Summary
Denne protokollen beskriver bruken av plast sjetonger for kultur og fordeler primære murine neurons. Disse brikkene er prefabrikkerte, brukervennlig og kompatibel med høy oppløsning, lever, og fluorescens bildebehandling. Denne protokollen beskriver hvordan plate rotte hippocampus nerveceller i disse brikkene og utføre fluidic isolasjon, axotomy og immunostai.
Abstract
Microfabricated metoder å fordeler neurons har blitt viktige verktøy for mange neuroscientists. Denne protokollen beskriver bruken av en kommersielt tilgjengelig ferdigmontert plast chip for compartmentalizing kulturperler primære rotte hippocampus neurons. Disse plast sjetonger i fotavtrykk av en standard microscope skyve, er kompatibel med høy oppløsning, lever, og fluorescens bildebehandling. Denne protokollen demonstrerer hvordan du retrograd etiketten neurons via isolert axons bruker en modifisert rabiat virus koding et fluorescerende protein, opprette isolerte microenvironments i et rom og utføre axotomy og immunocytochemistry på prosessoren. Neurons er kultivert > 3 uker i plast sjetonger, illustrerer kompatibiliteten til disse brikkene for langsiktig neuronal kulturer.
Introduction
Tradisjonelle Nevron kultur tilnærminger resulterer i tilfeldig utvekst av axons og dendrites, hvilke forhindre studiet av nerveceller i deres unike polarisert morfologi. Microfabricated multicompartment enheter har blitt veletablerte og godt brukt forskningsverktøy for nevrologer i de siste 10-15 årene (høyprofilerte publikasjoner er refererte1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). disse enhetene fordeler nevroner og en metode for å fysisk og kjemisk manipulere subcellular regioner av neurons, inkludert somata, dendrites, axons og synapser18,19. De tilbyr også flere eksperimentelle paradigmer som ikke er mulig å bruke tilfeldige kulturer, inkludert studier av axonal transport, axonal proteinsyntese, axon skade/regenerasjon og axon til soma signalering. 2 delt grunnkonfigurasjon består av to parallelle microfluidic kanaler med en rekke mindre vinkelrett microgrooves. Primær eller Stamcelle-avledet neurons er belagt i en av microfluidic kanalene, utligne og feste til bunnen av enheten og utvide neurites i løpet av dager. Mange veksten kjeglene finner veien inn i microgrooves, som er små nok til at de hindrer cellen legemer inn. Fordi veksten kjeglene er fysisk begrenset og ikke å snu i microgrooves, vokser de rett inn i det tilstøtende rommet (axonal rom) hvor de er isolert.
Historisk er disse enhetene har blitt formet med poly(dimethylsiloxane) (PDMS) fra en photolithographically mønstrede master mold og laget i-huset i etterforskere laboratorier eller kjøpt kommersielt. En av de viktigste ulempene med å bruke PDMS er dens hydrophobicity20. PDMS gjøres hydrofile midlertidig, men deretter blir raskt hydrofobe innen timer i en ikke-vandig miljø20. Derfor må enhetene knyttes til et glass dekkglassvæske eller andre passende substrat ved bruk. Ferdigmontert plast multicompartment sjetonger er nå kommersielt tilgjengelig (f.eksXonaChips) i sprøytestøpt plast. Disse brikkene er laget permanent hydrofile, forenkle enheten wetting og la før monteringen av chip med en tynn film av syklisk olefiner copolymer (COC) sette microfluidic kanalene på bunnen. Disse brikkene er fabrikkert i en optisk gjennomsiktig plast egnet for høy oppløsning fluorescens bildebehandling.
Formålet med denne protokollen er å demonstrere bruk av chips ferdigmontert plast microfluidic for flere eksperimentelle paradigmer utføres med murine hippocampus eller kortikale neurons. Denne protokollen beskriver hvordan retrograd etiketten neurons bruker en modifisert rabiat virus innen chip. Axotomy for studier av axon skade og gjenfødelse er også beskrevet. Til slutt viser denne protokollen hvordan du utfører fluorescens immunostaining med enheten.
