Summary
自己複製能と身体のあらゆる細胞タイプに分化するヒト胚性幹細胞の能力には、両方の医療アプリケーション用の開発や病気の根本的な問題に対処するための研究ツールとして有望視されて保持することを示唆している。ここでは、内部細胞塊のimmunosurgicalの分離による胚からのヒト胚性幹細胞の派生のための簡潔な、ステップバイステップのプロトコルを提供しています。
Abstract
自己複製能と身体のあらゆる細胞タイプに分化するヒト胚性幹細胞の能力には、両方の医療アプリケーション用の開発や病気の根本的な問題に対処するための研究ツールとして有望視されて保持することを示唆している。ここでは、内部細胞塊のimmunosurgicalの分離による胚からのヒト胚性幹細胞の派生のための簡潔な、ステップバイステップのプロトコルを提供しています。
Protocol
ヒト胚性幹（HES）のセルの導出に使用する凍結ヒト胚は、ハーバード大学でヒト被験者の利用に関する委員会や胚性幹細胞研究の監督委員会の両方による確認と承認された研究のプロトコールの下で適切なインフォームドコンセントは、次の研究のために寄付されました。
以下の書面によるプロトコルは、コーワンらによって報告された公開パラメータに基づいています。 2004年、わずかな修正を加えた。
胚培養
拡張胚盤胞期への発展まで、15％のPlasmanateを補充グローバル培地のドロップにクインのアドバンテージ融解キットとカルチャを使用して、ヒトの胚を融解する。
内部細胞塊の免疫手術ベースの分離
準備：
- 10cmのプレートに各溶液の滴を設定することによって、透明帯と免疫手術の除去（下記参照）のためのプレートを準備します。蒸発を防ぐためにミネラルオイルを重層する。導出を目的とした胚ごとに単一行を準備します。
- EmbryoMax酸性Tyrodesは、そのまま使用してください。
- hES細胞の導出メディア：75％KO - DMEM、10％KO -血清代替、10％のPlasmanate、2.5％ES細胞テスト済みウシ胎児血清（FBS）、2mMのグルタミン- I、1％非必須アミノ酸、50ユニット/ mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、0.055mMβ-メルカプトエタノール、5ng/ml bFGFを。
- ウサギ抗ヒト赤血球一次抗体は、ヒトES細胞の派生のメディアで1:10に希釈し、メーカーの提案にしたがって再構成。
- モルモット補体血清は、ヒトES細胞の派生のメディアで1:10に希釈し、メーカーの提案にしたがって再構成。
- ℃の組織培養インキュベーターで使用する前に、37に、すべてのプレートを平衡化させます。
- 転送する胚の使用のために50μlの-100μlのキャピラリーピペット（VWR）を引き出します。ダイヤモンドのペンと0.2μmのフィルターを装備した口のピペットチューブでの使用で端をカット。
免疫手術の手順：
注意事項：
- この手順では、栄養外胚葉の細胞が補体活性と並行してヒト細胞に対する抗体の短期間の暴露によって破壊されています。胚盤胞の唯一の構造的な整合性は、免疫学的反応への影響を受けているからICMを防ぐしたがって、プロトコルは、無傷の栄養外胚葉と高品質の胚に最適です。
- すべての手順は、加熱ステージを装備した解剖スコープを使用して実行。
手順：
- くっつくの胚を防ぐためにFBSを持つ胚移植に使用される口のピペットをすすぐ。
- 培養皿から皿ATのヒトES保持ドロップに胚盤胞を転送します。
- 滴ATシリーズのを介してヒトESドロップダウンリストから胚盤胞を転送することで手順を開始します。 3番目のドロップでは、透明帯（通常は5〜30秒）の解散を監視します。ではない過剰治療や胚の整合性に注意してください損なわれる可能性があります。
- hES細胞の派生のメディアのシリーズを通じて、転送胚盤胞は、AT洗い流しますに低下します。メディアとのプリロードピペットは、即座に反応、AT中和することをお勧めします。すべてが、AT -処理されるまで、胚盤胞は、ここで開催することができます。
- 37インキュベーションの30分間3番目のドロップ°組織培養インキュベーターでCに残し、一次抗体の滴の一連の胚盤胞を転送します。
- hES細胞の派生のメディアのシリーズを通じて、転送胚盤胞は、プライマリをオフリンスに低下します。
- 栄養外胚葉細胞の溶解を監視するために3番目のドロップに残して、補液滴の一連の胚盤胞を転送します。彼らは溶解と栄養外胚葉細胞の"バブリング"の舞台での最初の30秒間、胚盤胞を観察。溶解がこの時間枠内で観察された場合、完了するまで反応を監視するために顕微鏡のステージ上で料理をしてください。何泡立ちが最初の30秒の間に観察されていない場合は、栄養外胚葉のほとんどが溶解するまで5分ごとにチェック、インキュベーターに戻す。これは5〜15分かかることがあります。反応時間と内部細胞塊への潜在的な被害を最小限に抑えるために密接に反応を監視する。
