Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose

Zusammenfassung

Hier zeigen wir eine Methode für das live Cell Imaging von regulierten Exozytose. Diese Methode nutzt FITC-Dextran, die reichert sich in Lysosomen-bezogene Organellen, als Reporter. Diese einfache Methode ermöglicht auch die Unterscheidung zwischen verschiedenen Modi der regulierten Exozytose in Zellen, die schwer zu genetisch zu manipulieren sind.

Zusammenfassung

Regulierten Exozytose ist ein Prozess, der durch den Ladung, die in sekretorischen Granulat (SGs) gespeichert ist, als Reaktion auf einen sekretorischen Auslöser freigegeben wird. Regulierten Exozytose ist von grundlegender Bedeutung für die interzelluläre Kommunikation und ist ein wichtiges Instrument für die Sekretion von Neurotransmitter, Hormone, Entzündungsmediatoren und andere Verbindungen, durch eine Vielzahl von Zellen. Mindestens drei verschiedene Mechanismen sind bekannt für regulierte Exozytose: volle Exozytose, wo ein einziges SG voll mit der Plasmamembran, Kiss-and-Run Exozytose verschmilzt, wo ein einziges SG vorübergehend mit der Plasmamembran verschmilzt, und zusammengesetzte Exozytose, wo mehreren SGs verschmelzen miteinander, vor oder nach SG-Fusion mit der Plasmamembran. Die Art der regulierten Exozytose durchgeführt von einer Zelle wird häufig durch die Art der sekretorischen Trigger vorgeschrieben. Jedoch kann in vielen Zellen, sekretorische einabzug mehrere Modi der regulierten Exozytose gleichzeitig aktivieren. Trotz ihrer Fülle und Bedeutung über Zelle Arten und Arten sind die Mechanismen, die die verschiedenen Modi der Sekretion bestimmen weitgehend ungelöst. Eine der größten Herausforderungen bei der Untersuchung der verschiedenen Verkehrsträger regulierten Exozytose ist die Schwierigkeit bei der Unterscheidung zwischen ihnen, als auch separat zu erkunden. Hier beschreiben wir die Verwendung von Fluorescein erfolgt (FITC)-Dextran als Exozytose Reporter und live Cell imaging, um zu unterscheiden, die verschiedene Wege der regulierten Exozytose, mit Schwerpunkt auf zusammengesetzte Exozytose, basierend auf die Robustheit und Dauer der Exocytic Ereignisse.

Einleitung

Regulierten Exozytose ist der primäre Mechanismus durch die leicht gemachte Cargo von sekretorischen Zellen als Reaktion auf einen bestimmten Auslöser freigegeben wird. Die Ladung ist vorgeformt und abgesondert in sekretorischen Vesikel, in denen es gespeichert wird, bis ein Auslöser das Signal für die Veröffentlichung von Inhalten der SGs überträgt. Verschiedene Arten von Signalen können in verschiedenen Modi der regulierten Exozytose, oder verschiedene Modi der regulierten Exozytose können gleichzeitig auftreten. Drei Hauptmodi des regulierten Exozytose sind bekannt: volle Exozytose, einhergehende vollständige Verschmelzung von einem einzigen sekretorischen Granulat....

Protokoll

1. Vorbereitungen

1. Vorbereitung der RBL Nährmedien
   1. Mix 500 mL niedrige Glukose Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 56 mL fetalen bovine Serum (FBS), 5,5 mL Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung, 5,5 mL L-Glutamin 200 mM Lösung. Dies führt zu niedrigen Blutzucker DMEM mit 10 % FBS, 100 µg/mL Streptomycin, 100 Einheiten/mL Penicillin, 12 Einheiten/mL Nystatin und 2 mM L-Glutamin ergänzt.
   2. Filtermedien Sie die mit einem Top-Vakuum-Filter von 0,22 µm Porengröße und Store bei 4 ° c
2. Wartung von RBL-Zellen.
   1. Wachsen Sie RBL-Zellen auf eine maximale Konfluenz von 90 % in einer 10 cm Petrischale. Wenn die Zellku....

Ergebnisse

Abbildung 1a stellt schematisch wie FITC-Dextran als Reporter tätig werden kann für die Exozytose reguliert und die verschiedenen Modi der Exocytic Ereignisse zu rekapitulieren. Erstens sind Zellen mit FITC-Dextran, inkubiert, die durch Pinocytose verinnerlicht und sortiert die SGs. Da die SGs MCs LROs sind, ihre niedrige pH-Wert dämpft die Fluoreszenz der FITC, hier gezeigten Schwarz Granulat (A-C, ich). Wenn Zellen durch eine sekretagog und SGs verschmelzen.......

Diskussion

Hier beschreiben wir wie Tracing die Fluoreszenz der FITC-Dextran in SGs geladen verwendet werden kann um speziell zusammengesetzte Exozytose Ereignisse zu erfassen. Dies wurde erreicht durch das Mikroskop, alle 15 Sekunden ein Bild zu erwerben, damit nur lang andauernde Ereignisse im Laufe der Zeit aufgezeichnet werden und daher ohne kurze Ereignisse, die volle Exozytose oder Kiss-and-Run Exozytose entsprechen würde. Um die Methode zu etablieren, haben wir gezeigt, dass Knockdown von Rab5-Isoformen, die sind in RBL Zell.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM niedrige Glukose	Biologische Induktionen	01-050-1A
Fötales Rinderserum	Gibco	12657
Pen-Streptokokken-Nystatin-Lösung	Biologische Induktionen	03-032-1B
L-Glutamin 200 mM Lösung	Biologische Induktien	03-020-1A
FITC Dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Lösung B	Biologische Induktien	03-052-1A	Warm in 37 & Grad; C Wasserbad vor Gebrauch
Obervakuumfilter von 0,22 & Mikro; M Porengröße	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Spritzenvorsatz-Filtereinheit aus Celluloseacetat, 0,22 & Mikro; m Porengröße	Sartorius	16534K
Kammer-Deckglas	Thermo scientific	155411
Corning mit Gewebekulturen behandelte Kulturschalen	Sigma-Aldrich	CLS430167
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A4503
Monoklonales Anti-DNP-IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Vermeiden Sie direkte Lichteinwirkung
Hepes-Puffer 1M, pH 7,4	Biologische Induktionen	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glukose	BDH Laboratorien	284515V
Ammoniumchlorid	MERK	1145
PIPES Dikaliumsalz	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calciumacetathydrat	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesiumacetat-Tetrahydrat	Sigma-Aldrich	M5661
Kaliumglutamat (L-Glutaminsäure-Kaliumsalz-Monohydrat)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Elektroporator	BTX	ECM830
Konfokales Mikroskop, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	In Abbildung 3 verwendet. Ausgestattet mit einem elektronischen temperaturgesteuerten Luftstrom-Inkubator
Konfokalmikroskop, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	in Abbildung 2. Ausgestattet mit einem GaAsP-Detektor, einem elektronischen temperaturgesteuerten Luftstrom-Inkubator
, Konfokalmikroskop, Leica	Leica	SP5	(siehe Abbildung 1). Ausgestattet mit einem Leica HyD-Detektor und einem Top-Stage-Inkubator (Okolab)
RBL-2H3-Zellen			im Labor von Reuben P. Siraganian kloniert. Siehe Referenz 67

wurden RBL-2H3-Zellen