Protocol
Merk: En skjematisk av plast multicompartment chip er vist i figur 1A, B. Chip er på størrelse med en standard microscope skyve (75 mm × 25 mm). Funksjonene av chip, inkludert viktigste kanaler eller rom, brønner og microgrooves merket og tilbys for fremtidig referanse. Figur 1 c er et fotografi av chip demonstrere fluidic isolasjon av seksjonene.
1. forberedelse og belegg av Multicompartment Chips
- En bio-sikkerhet regjering, plassere brikken i en Petriskål eller andre passende sterile containeren.
- Legg 100 µL av pre belegg løsning på øvre venstre godt av chip og la den flyte gjennom viktigste kanalen i den tilgrensende godt.
Merk: Før belegget løsningen brukes til coat pre microfluidic kanalene for å eliminere muligheten for overlapping luftbobler i chip. - Fyll nederst venstre med 100 µL av pre belegg løsning. Vent på 5 minutter for å tillate løsningen å strømme gjennom microgrooves.
- Legg 100 µL av pre belegg løsning til øvre høyre godt og la den flyte gjennom viktigste kanalen i den tilgrensende godt. Fyll den nedre høyre brønnen med 100 µL av pre belegg løsning.
- Sug opp løsningen fra hver brønn. Sug opp fra den viktigste kanalene å unngå fjerne væske fra den viktigste kanalene (figur 2A). Straks legge 150 µL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) til venstre godt. Vent 1,5 min.
FORSIKTIG: Ikke Sug opp all væsken fra den vedlagte viktigste kanalene. - Legge til 150 µL PBS i nedre venstre godt. Vent 5 min slik at væske til å flyte gjennom microgrooves. Legge til 150 µL PBS i øvre høyre godt. Legge til 150 µL PBS til lavere like godt. Vente 10 min.
- Gjenta trinn 1.5-1.6 for en andre PBS vask.
- Sjekk chip under vev kultur mikroskop bobler i de viktigste kanalene. Hvis er bobler, kan du utføre fremgangsmåtene nedenfor. Hvis det finnes noen bobler, hopper du til trinn 1.9.
- Sug opp PBS fra brønnene fiske Pipetter tipset fra kanalen åpning (figur 2A).
- Dispensere 100 µL av pre belegg løsning i øvre brønnen, sportsfiske spissen av Pipetter nær kanalen åpning (figur 2B). Bobler bør gå gjennom kanalen i nedre brønnen. Vent 1,5 min.
- Gjenta trinn 1.3-1.8.
- Sug opp PBS fra brønnene fiske Pipetter tipset fra kanalen åpning (figur 2A).
- Legge til 100 µL av 0,5 mg/mL poly d-lysine (PDL) i øvre venstre godt av chip. Vent 1,5 min. Fyll nedre venstre med 100 µL av PDL.
- Legge til 100 µL av PDL øvre høyre godt av chip. Vent 1,5 min. Tilsett 100 µL til nedre høyre brønnen.
- Lukk Petriskål og plassere brikken i en inkubator på 37 ° C 1t.
- Gjenta PBS vask 1.5-1.6 to ganger for å fjerne overflødig PDL.
- Sug opp PBS fra enheten.
- Umiddelbart legge 100 µL av celle kultur medier til øvre venstre godt av chip. Vent 1,5 min. medier til nedre venstre godt. Legge til medier til øvre høyre godt. Vent 1,5 min. Tilsett 100 µL middels til den nedre høyre brønnen på brikken.
- Plass chip i 37° C inkubator til klar til platen celler.
2. seeding Neurons i Multicompartment Chips
- Forberede celle suspensjon av dissosiert rotte hippocampus nerveceller i henhold til etablerte protokoller21,22 å gi en tetthet av ~ 12 × 106 celler/mL.
Merk: Bruk av cellen suspensjon tettheter mellom 3 og 12 × 106 celler/mL er mulig. Hvis en lavere tetthet brukes, kan volumet av cellen suspensjon legges til chip økes (se nedenfor). Fremgangsmåten nedenfor gjelder for murine dissosiert kortikale eller hippocampus neurons. Optimal celle tettheter for andre Nevron kan variere. - Fjern fleste medier i hver brønn av chip, forlater ca 5 µL i hver brønn. Sug opp fra den viktigste kanalene å unngå fjerne væske fra den viktigste kanalene (figur 2A).
