Summary
Iones del potasio contribuyen al reclinación potencial de la membrana de las células y la concentración extracelular de K+ es un regulador crucial de excitabilidad celular. Describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K+-microelectrodos selectivos. Uso de tales electrodos permite la medición de la dinámica de concentración de K+ eléctricamente evocado en rebanadas de hipocampales adulto.
Abstract
Los iones de potasio contribuyen significativamente al reclinación potencial de la membrana de las células y, por tanto, la concentración extracelular de K+ es un regulador crucial de la excitabilidad de la célula. Altera las concentraciones de efecto extracelular de K+ la excitabilidad celular y potencial de membrana reposo cambiando los equilibrios entre los Estados cerrados y abiertos inactivados para canales voltaje-dependientes del ion que subyacen a potencial de acción iniciación y conducción. Por lo tanto, es valiosa para medir directamente la dinámica extracelular de K+ en salud y los Estados enfermos. Aquí, describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K+-microelectrodos selectivos. Les implantamos en rebanadas de cerebro hipocampo adulto para medir eléctricamente evocado dinámica de concentración de K+ . El uso juicioso de estos electrodos es una parte importante de las herramientas necesarias para evaluar los mecanismos celulares y biofísicos que controlan las concentraciones extracelulares de K+ en el sistema nervioso.
Introduction
Las concentraciones de iones de potasio están estrictamente reguladas en el cerebro, y sus fluctuaciones ejercen una poderosa influencia sobre el potencial de membrana en reposo de todas las células. A la luz de estos aportes críticos, un objetivo importante de la biología es determinar los mecanismos celulares y biofísicos que se utilizan para regular estrechamente la concentración de K+ en el espacio extracelular en diferentes órganos del cuerpo1 , 2. un requisito importante en estos estudios es la capacidad de medir con precisión las concentraciones de K+ . Aunque muchos componentes que contribuyen a la homeostasis del potasio en el cerebro en Estados sanos y enfermos se han identificado3,4,5, más progreso ha sido más lento debido a la naturaleza especializada de preparación de microelectrodos selectivos de iones para la medición de potasio. Sensores de microelectrodo representan el estándar de oro para la medición de K+ concentraciones en vitro, en rebanadas de tejido y en vivo.
Nuevos enfoques para K+ control están bajo desarrollo de sensores ópticos, sin embargo estos no detectan una concentraciones biológicamente relevante rango de K+ o han no sido completamente validados en los sistemas biológicos, aunque los resultados iniciales parece prometedor6,7,8. En comparación con sensores ópticos, microelectrodos son fundamentalmente limitadas a una medición puntual de iones, aunque arreglos de electrodos podrían mejorar la resolución espacial9. Este artículo se centra en los sensores de microelectrodo sola-barreled para el monitoreo de la dinámica de K+ .
En este trabajo, nos informe los procedimientos detallados paso a paso para hacer K+ microelectrodos selectivos, usar un ionóforo valinomycin basado en potasio que permite altamente selectiva (104 veces K+ a selectividad Na+ ) K+ movimiento sobre membranas10. Un polipéptido natural, valinomycin actúa como un poro permeable de K+ y facilita el flujo de K+ hacia abajo de su gradiente electroquímico. También describimos cómo calibrar los electrodos, cómo almacenar y utilizarlos y, finalmente, cómo implementar para medir la dinámica de concentración de K+ en rebanadas agudo cerebro hipocampo de ratones adultos. El uso de tales electrodos junto con ratones modificados genéticamente que carecen de canales iónicos específicos de propuestas para regular la dinámica de K+ extracelular debe revelar los mecanismos celulares utilizados por el sistema nervioso para el control de la concentración ambiental de K + en el medio extracelular.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de investigación Animal del Canciller de la Universidad de California, Los Ángeles. Todos los ratones estaban alojados con disposición comida y agua ad libitum en un entorno de luz-oscuridad de 12 h. Todos los animales estaban sanos sin cambios de conducta evidentes, no participaron en los estudios anteriores y fueron sacrificados durante el ciclo de luz. Se recolectaron datos de experimentos de ratones adultos (6-8 semanas para todos los experimentos).