- hES細胞の派生のメディアのシリーズを通じて、転送胚盤胞は、補体活性を洗い落とすに低下します。
- （10μlのVWRキャピラリーチューブからプル）胚盤胞よりわずかに小さい直径のガラスピペットを用いて、溶解した栄養外胚葉のほとんどを離れて除去するには、上下の胚盤胞を描く。
G"ALT ="574_Figure - 0"幅="577"高さ="270"/> - プレートICMは、有糸分裂不活化マウス胚繊維芽細胞（MEF）のフィーダー細胞上に隔離する。 MEFは導出前日の準備とのhES細胞の派生のメディアデーに切り替える必要があります。 4ウェルNUNC料理は、導出の最初のステップに適しています。
- 第一1〜2日のためのプレートを邪魔しないでください。その後、胚性幹細胞のコロニー（通常見かけ1-2週間以内）の伸長のために毎日確認してください。メディアは3日目の初めおきに半日ボリュームに変更する必要があります。
ES細胞の伸長や継代
hES細胞の伸長が約0.5mm以上に達したとき、それは機械摘みによる膨張のための準備ができています。
- 機械的に伸長の半分を分散し、新鮮な餌を含む新しいプレートに移す。胚性幹細胞塊は約30〜50セルごとにする必要があります。バックアップ初通過（P1）用として、伸長の残りの半分を残す。それは拡大し続けて伸長（P0）は、数回から選択できる。
- 二次コロニーも同様に分散させ、新しい細胞株は、酵素トリプシンで継代に適応することができる時に通路3-5まで大きな培養皿全体に拡張することができます。培地の血清含有量も徐々にES細胞の分化を最小限に抑えるためにこれらの初期継代の間に1％、0％に軽減する必要があります。
- すべての確立された胚性幹細胞株は、将来の拡張のための初期の通路の部分を下に凍結するバンクレジスタすべきである。
- さらに、各細胞株は、核型分析によって特徴付けされるべきであり、in vitroおよび in vivo における分化能と分化の研究によって検証。
Discussion
ここで紹介するプロトコルは、内部細胞塊のimmunosurgicalの分離により、ヒト胚性幹細胞株を導出する方法を簡潔に、わかりやすい概要を研究者に提供します。
Acknowledgments
AECは、医学研究とメルク研究所のためのジェーン棺チャイルズメモリアル基金の仲間です。我々は実験的なアドバイスや議論のためにD.エグリとC. Cowanさんに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global medium | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| ES cell-tested fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Recombinant human basic fibroblast growth factor | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| Rabbit anti-human red blood cell primary antibody | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Guinea-pig complement serum | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes | VWR international | ||
| Mouth pipettes with tubing | VWR international | supplied with capillary pipettes from VWR | |
| 0.2 microm Acrodisc syringe filter | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tissue culture dishes | VWR international | ||
| Tissue culture dishes | Nalge Nunc international | ||
| Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (E12.5) |
References
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