FORSIKTIG: Ikke Sug opp væske fra den vedlagte viktigste kanalene. Luftbobler kan bli fanget i chip hvis væske er pustende fra de viktigste kanalene. - Lastes 5 µL av cellen suspensjon i øvre høyre også og en annen 5 µL av cellen suspensjon i nedre høyre godt (~ 120 000 celler totalt). Laste inn cellene ved dispensering nær viktigste kanalen (figur 2B). Sjekk under et mikroskop for å sikre neurons er den viktigste kanalen. Vent 5 min til at cellene å feste.
Merk: Neurons kan lastes inn i enten kupé. For forklaring formål, somatiske rommet er den viktigste kanalen på høyre side, men enten rommet kan brukes som somatiske batterirommet. Bruk av lavere celle tettheter til 60.000 celler per brikke er mulig. Opptil 10 µL av cellen suspensjon legges til hver godt av somatiske kupé i kombinasjon med en celle hjuloppheng med færre celler enn beskrevet ovenfor. - Legge til ca 150 µL av neuronal kultur medier til hver av de øvre og nedre høyre brønner, og deretter legge 150 µL av medier til hver av de øvre og nedre venstre brønner. Plassere brikken i fuktet brett i en 5% CO2 37 ° C inkubator.
- Etter 24 timer, kan du utføre en media endring ved å fjerne media fra brønnene. Kontroller at den viktigste kanalen er fylt. Tilsett 150 µL av media hver topp brønn, og fyll bunnen brønnene.
- Plassere brikken tilbake i inkubator for ønsket antall dager.
Merk: Overvåke media hver par dager for å sikre at det forblir lys rosa. Hvis mediet gulaktig, erstatter du 50% av det med frisk media. Hvis væsken er lav, kontroller at det er tilstrekkelig fuktighet og riktig sekundær containment av sjetonger for å hindre fordampning. Minimere, eller selv eliminere, media endringer er mulig sekundær containment og/eller dekker parabolen som inneholder chipen med polytetrafluoroethylene (PTFE)-FEP film.
3. retrograd merking av Neurons innenfor Chip
Merk: Retrograd merking kan utføres ved hjelp av flere teknikker, inkludert bruk av modifisert kolera gift og rabiat virus. Under instruksjoner for merking neurons bruker G-slettet Rabies-mCherry eller -eGFP virus. Håndtere potensielt smittefarlig materiale i henhold til lokale organisasjonens retningslinjer. Tilleggsopplæring kan være nødvendig.
- Varm fersk neuronal kultur medier til 37 ° C. Anslå ~ 400 µL av media per brikke.
- Fortynne 100.000 viral enheter av endrede rabiat virus i totalt 50 µL bruker medier Hentet fra enten godt av axonal kupé.
Merk: Kast tips og rør i kontakt med viruset alt etter organisasjon-godkjent protokollen. - Forsiktig Pipetter gjenværende media fra brønnene axonal rom og store i en sentrifuge rør på 37 ° C.
- Tilsett 150 µL av fersk varm media og 50 µL av utvannet virus axonal rommet. Inkuber 2 h på 37 ° C inkubator.
- Fjerne mediet som inneholder virus og på forskriftsmessig måte.
Merk: Luftbobler kan bli fanget i chip hvis væske er pustende fra de viktigste kanalene. - Forsiktig legge til 75 µL av fersk media en axon godt og la den flyte til andre axon godt.
- Fjerne gjennomflytsenhet fra andre axon godt og kast riktig.
- Gjenta trinn 3.6 og 3.7 en gang.
- Legge tilbake lagrede media axonal rommet. Legge til ca 50 µL frisk medier, hvis det er nødvendig å opprettholde tilstrekkelig volum og cellene inkubator.