1. preparación de microelectrodos selectivos K+
- Silanización del vidrio de borosilicate
- Retire suficiente Capillares de vidrio de embalaje y coloque en un tubo cónico de 50 mL. Llene el tubo cónico hacia arriba con electrodos de 1 M HCl. lavado con agitación suave ácido clorhídrico durante la noche o por un mínimo de 6 horas.
- Enjuague los tubos capilares con etanol al 70% y séquelo completamente a 100-120 ° C durante 6-8 horas. Almacene lavados capilares en envases con desecante sulfato de calcio anhidro para hasta 4 semanas antes de su uso posterior.
- Antes de silanización, tire los capilares a una punta fina usando un extractor de microelectrodos. Los microelectrodos que utilizamos son aproximadamente 2-5 micras de diámetro. Manipule siempre lavados capilares con guantes, como los aceites de la piel pueden interferir con silanización.
- Colocar microelectrodos en un recipiente de vidrio para que los electrodos se elevan de la parte inferior para evitar la rotura de la punta. Fijar los microelectrodos al contenedor usando cinta de autoclave o similar cinta adhesiva.
- Retire aproximadamente 0,5 mL de solución de silanización de Diclorodimetilsilano 5% (DDS) de su envase usando el método de sustitución del nitrógeno (ver figura 2). Llenar un globo con gas nitrógeno y coloque una jeringa o tubo y aguja en el globo. Inserte la aguja en el recipiente DDS mientras elaboración de DDS en una jeringa separada a través de una aguja más larga.
- Aplique la solución de silanización gota a gota a las puntas de las pipetas y cubrir inmediatamente. Coloque el recipiente con los microelectrodos con solución de silanización en un horno de laboratorio (170-180 ° C) precalentado durante 10-12 horas o a 200-220 ° C durante 30 minutos
- Después de la incubación, apague el horno y luego retire la placa del horno. Tenga cuidado al retirar la placa de la incubadora, ya que es muy caliente. Coloque la placa en un banco a temperatura ambiente durante 10-15 minutos para permitir que el vidrio se enfríe.
- Quite los microelectrodos de la placa (usando una hoja de afeitar u hoja de bisturí para cortar la cinta) y colocarlos en un recipiente hermético relleno desecante. Silanizada microelectrodos mantenidas libres de humedad se pueden utilizar hasta 1 semana después de silanización.
- Cebado de los electrodos
- Preparar una solución madre de K+ ionóforo cóctel: valinomycin w/v de 5%, 93% v/v 1, 2-dimetil-3-nitrobenceno, potasio 2% w/v tetrakis(4-chlorophenyl) borato11. Esta solución tiene un color amarillo débil. Mantener en un recipiente hermético, opaco a temperatura ambiente. Si se almacena correctamente esta solución puede durar muchos meses.
- Preparar una solución stock de 10 mM HEPES tamponado con 300 mM de NaCl a pH 7.4. Fijar el electrodo en una abrazadera y rellene con el NaCl tamponada usando una punta de microfil 28G conectada a una jeringa. Observar que la solución salina ha llegado al final de la punta del microelectrodo. Confirmar que el microelectrodo está libre de grandes burbujas que podrían interferir con el flujo de corriente.
- Romper la punta del electrodo a aproximadamente 10-20 μm de ancho, usando el lado Romo de un bisturí o una cuchilla de afeitar.
- Usando una micropipeta, aplique una pequeña gota (~0.1 μl) del ionóforo K+ cerca de la punta del microelectrodo. Si el electrodo ha sido correctamente silanizada que será absorbida en la gota en la punta rota. Llenar el electrodo 1-2 mm con el ionóforo K+ y quitar exceso con papel de seda.
