Summary
Het vermogen van menselijke embryonale stamcellen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in alle celtypen van het lichaam, suggereert dat zij een grote belofte voor zowel de medische toepassingen en als een research tool voor het aanpakken van fundamentele vragen bij ontwikkeling en ziekte vast te houden. Hier bieden wij een beknopte, stap-voor-stap protocol voor de winning van menselijke embryonale stamcellen uit embryo's door immunosurgical isolatie van de binnenste celmassa.
Abstract
Het vermogen van menselijke embryonale stamcellen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in alle celtypen van het lichaam, suggereert dat zij een grote belofte voor zowel de medische toepassingen en als een research tool voor het aanpakken van fundamentele vragen bij ontwikkeling en ziekte vast te houden. Hier bieden wij een beknopte, stap-voor-stap protocol voor de winning van menselijke embryonale stamcellen uit embryo's door immunosurgical isolatie van de binnenste celmassa.
Protocol
Ingevroren menselijke embryo's worden gebruikt voor menselijke embryonale stamcellen (hES) cel afleiding werden geschonken voor onderzoek na goed geïnformeerde toestemming onder onderzoeksprotocollen die werden beoordeeld en goedgekeurd door zowel de commissie voor het gebruik van menselijke proefpersonen en het embryonale stamcelonderzoek toezichtscommissie aan de Harvard Universiteit .
Schriftelijk protocol hieronder is gebaseerd op gepubliceerde parameters gerapporteerd door Cowan et al.. 2004, met lichte wijzigingen.
Embryo Cultuur
Dooi menselijke embryo's met behulp van Quinn's Advantage Kit Ontdooi en cultuur in druppels van Global medium aangevuld met 15% Plasmanate tot ontwikkeling aan de uitgebreide blastocyst stadium.
Immunosurgery op basis van isolatie van de binnenste celmassa
Bereiding:
- Bereid je platen voor het verwijderen van de zona pellucida en immunosurgery (zie hieronder) door het opzetten van druppels van elke oplossing in 10cm platen. Overlay met minerale olie om verdamping te voorkomen. Bereid een enkele rij per embryo bedoeld voor afleiding.
- EmbryoMax Zure Tyrodes, te gebruiken zoals het is.
- hES cell afleiding media: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum vervanging, 10% Plasmanate, 2,5% ES-cel-getest foetaal bovine serum (FBS), 2mm Glutamax-I, 1% niet-essentiële aminozuren, 50 eenheden / ml penicilline, streptomycine 50μg/ml, 0.055mM b-mercapto-ethanol, 5ng/ml bFGF.
- Konijn anti-humaan rode bloedcellen primaire antilichaam, gereconstitueerd volgens de fabrikant de suggestie, verdund tot 1:10 met HES cel afleiding media.
- Cavia complement serum, gereconstitueerd volgens de fabrikant de suggestie, verdund tot 1:10 met HES cel afleiding media.
- Evenwicht alle platen tot 37 ° C in weefselkweek incubator voor gebruik.
- Pull 50μl-100μl capillaire pipetten (VWR) voor gebruik in de overdracht van embryo's. Gesneden eindigt met diamant pen en te gebruiken met de mond pipet buis voorzien van een 0.2μm filter.
Immunosurgery Procedure:
Opmerkingen:
- In deze procedure worden cellen van de trophectoderm vernietigd door korte blootstelling aan antilichamen gericht tegen menselijke cellen in combinatie met complement activiteit. Daarom is het protocol werkt het beste met een hoge kwaliteit embryo's met een intact trophectoderm, omdat alleen de structurele integriteit van de blastocyst voorkomt dat de ICM uit ook gevoelig zijn voor de immunologische reactie.
- Alle procedures uitgevoerd met behulp van een dissectie bereik uitgerust met verwarmde podium.
Stappen:
- De mond spoelen pipet om gebruikt te worden voor de embryo transfer met FBS om embryo's te voorkomen plakken.
- Transfer blastocyst van cultuur schotel naar hES houden druppel van AT schotel.
- Begin de procedure door de overdracht van blastocyt van Hes druppel door reeks van AT druppels. In de derde drop, pas op voor ontbinding van de zona pellucida (meestal 5 tot 30 seconden). Wees niet te over-te behandelen of embryo integriteit kan worden aangetast.