Merk: Fluorescerende protein uttrykk er synlig ved 48t og vedvarer for opp til 8 dager. Neurons kan avbildes i opptil 30 min ved romtemperatur i neuronal kultur medier. Kultur medier kan også erstattes med varmet CO2-uavhengig dvalemodus E med B27 og fotografert lenger. Neurons kan også avbildes i en godt fuktet miljømessige kammer på 37 ° C og 5% CO2. I dette tilfellet er luftfukting avgjørende for å minimere fordamping tap i chips, som forsterkes av varme og kan kompromittere Nevron helse.
4. fluidic isolasjon av Axonal kupé innenfor Chip
- Fjerne 20 µL fra nedre venstre godt av axonal rom og sted i øvre høyre brønnen av somatiske kupé. Vente 2 min for flyt i hver kanal til equilibrate.
- Fjern 50 µL av media fra axonal batterirommet. Legge til 0,3 µL av 1 mM Alexa Fluor 488 hydrazide i dette mediet, bland via Pipetter og gå tilbake til axonal batterirommet. Chip er klart til avbilding.
Merk: Andre forbindelser rundt kan legges. Hvis du legger til en fluorescerende farge med en lignende molekylvekt som sammensatte interesse anbefales for å overvåke fluidic isolasjon over tid.
5. utføre Axotomy i Chip
- Fjern medier fra axonal batterirommet holde Pipetter tipset fra inngangen til den viktigste kanalen (figur 2A) og lagre den i en sentrifuge rør.
- Sug opp axonal rommet, plassere aspirasjon Pipetter enten inngangen av viktigste kanalen axonal batterirommet (figur 2B). Fortsett streben for 1-2 min. Kontroller at løsningen er fjernet fra batterirommet.
NOTE Det tomrommet trykket for aspirasjon må være minst 18 tommers-Hg axotomy fremgangsmåten å fungere. - Erstatt axonal rommet med lagrede media og bekrefte at axons er kuttet ved å se på chip under et mikroskop.
Merk: Hvis bobler dannes i axonal rommet når erstatter media, Gjenta trinn 5.1-5.2. - Tilbake chip til inkubator.
6. fluorescens Immunostaining innenfor Chip
- Forberede 4% formaldehyd fiksering løsning i PBS (4% formaldehyd, 1 µM MgCl2, 0.1 µm CaCl2, 120 mM sukrose)
- Fjerne det meste av media i brønnene på brikken (ikke tørr indre rom).
- Umiddelbart legge 100 µL fiksering løsning til toppen brønnene axonal og somatiske rom.
- Etter 1 min, kan du legge 100 µL fiksering løsning til bunnen brønnene. Fastsette for 30 min ved romtemperatur.
- Fjerne det meste av løsningen fra brønnene på brikken (ikke tørr indre rom). Straks legge 150 µL av PBS til hver av topp axonal og somatiske rom. Vente 2 min for at PBS skal flyte inn i bunnen brønnene.
- Gjenta trinn 6.5 to ganger.
- Fjerne det meste av PBS fra brønnene på brikken. Straks legge 150 µL av PBS med 0,25% TritonX-100 til hver av topp axonal og somatiske rom. Vente 15 min.
- Fjerne det meste av væsken fra brønnene på brikken og umiddelbart legge 150 µL av blokkering løsning (10% normal geit serum i PBS) til hver av topp axonal og somatiske rom. Vente 15 min.
Merk: Effektive løsninger for blokkering bør være spesifikke for sekundær antistoffer, f.eksfor et esel anti-sauer sekundære antistoff, bruke esel serum i blokkering løsningen. - Fjerne det meste av væsken fra brønnene på brikken og umiddelbart legge 100 µL av primære antistoff (eller antistoffer) i 1% normal geit serum i PBS til hver av topp axonal og somatiske rom. Dekke for å minimere fordampning og vente på 1 time i rom temperatur eller 4 ° C over natten.
- Fjerne det meste av løsningen fra brønnene på brikken (ikke tørr indre rom). Straks legge 150 µL av PBS til hver av topp axonal og somatiske rom. Vent 5 min for at PBS skal flyte inn i bunnen brønnene.
- Gjenta trinn 6.10 to ganger.