2. calibración de microelectrodos selectivos K+
- Preparación de soluciones de calibración
- Preparar soluciones de diferentes concentraciones de KCl en igual osmolaridad del líquido cerebroespinal artificial (ACSF) sustituyendo la NaCl con KCl. Usamos 0.1, 1, 4,5, 10 y 100 mM K+ ACSF, para la calibración de los electrodos. Las recetas de estas soluciones de calibración se enumeran en la tabla 1.
| Producto químico | MW | final mM | 0,1 mM [K +] | 1 mM [K +] | 4.5 mM [K +] | 10 mM [K +] | 100 mM [K +] |
| (g / mol) | |||||||
| NaCl | 58.44 | varía | 1,51 g | 1.50 g | 1,44 g | 1,4 g | 0,345 g |
| KCl | Stock de 1 M | varía | 20 μl | 200 μL | 900 μl | 2 ml | 20 ml |
| CaCl2 | Stock de 1 M | 2 | 400 μL | ||||
| MgCl2 | Stock de 1 M | 1 | 200 μL | ||||
| NaH2PO4 | 119.98 | 1.2 | 0,29 g | ||||
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | g 0,437 | ||||
| D-glucosa | 180.16 | 10 | 0,360 g | ||||
| Agua | c.s.p. 200 ml | ||||||
Tabla 1. Soluciones de calibración de potasio
- Calibración del microelectrodo
- La burbuja de todas las soluciones con 95% O25% CO2 para al menos 20 minutos antes de comenzar el experimento. Comenzar inunda el baño con 4,5 mM [K+] ACSF a razón de 3 mL por minuto. Coloque el electrodo selectivo de K+ en sostenedor de electrodos conectado a lo headstage de electrodo en el manipulador. Este headstage está conectado a un amplificador adecuado. Inserte la punta del electrodo en la solución del baño.
- Asegúrese de que el electrodo de tierra de Ag/AgCl se baña en la misma solución y que el flujo es constante. Aplicar soluciones de calibración de manera gradual y registrar los cambios de potencial en mV a través de la punta del electrodo. Espere a que el potencial en la punta del electrodo alcanzar un valor estable antes de pasar a la siguiente solución
- Medir el cambio de voltaje de estado estable en respuesta a la aplicación de las soluciones de calibración a la punta del electrodo. Confirmar que la pendiente de la respuesta del electrodo es por lo menos 52 y no mayor de 58 mV por cambio de registro en [K+].
3. preparación de rebanadas cerebrales hipocampo agudas
- Preparación de soluciones de corte
- Preparar sacarosa 500 mL corte solución compuesto de: sacarosa de 194 mM, 30 mM NaCl, KCl, 10 mM D-glucosa, 1 mM MgCl2de 4.5 mM, 1,2 mM NaH2PO4y 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, saturado con 95% O2 y 5% CO2.
- Preparar 1-2 litros de solución de grabación (ACSF) compuesto por: 124 mM NaCl 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4y 26 mM NaHCO3; pH 7.3-7.4 (después de burbujeo), 290-300 mOsm, saturado con 95% O2 y 5% CO2. Llenar un vaso de precipitados que contiene una cámara de soporte de rebanada de cerebro con solución de grabación y mantener a 32-34 ° C. Llene la cámara vibratome con granizado de agua de hielo.
- Preparación de rebanada aguda
- Anestesiar profundamente un ratón colocándolo en una campana de cristal precargado con isoflurano 2-3 mL. Compruebe para reflejo de pellizco del dedo del pie y si no responde, rápidamente decapitar con un par de tijeras afiladas o guillotina como su protocolo animal requiere.