- Overdracht door de blastocyst serie van hES cel afleiding media daalt tot af te spoelen AT. Vooraf laden pipet met media is aan te raden om meteen te neutraliseren AT reactie. Blastocysten kan hier worden gehouden totdat alle zijn AT-verwerkt.
- Overdracht blastocyst door reeks primaire antistof druppels, waardoor in de derde dalen gedurende 30 minuten incubatie bij 37 ° C in een weefselkweek incubator.
- Overdracht door de blastocyst serie van hES cel afleiding media valt af te spoelen primair.
- Overdracht blastocyst door reeks van complement druppels, waardoor er in de derde dalen om naar te kijken voor de lysis van trophectoderm cellen. Let op blastocyst voor de eerste 30 seconden op het podium voor "borrelen" van trophectoderm cellen als ze lyseren. Als lysis wordt waargenomen binnen deze termijn, blijven schotel op microscoop podium om de reactie tot aan de voltooiing te controleren. Als er geen borrelende wordt waargenomen tijdens de eerste 30 seconden terug te keren naar incubator, controleren elke 5 minuten tot de meeste van de trophectoderm heeft gelyseerd. Dit kan 5-15 minuten. Monitor reactie nauw samen om de reactietijd en de potentiële schade aan de binnenste celmassa te minimaliseren.
- Overdracht door de blastocyst serie van hES cel afleiding media valt te wassen te vullen activiteit.
- Met behulp van glazen pipet met een diameter die iets kleiner dan de blastocyst (getrokken van 10μl VWR capillaire buizen), trek de blastocyst omhoog en omlaag om ontdoen grootste deel van de gelyseerde trophectoderm.
g "alt =" 574_Figure-0 "width =" 577 "height =" 270 "/> - Plaat ICM isoleren op feeder cellen van mitotisch geïnactiveerd muis embryo fibroblasten (MEFs). MEF moeten worden voorbereid op de dag voor afleiding en is overgeschakeld naar hES cell afleiding media dag van. 4-goed NUNC gerechten werken goed voor de eerste stappen van afleiding.
- Niet storen plaatje voor de eerste 1-2 dagen. Daarna, dagelijks controleren op uitgroei van embryonale stamcellen kolonies (meestal na 1-2 weken zichtbaar). Media moet worden veranderd in half volumes om de andere dag begint op dag 3.
ES-cel uitgroei en passage
Wanneer de hES cel uitgroei heeft ongeveer 0,5 mm of meer bereikt, is het klaar voor de uitbreiding door mechanische plukken.
- Mechanisch verspreiden de helft van de uitgroei en transfer naar nieuwe platen met verse feeders. Embryonale stamcellen groepjes moet worden ongeveer 30-50 cellen per stuk. Laat andere helft van de uitgroei als een back-up voor de eerste passage (p1). De uitgroei (p0) kan worden gekozen uit verschillende periodes, omdat het blijft groeien.
- Secundaire kolonies kunnen op dezelfde manier worden verspreid en uitgebreid over grotere cultuur gerechten tot passages 3-5, op welk moment de nieuwe cellijnen kunnen worden aangepast aan enzymatische passage met trypsine. Het serum gehalte van de cultuur media moeten ook geleidelijk worden verlaagd tot 1% en 0% tijdens deze eerste passages te ES celdifferentiatie te minimaliseren.
- Alle gevestigde embryonale stamcellijnen moet worden dwarshelling van bevriezing van een deel van de vroege passages voor toekomstige uitbreidingen.
- Daarnaast moet elke cellijn worden gekenmerkt door karyotype analyse en gevalideerd door pluripotentie en differentiatie studies in vitro en in vivo.
Discussion
Het protocol hier gepresenteerde biedt onderzoekers met een beknopte, gemakkelijk te volgen schets van hoe je afleiden menselijke embryonale stamcellijnen door immunosurgical isolatie van de binnenste celmassa.
Acknowledgments
AEC is een fellow van de Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research en Merck Research Laboratories. Wij danken D. Egli en C. Cowan voor experimentele advies en discussie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global medium | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| ES cell-tested fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Recombinant human basic fibroblast growth factor | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| Rabbit anti-human red blood cell primary antibody | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Guinea-pig complement serum | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes | VWR international | ||
| Mouth pipettes with tubing | VWR international | supplied with capillary pipettes from VWR | |
| 0.2 microm Acrodisc syringe filter | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tissue culture dishes | VWR international | ||
| Tissue culture dishes | Nalge Nunc international | ||
| Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (E12.5) |
References
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