- Fjerne det meste av væsken fra brønnene på brikken og umiddelbart legge 100 µL av sekundær antistoff (eller antistoffer) i PBS til hver av topp axonal og somatiske rom. Dekke for å minimere fordampning og vente på 1t ved romtemperatur.
Merk: Se produsentens instruksjoner for anbefalte fortynning av sekundær antistoffer. - Gjenta 6.10-6.11.
- Hvis imaging innen 1 dag av immunostaining, holde chip fylt med PBS. Hvis chip skal lagres lenger enn 1 dag før bildebehandling og vikle parabolen som inneholder chip i parafin film å hindre fordampning og lagre på 4 ° C til du er klar til avbildning.
- For lengre sikt oppbevaring av prøver, kan monterer medier (f.eksFluoromount-G) brukes.
- Fjerne det meste av væsken fra brønnene på brikken. Bruk en 1 mL engangs plast Pipetter 2 dråper montering media til hver av topp axonal og somatiske rom.
- Vipp chip for å stimulere flyten av montering media gjennom kanaler. Etter 5 min Legg 2 dråper nederst fordelt. Vent 1 time før bildebehandling.
Merk: Etter benytter monterer medier det vil ikke være mulig å re s├╕k andre mål.
Representative Results
Etter ca 5-7 dager av Nevron vekst innenfor chip er axonal veksten tydelig. Flisen er kompatibel med kontrast imaging som vist i Figur 3som dannes hemmer nevronal vekst på 24 dager. Flisen er også kompatibel med fluorescens imaging (Figur 4, figur 5, figur 6og figur 7). Tre dager etter rabiat smitte via axonal rommet, ble mCherry-positive neurons med axons utvide inn axonal rommet avbildet i chip (Figur 4). For å demonstrere evnen fluidically isolere seksjonene, ble en lav molekylvekt fluorescerende farge (Alexa Fluor 488 hydrazide) lagt til axonal batterirommet. Disse resultatene er sammenlignbare med PDMS-baserte kammer17 og demonstrere hensiktsmessigheten av plast chip for fase kontrast og fluorescens bildebehandling.
For å illustrere dannes hemmer nevronal vekst med plast sjetonger og PDMS enheter, vi kulturperler nerveceller i begge plattformer og overvåket dannes hemmer nevronal vekst over tid. Figur 5 viser dannes hemmer nevronal vekst fra 3 til 22 dager i kultur; disse resultatene er representant for 3 uavhengige eksperimenter. Dannes hemmer nevronal vekst er sammenlignbare i de to plattformene opptil 15 dager i kultur, men på lengre kultur alderen (> 21 dager) isolert axons innenfor plast chip vises sunnere med mindre beading (figur 5A). Videre visualisere axons innenfor axonal seksjonene, vi immunostained for β-tubulin III som viser sunn axonal vekst i plast chips på 22 dager i kultur (figur 5B).
Axon skade og regeneration studier er vanlig med microfluidic compartmentalized enheter. For å demonstrere hensiktsmessigheten av disse studiene bruker chips, retrograd merket neurons ble fotografert før og 24 timer etter axotomy (figur 6). En retraction pære og regenererende axon er både tydelig følgende axotomy. Disse resultatene er tilsvarende publiserte data ved hjelp av PDMS-baserte enheter14,17.
Immunocytochemistry er en vanlig teknikk utført innen flere kupé enheter å visualisere protein lokalisering. Etter 24 dager i kultur, nerveceller i chips var fast og farget for både eksitatoriske og inhibitory synaptic markører, vGlut1 og vGat, henholdsvis (figur 7). Retrograd merket mCherry neurons var også bildebasert (figur 7C). Bildebehandling ble utført med spinning disk AC confocal med en 60 × silikon olje nedsenking mål, demonstrere evnen til å utføre høy-resolution tenkelig. Viktigere, var dendrittiske spines tydelig innenfor et forstørret område, viser at nervecellene kultivert i chips dannet modne synapser.