- Haga una incisión de 2-3 cm con tijeras de la porción caudal del cráneo para cortar el cuero cabelludo a lo largo de la línea media. Mientras retrae manualmente el cuero cabelludo, hacer las incisiones horizontales dos de 1 cm de la botella doble de agujero a lo largo de los lados del cráneo. Entonces, con tijeras finas, corte una incisión la longitud del cráneo, a lo largo de la línea media de la parte posterior del cráneo a la nariz.
- Con unas pinzas finas insertadas cerca de la línea media, retraiga el cráneo Incisa en dos porciones. Extraer el cerebro del ratón del cráneo y utilice una cuchilla para eliminar el cerebelo y los bulbos olfativos, que se encuentran respectivamente en las porciones caudales y rostrales del cerebro. Estas pueden identificarse por las grandes fisuras, que los separan de la corteza.
- Monte el bloque de cerebro en la bandeja de vibratome con pegamento. Llene la bandeja de vibratome con solución de corte de helado.
- Cortar secciones de tejido en el plano coronal en 300 μm de grosor. Generalmente se pueden recoger 6 rebanadas hippocampal coronales.
- Después de cada sección, es inmediatamente transferir las rebanadas a la rebanada con vaso de calentado a 32-34° C. Mantener las secciones en esta temperatura durante 20 minutos antes de retirar el vaso que contiene las secciones y colóquelo a temperatura ambiente durante al menos 20-30 minutos antes de la grabación.
4. medición de la dinámica de K eléctricamente evocados+
- Configuración de la preparación de la rebanada
- Coloque con cuidado el trozo de cerebro en el baño con una pipeta Pasteur y manténgalo suavemente en su lugar con un platino arpa con cuerdas de nylon.
- Asegúrese de que las puntas del electrodo de estimulación bipolar son paralelas uno al otro y son de nivel con el plano de la rebanada. Lentamente, a lo largo de 6-7 segundos, introducir los electrodos en CA3 estrato radiatum aproximadamente 40-50 μm profundo para estimular collaterals de Schaffer. En las secciones coronales, CA3 pueden identificarse aproximadamente como la porción del lateral hipocampo apropiado a la capa de células del gránulo en la rodilla del hipocampo, con el estrato radiatum caer medial y ventral a la capa de células piramidales.
- Inserte con cuidado el K+-Electrodo selectivo en CA1 estrato radiatum aproximadamente 50 μm profundamente, bajando lentamente el electrodo durante aproximadamente 3-4 segundos. Permita que el potencial de estabilizar a través de los electrodos antes de aplicar estímulos para el sector: esto toma generalmente 5 a 10 minutos. Si el segmento muestra espontánea cambios en K extracelular+ entonces descartarán y repetición este proceso con un nuevo sector.
- Medida evoca la liberación de K+
- Aplicar trenes de estímulo eléctrico (8 pulsos) presionando manualmente el gatillo en el estimulador durante la grabación digital de las respuestas. Aplicar la estimulación a 10 Hz y 1 ms de pulso ancho, desde amplitud de estímulo de 10 μA.
- Aplicar cada vez mayor amplitud de estimulación por un factor de 2 hasta que se detecta una amplitud máxima de respuesta K+ . Si no ves respuesta, mover la posición del electrodo K+ más cerca al sitio de estimulación en 100 μm en incrementos de
- Determinar la amplitud del estímulo que produce la respuesta máxima media. En nuestra experiencia, esto es entre 40-160 mA, dependiendo de la calidad de la preparación, edad del animal y la distancia entre electrodos de estimulación y el electrodo selectivo de K+ .
- En el mismo segmento, usando una amplitud de estímulo en un paso inferior a la amplitud que produce el medio respuesta máxima (por ejemplo, si 80 μA produce una respuesta de máximo de la mitad, usar 40 μA) aplicar trenes de estímulo de cada vez mayor número de pulsos. Inicialmente, hemos utilizado los trenes de pulsos de 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 y 128.
