有重大经济影响的害虫。褐臭虫（H. halys Stål）是一种入侵性害虫，于1996年首次被报道在宾夕法尼亚州阿伦敦发现，其原产于亚洲（中国、中国台湾、韩国和日本），是意外引入西半球的1。自引入以来，褐臭虫已在43个州被发现，其中以中大西洋地区（特拉华州、马里兰州、宾夕法尼亚州、新泽西州、弗吉尼亚州和西弗吉尼亚州）种群密度最高，同时也在加拿大和欧洲出现，对农业生产构成潜在威胁2。作为一种多食性害虫，褐臭虫可危害约300种已知的寄主植物，包括苹果、葡萄、观赏植物、种子作物、大豆和玉米等高价值作物。其危害主要源于一种称为“刺破并冲洗”的取食方式，即利用针状口器刺入寄主作物，获取维管组织中的营养物质2,3。此外，褐臭虫也是一种室内害虫，在秋季至冬季期间可能进入学校和住宅等生活区域栖息2。研究表明，褐臭虫释放的化学物质和空气传播的过敏原可引发果树作物作业人员的过敏反应，还可能导致敏感个体出现接触性皮炎、结膜炎和鼻炎等过敏性疾病4,5。另一种半翅目昆虫——柑橘木虱（D. cit....
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方案
1. 棒蝽饲养
- 按照标准实验室操作和先前所述方法饲养BMSB昆虫63。
- 在温室（22 °C）和自然光照条件下，以Citrus macrophylla饲养ACP（D. citri）昆虫。使用羽化后约5–7天的成虫ACP。
2. 基因区域的选择与 体外 dsRNA的合成
- 从先前发表的转录组谱中筛选出BMSB特异性基因32.
- 确保所选目标区域在200至500个碱基对之间。
- 使用下述条件对基因组DNA进行聚合酶链式反应（PCR），以扩增目标基因的相关片段。参见 表1 用于基因特异性寡核苷酸。
- PCR反应：在0.25 mL的PCR管中，加入5 µL 10X PCR缓冲液、4 µL dNTP混合液（各2.5 mM）、2 µL DNA模板（50 ng/µL）、引物1和引物2各2.5 µL（10 µM）、0.25 µL DNA聚合酶（5 U/µL），并用无DNase/RNase的水补足至50 µL。
- PCR条件：将PCR反应在95 °C下预变性3 min，随后进行30个循环，每个循环包括98 °C变性10 s、55 °C退火30 s、72 °C延....
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结果
通过喂食法利用植物介导的dsRNA递送在BMSB中的应用 4th 若虫龄期被用于测试基于RNAi技术的分子生物农药对入侵性害虫的防治效果。褐臭虫（BMSBs）利用其针状口器通过一种称为“刺破-冲洗”的机制取食，对农作物造成严重损害。细长的有机青豆， P. vulgaris L. 用于测试是否可递送营养物质或dsRNA 体内 通过摄食对BMSB3将绿豆段浸入无DNase/RNase的水或含绿色食用色素的水溶液中，以检测在BMSB中的递送效果图1A）。绿色食用色素被用作视觉指示剂以模拟双链RNA（dsRNA）。由于绿色染色溶液通过韧皮部的毛细作用流动，导致豇豆的维管组织被绿色食用色素充分浸润。62. 观察到BMSB若虫通过将口针插入青豆的维管组织，取食青豆的豆段（图1B）。在饲喂了浸泡于绿色食用色素中的豆子.......
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讨论
RNAi 已被证明是研究基因生物学功能和调控的重要工具，在害虫管理方面具有巨大应用潜力19,68,69,70,71。针对特定昆虫物种，选择合适的靶基因进行沉默，以及确定相应的dsRNA递送方法，均至关重要。将dsRNA递送至昆虫体内的最佳方法必须通过实验确定，同时需优化递送剂量，因为不同方法可能各自具有优势和局限性。为了开发出最终可用于环境释放的分子生物杀虫剂，必须具备一种可行、高效且具有优势的递送方式。例如，外敷施用dsRNA已被证明在柑橘和葡萄上的昆虫防控中具有良好的递送效果42,44。一些创新策略，如利用饵剂、蔗糖溶液、酵母或细菌生产dsRNA供昆虫直接摄食，将dsRNA外敷喷洒于植物表面，或.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者衷心感谢 Donald Weber 和 Megan Herlihy（美国农业部农业研究局，马里兰州贝尔茨维尔）提供用于实验的BMSB和HB，并负责种群的维持；同时感谢 Maria T. Gonzalez、Salvador P. Lopez（美国农业部农业研究局，佛罗里达州福捷派尔斯）以及 Jackie L. Metz（佛罗里达大学，佛罗里达州福捷派尔斯）在种群维持、样品制备和分析方面所做的工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 褐臭虫（H. halys）昆虫 | USDA | ||
| 柑橘木虱（D. citri）昆虫 | USDA | ||
| 有机青豆 | 不适用 | ||
| 柑橘植株 | USDA | ||
| 次氯酸钠溶液 | J.T. Baker | ||
| 绿色食用色素 | McCormick & Co., Inc | ||
| Thermo Forma 培养箱 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Magenta 培养容器（培养用） | Sigma | ||
| 引物 | IDT DNA | ||
| SensiMix SYBR | Bioline | ||
| qPCR ABI 7500 | Applied Biosystems | ||
| 喷雾瓶 | 不适用 | ||
| 封口膜（Parafilm） | American Can Company | ||
| TaKaRa Ex Taq | Clontech | ||
| QIAquick | Qiagen |
参考文献
- Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
- Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys i....
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重印与许可