Figur 1 : En ferdigmontert, plast to-compartment microfluidic chip for compartmentalizing neurons. (A) skjematisk fremstilling av multicompartment chip viser plassering av øvre og nedre brønnene. (B) en forstørret skjematisk av chip viser viktigste kanaler (eller avdelinger) og microgrooves som forbinder seksjonene. Den viktigste kanalene er ca 1,5 mm × 7 × 0.060 mm (W × L × H). Bredden og høyden på microgrooves er ca 0,01 mm × 0.005 mm, henholdsvis. Lengden på microgrooves varierer avhengig av konfigurasjon, 0.15 mm 0,9 mm. (C) A fotografi av en representant multicompartment chip som inneholder konditorfarge fargestoff i hovedkanalen eller kupé demonstrere evnen til å fluidically isolere hver kanal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Pipettering teknikker nødvendig når du bruker plast multicompartment sjetonger. (A) når tilføyer og aspirating medier for vasker, Pipetter spissen bør være vinklet fra inngangen til den viktigste kanalen som vist. (B) når lasting nerveceller eller utføre axotomy, Pipetter spissen bør være vinklet mot inngangen til den viktigste kanalen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : En fase kontrast mikroskop-bilde viser typisk dannes hemmer nevronal vekst innenfor chip på 24 dager i kultur. Embryonale hippocampus neurons ble sådd i det høyre somatiske rommet. Axon vekst er synlig i axonal kupé begynnelsen på 5-7 dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Retrograd merket neurons express mCherry fluorescerende protein og utvide axons til en fluidically isolert axonal kupé. (A) et flettet fluorescens mikroskop-bilde viser live retrograd merket neurons infisert via en modifisert mCherry rabiat virus kort brukt axonal rommet. Neurons ble fotografert 3 dager etter infeksjon på 21 dager i kultur. Opprette en isolert microenvironment innen axonal rommet er demonstrert ved en lav molekylvekt fargestoff, Alexa Fluor 488 hydrazide. (B) en sammenslåtte bildet av (A), inkludert en differensiell forstyrrelser kontrast (DIC) bildet for å visualisere microgrooves regionen chip. Bildene ble anskaffet med laserskanning AC confocal mikroskop med en 30 × / 1.05 N.A. silikonolje (ne = 1.406) linsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Side ved side sammenligning av dannes hemmer nevronal vekst innen multicompartment PDMS enheter og plast sjetonger. (A) fase kontrast micrographs begge plattformer tatt på 3, 7, 15 og 22 dager i kultur. Nederst er en høyere forstørrelse regionen tatt fra bilder på 22 dager inkludert for å illustrere axonal vekst i denne alderen i begge plattformene. Axons innenfor chip er mer kontinuerlig og dukker sunnere enn PDMS enheten i denne alderen. (B) en Inverter immunofluorescence mikroskop-bilde av β-tubulin III farget axons innenfor axonal rommet av både PDMS enhet og plast chip på 22 dager i kultur. Bildene ble anskaffet med et spinning disk AC confocal imaging system ved hjelp av en 20 x / 0,45 N.A. linsen. Alle skala barer er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Axotomy og hippocampus nerveceller i plast multicompartment chip. (Øverst) Neurons var retrograd merket med en modifisert mCherry rabiat virus og deretter fotografert før axotomy på 24 dager i kultur. Bildene var pseudocolored 'Brann' farge look-up tabellen. (Nederst) Samme Nevron fotografert i toppanelet ble fotografert 24 h innlegg-axotomy. Hvite stiplede linjer viser kantene på Mikrokuttspor barriere. Axotomy skjedde på plasseringen av den venstre stiplede linjen. Hvit pilspissen viser en tilbakekallelse pære. Den hvite pilen viser en regenererende axon. Bildene ble anskaffet med et spinning disk AC confocal imaging system bruker en 20 × / 0.45 N.A. linsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Synapser form mellom hippocampus neurons kultivert i plast multicompartment sjetonger. Immunostaining ble utført på 24 dager i kultur og fotografert i somatiske rommet med en 60 × silikon olje nedsenking linse. Neurons