- Para confirmar que las señales K+ son mediadas por el disparo del potencial de acción de la bañera de collaterals de Schaffer eléctricamente estimulado, aplicar 0,5 μm TTX en ACSF durante 10 minutos y repetir el protocolo de estimulación. No las respuestas evocadas se deben observar.
- Después de terminar el experimento slice, confirmar el electrodo ha mantenido su respuesta por volver a calibrar el electrodo en las soluciones de calibración y garantizando la respuesta no se ha desviado en más del 10% de la calibración inicial
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Representative Results
Para la medida selectiva del K extracelular+, preparamos microelectrodos selectivos recubiertas con una capa hidrofóbica a través de silanización de pipetas de vidrio de borosilicato limpio (figura 1A). Esta capa permite el ionóforo K+ que contiene valinomycin para descansar en la punta del electrodo y permitir solo K+ de flujo a través de una abertura estrecha en la punta del electrodo (figura 1B). Después de cebar los electrodos con una solución salina rellenados y el ionóforo de K+ , los electrodos pueden ser probados por su respuesta rápida y lineal paso a paso cambios en las concentraciones de K+ de baño (Figura 3A) y por su respuesta a baño K+ cambios en el rango de calibración (figura 3B) en solución salina o ACSF de manera predicha por la ecuación de Nernst2. El cambio en el potencial de estado estacionario se puede trazar contra el baño K+ concentración para determinar la pendiente de la línea, que debe ser aproximadamente 58,2 mV por log [K+], según la ecuación de Nernst y nada menos que 52 mV por log [K+] (figura 3). Además probamos la capacidad de respuesta de los electrodos selectivos de K+ y encontró que respondieron a un cambio de 5.5 mM en K+ con constantes de tiempo de auge y decadencia de aproximadamente 85 ms (figura 3D,E).
La plataforma de grabación electrofisiológica consta de un microscopio vertical estándar conectado a una pantalla de LCD para identificar la colocación de los estimulantes y los electrodos de la grabación. No hay óptica especial son necesarios para la colocación visual de la K+ y electrodos de estimulación; Utilizamos un 5 x o 10 x objetivo y luz blanca de una bombilla halógena, pero podría utilizar un LED blanco. El electrodo de estimulación está conectado a la salida de un aislador de estímulo, que produce despolarización actual a través de la entrega programada de pulsos de un estimulador o el otro tal dispositivo de sincronización. En otras palabras, el estimulador ofrece trenes de 2 V, 10-20 Hz pulsos de sincronización para el aislador del estímulo. Al recibir estos pulsos, el aislador de estímulo entrega la corriente deseada para los electrodos de estimulación. El electrodo de registro está conectado con un sostenedor de electrodos, conectado a un headstage, amplificador y Junta de A/D, que interface a un PC con software de grabación electrofisiológica (Figura 4A). Después de que el electrodo se ha calibrado correctamente y se han preparado las rebanadas agudas, la rebanada se puede colocar en la solución de la ACSF. Para estimular los collaterals de Schaffer, K+-Electrodo selectivo se coloca dentro de la CA1 estrato radiatum y se coloca el electrodo de estimulación de campo dentro de la CA3 (Figura 4B).
Una vez se hayan colocado los electrodos y la grabación K+ ha alcanzado una base estable, entonces impulsos de creciente amplitud actual pueden aplicarse a la rebanada (figura 5, arriba). La forma de onda de esta actividad aparece como un rápido incremento en K+ con una tasa de decaimiento exponencial, que se suprime con la aplicación de la TTX (figura 5, abajo).
Figura 1 : Diagrama de reacción de silanización y arquitectura de microelectrodos selectivos de K+ . A. representación esquemática de la reacción de silanización que ocurre entre los grupos del oxhidrilo polar expuesta del vidrio borosilicato y el Diclorodimetilsilano reactivo de silanización (DDS). Esta reacción hace que la superficie del vidrio hidrofóbico, que permite que el ionóforo K+ formar una delgada membrana. B. diagrama de los microelectrodos selectivos de K+ . El electrodo está rellenados con solución salina y la solución selectiva de K+ es el lugar en una capa gruesa de 1-2 mm en la punta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Diagrama de extracción de CD. Representación esquemática del procedimiento de recambio de nitrógeno para extracción de DDS de un contenedor. Es volátil e inflamable y puede reaccionar violentamente con gases atmosféricos cuando se encuentra en altas concentraciones por lo tanto es necesario sustituir el DDS con gas nitrógeno inerte. Un globo llenado de nitrógeno está conectado a una aguja mediante una jeringa o tubo apropiado. Esta aguja se inserta a través del sellador en el envase que permite flujo de nitrógeno gas (N2) en el recipiente. Por separado, una aguja larga (3-10 cm) está conectada a una jeringa de 1 mL e insertada en el contenedor. Esta jeringa se utiliza para extraer DDS, mientras que el nitrógeno sólo puede entrar en el contenedor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Calibración de microelectrodos. A. baño perfusión aplicación de diferentes concentraciones de K+ en solución salina puede rápida y reversiblemente producir Nernstiana cambios en el potencial a través de la punta del electrodo. B. aplicación paso a paso de K+ en ACSF evoca un cambio en el potencial de electrodo punta característica y estable. C. parcela del cambio mV del electrodo selectivo de K+ en respuesta al aumento de las concentraciones de K+ en cuatro electrodos; el R2 es 0.9995 para estos cuatro electrodos. D. Perfusión rápida sistema baño aplicación de 10 mM K+ provoca una respuesta de paso de voltaje a través de la punta del electrodo selectivo K+ . E. diagrama de la respuesta medida veces (tau en ms); no se detectó ninguna diferencia entre el tiempo de auge y decadencia (media ± SEM, p = 0.939, dos muestras t-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Aparato para la medición de K+ extracelular. A. el aparejo de electrofisiología consiste en un microscopio fijado en una tabla de la vibración con una cámara adjunta y pantalla LCD para visualización de rebanada. Se fija el electrodo K+ headstage, amplificador y análogo al tablero digital que la señal de un PC conectado con software de grabación electrofisiológica. Los electrodos de estimulación eléctrica se conectan a un aislador de estímulo que varía la amplitud de estimulación y un estimulador para la entrega de estímulos de sincronización. B. diagrama de la preparación de la rebanada y la ubicación de la colocación de los electrodos distintos en el segmento. CA3 pueden identificarse aproximadamente como la porción del lateral hipocampo apropiado a la capa de células del gránulo en la rodilla del hipocampo, con el estrato radiatum caer rostral a la capa de células piramidales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Medición de eléctricamente evocado versión K+ . Vestigios representativos de K+ liberan el electrodo de la grabación en condiciones basales (arriba) y su pérdida en la aplicación del tetrodotoxin (0.25 μm) durante 5 minutos antes de la grabación (parte inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método que Describimos aquí nos ha permitido evaluar la dinámica de K+ en respuesta a la estimulación eléctrica de collaterals de Schaffer en rebanadas hippocampal agudas de ratones adultos. Nuestro método de preparación K+ de microelectrodos selectivos de ion es similar al anteriormente descrito procedimientos12,13,14,15. Sin embargo, este método tiene ventajas sobre configuraciones de electrodo alternativa porque es rápido y sencillo preparar microelectrodos selectivos K+ . Después de la calibración adecuada, estos electrodos fueron encontrados para medir eficacia dinámica K+ en rebanadas durante la estimulación eléctrica, y estas respuestas fueron bloqueadas por TTX. En estos experimentos, se utilizaron estímulos de 80-160 uA a 10 Hz; sin embargo, optimización de condiciones de estimulación para un experimento determinado y para un área del cerebro de interés será necesario. Estos valores aparecen como una guía.
La pendiente de la respuesta de los electrodos debe ser 58.2 mV por log [K+]. Dicho valor se prevé de las ecuaciones de Nernst y Nicolsky-Eisenman para una membrana semipermeable selectiva K+ ; el último mejor representa las interacciones entre iones16. Si el electrodo no responde de la manera prevista, esta podría ser una de dos razones principales. En primer lugar la silanización podría ser inadecuada, haciendo que la membrana puentes perdidos o sal a la forma de ser. Confirmar que la membrana está intacta por la observación con el microscopio, debe existir una interfaz clara entre la solución de la pipeta y la membrana. Otra razón, podría ser la presencia de burbujas en la pipeta que impiden el flujo de corriente desde el cable del cloruro de plata. Si se observan burbujas, luego retire la pipeta y flick vigorosamente para eliminarlos. Si estas soluciones no, volver a hacer otro electrodo selectivo de K+ o repetir silanización para ya o a temperaturas más altas. Sin embargo, es importante repetir estos controles claves cada vez que se estudia una región del cerebro nuevo o se prueba un microelectrodo nuevo.
Dos amplificadores específicos fueron utilizados en estos experimentos, pero otros amplificadores podrían utilizarse siempre y cuando la impedancia de entrada es mayor o igual a 500 MΩ. Después de haber calibrado los electrodos con MΩ 500 y 5 impedancias de entrada de GΩ, encontramos que no hubo diferencias en la pendiente de la respuesta de la tensión con cualquier valor sobre una gama de K+ concentraciones (56,9 ± 0,7 y 56,5 ± 0.9 mV por cambio diez veces en [K+ < / C1 >] para MΩ 500 y 5 GΩ entrada impedancia, respectivamente; P = 0.759, junto t-test, n = 4 electrodos).
También utilizamos interruptores de solución rápida para estimar el tiempo de respuesta de los electrodos a un conocido salto en [K+] de 4.5 a 10 mM (figura 3D). Los electrodos respondieron con tiempos de subida y la decadencia (tau) de 85 12 y 85 ± 15 ms, respectivamente. A este respecto, la cinética de intercambio de solución para nuestro switcher personalizada solución rápida fue de 85 ± 27 Sra. por lo tanto, los electrodos selectivos de K+ responden con cinética tan rápido como el conmutador de solución empleamos y mucho más rápido que la dinámica de K+ el medio extracelular como resultado de estimulación colateral de Schaffer (figura 5). Estos datos sugieren que electrodos selectivos K+ pueden usarse para estimar la cinética de acumulación de K+ y espacio libre en el tejido cerebral. Sin embargo, en un futuro trabajo adecuados controles y calibraciones serán necesario caso por caso. Sugerimos que es valiosa para entender la cinética de intercambio de solución en la cámara de grabación.
Se encontraron tres factores críticamente importantes que influyen en la calidad y robustez de las mediciones K+ en rodajas. El primero es la calidad de la preparación, la salud del tejido y la edad de los animales utilizados parecen ser relevantes. Para este estudio, hemos utilizado ratones C57/Bl6N que son ~ 12 semanas de edad. En raras ocasiones, encontramos sectores con fluctuaciones espontáneas de K+ por importe de ~0.1 mM y duración 5-10 segundos; estos sectores fueron desechadas. La segunda es la calidad de la grabación microelectrodo. El tema principal es el tiempo y la temperatura que se utiliza para la silanización del capilar de vidrio tirada. Recomendamos > 170 ° C durante al menos 6 horas (hasta durante la noche es aceptable) o a 200 ° C durante 30 minutos. Calentamiento insuficiente de los electrodos con el reactivo de silanización puede conducir a los electrodos que no mantienen un estado de constante potencial debido a la pérdida gradual de la ionóforo K+ . Además, durante la preparación de los electrodos, se recomienda colocar una capa delgada (1-2 mm) de la K+ ionóforo en la punta con un diámetro de 10-20 μm, es decir, aproximadamente del tamaño de un cuerpo promedio de la célula (figura 1B). No rompas la punta excesivamente ancha, o la membrana selectiva K+ pierde integridad y fallará el electrodo. Este paso puede requerir algo de práctica para lograr consejos del tamaño correcto. Electrodos selectivos de K+ con una punta demasiado fina o demasiado gruesa de una capa pueden tener respuestas lentas, en comparación con los electrodos correctamente construidos. El tercer factor es la distancia entre el electrodo de estimulación y el electrodo selectivo de K+ . Ha utilizado una distancia entre electroda de aproximadamente 500 μm, sin embargo la distancia óptima puede variar considerablemente con el área del cerebro individual y tendrá que ser cuidadosamente considerado para el experimento particular a mano.
Además de la configuración del mismo cañón, actualmente existen varios métodos para hacer K+-microelectrodos selectivos en bipolar y concéntricos formatos17. En comparación con las descripciones publicadas de estos métodos, solo canal los electrodos tienen dos desventajas principales: 1) un punta diámetro (~ 10 vs 4 μm), que podría causar una mayor perturbación del espacio extracelular comparted bipolar y concéntricos electrodos y 2) incompatibilidad con medición simultánea de múltiples especies de iones en los electrodos bipolares. Sin embargo, los electrodos de un canal ofrecen varias ventajas. Específicamente, estos electrodos pueden ser fabricados en menos de cinco minutos y por lo tanto más disponibles y puede ser hecho y calibrar rápidamente antes de los experimentos. Por lo tanto, el riesgo de rotura del electrodo durante los experimentos de curso está a menos de una preocupación. Además, porque el electrodo de tierra y el electrodo de la grabación están separados físicamente por el volumen de la bañera, no hay posibilidad para la formación de puentes de sal en la punta del electrodo, que puede llevar a insuficiencia de electrodo concéntrico y bipolar electrodos. El tiempo de respuesta de los electrodos de un canal es más rápido que electrodos bipolares y electrodos probablemente comparables a concéntricos (~ 20 ms), aunque nuestro sistema de perfusión rápida sólo permite una medición de tiempos de respuesta del orden de 80 ms (figura 3E ). Además, estos electrodos ofrecen un ruido más bajo en comparación con electrodos bipolares, que tienen una mayor resistencia de punta y requieren el uso de amplificadores con mayor resistencia a la entrada. Por último, estos electrodos no requieren el uso de un instrumental quirúrgico especializado o headstage como se requiere de electrodos concéntricos. En definitiva, las ventajas de la construcción y la facilidad de uso de electrodos de un canal compensa las desventajas.
El enfoque que utilizamos aquí para medir la dinámica del K+ en rodajas puede utilizarse en muchas regiones del cerebro para el estudio de regulación K+ . Aunque este protocolo demuestra el uso de K+-electrodos selectivos para las mediciones de la dinámica de iones potasio eléctricamente evocados en los tejidos del cerebro, este protocolo puede ser ampliamente utilizado en muchos diversos tejidos donde es conveniente medir la dinámica de K+ . Tales situaciones pueden incluir cambios y dinámica espontánea en respuesta a la farmacológica, optogenetic, o chemogenetic de activación celular. Estos microelectrodos pueden hacerse con suficiente calidad y fiabilidad en cuanto a permitir una integración rápida de esta técnica en cualquier caja de herramientas de laboratorio. El análisis detallado de las concentraciones de K+ en salud y los Estados enfermos permitirá mayor detección y cuantificación de cómo diversos componentes moleculares y celulares contribuyen al descanso K+ concentraciones en el cerebro3, 18,19.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El laboratorio de Khakh fue apoyado por los NIH MH104069. El laboratorio de Mody fue apoyado por NIH NS030549. J.C.O. gracias la Grant(NS058280) de formación Microcircuitos neuronales NIH T32.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
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