express (A) eksitatoriske synapse markøren, vGlut1 (grønn) og (B) den hemmende synapse markøren, vGAT (blå). (C) Retrograde merket mCherry neurons (rød) ble infisert via endrede rabiat virus brukt axonal rommet. (D) en sammenslått fluorescens mikroskop-bilde av vGlut1, vGat og mCherry. (E) forstørret regionen i (D) med en hvit boks viser dendrittiske spines, nettsteder som mottar synaptic innspill fra andre neurons. Bildene ble anskaffet med et spinning disk AC confocal imaging system bruker en 60 × / 1.3 N.A. silikonolje (ne = 1.406) linsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Plast sjetonger for multicompartment | PDMS multicompartment enheter |
| isolere axons | isolere axons |
| etablere microenvironments | etablere microenvironments |
| axotomize nerveceller | axotomize nerveceller |
| optisk gjennomsiktig | optisk gjennomsiktig |
| kompatibel med høy oppløsning bildebehandling | kompatibel med høy oppløsning bildebehandling |
| kompatibel med fluorescens mikroskopi | kompatibel med fluorescens mikroskopi |
| ferdig montert | samlingen substrat kreves |
| sunn axons > 21 dager | sunn axons > 14 dager |
| hydrofile dyrking overflaten | hydrofobe |
| gass ugjennomtrengelig | gass permeabel |
| avrundet microgrooves og kanaler | rett microgrooves |
| færre forberedelsene | toppen er flyttbare til farging i microgrooves |
| ikke kompatibel med laser ablasjon | absorpsjon av små molekyler og organiske løsemidler |
| ikke kompatibel med mineralolje-baserte nedsenking oljer (silikonbasert oljer er fin) |
Tabell 1: Sammenligning av plast og PDMS multicompartment plattformer for dyrking neurons.
Discussion
Plast sjetonger for multicompartment gir en lett-å-bruke alternativet for compartmentalizing neurons, gir langsiktig neuronal kulturer (> 3 uker). Denne protokollen detaljer hvordan kultur kortikale og hippocampus murine nerveceller i disse brikkene. Etableringen av løselig microenvironments og hvordan retrograd etiketten nerveceller, utføre axotomy og utføre immunocytochemistry ble også diskutert. Viktigere, disse prosessorene er kompatible med høy oppløsning, fluorescens og live bildebehandling.
Plast multicompartment sjetonger gi mange av de samme funksjonene som de PDMS-baserte compartmentalized enhetene, men har fordeler, ulemper og noen særtrekk. Tabell 1 gir en Funksjonssammenligning av både plast chip og PDMS-baserte enheter. Først og fremst er flisen ferdig montert og gjort permanent hydrofile, som forenkler wetting, noe som gjør dem enklere å bruke. Plasten er ikke gass permeabel, i motsetning til PDMS, så hvis bobler uventet danner innenfor kanalene, de ikke lett rømme og må fjernes. En pre belegg løsning som inneholder hovedsakelig etanol og noen andre proprietære agenter eliminerer boble formasjon.
Live bildebehandling av projeksjoner følgende signaltransduksjon fluorescerende proteiner ble utført i chips (Figur 4) og det var ingen synlig autofluorescence av plast. En påminnelse er at nedsenking oljer brukes med chip for høy numeriske blenderåpning mål må være silikonolje basert og ikke mineralolje basert. Mineralolje kan føre en motsatt reaksjon med syklisk olefiner copolymer. For brightfield avbildning, er det viktig å merke seg at microgrooves i chip avrundes i endene og det er en gradvis overgang av z-retningen for den viktigste kanalene mot Mikrokuttspor barrieren forårsaker noen lys brytning i hver ende av den microgrooves i løpet av brightfield imaging (Figur 3). Chip er ferdigmontert, antistoff gjennomtrengning i mikron-størrelse-microgrooves kan være ujevn (som med permanent limt PDMS-baserte enheter); Dermed skal kvantitativ analyse etter immunostaining utføres i kanaler/seksjonene. Immunostaining av neuronal anslag i microgrooves kan forbedres ved å opprette en volumforskjellene mellom seksjonene å hjelpe flyten av antistoffer og fluorophores i microgrooves.
Disclosures
A.M.T. er en oppfinner av microfluidic kammer/chip (oss 7419822 B2) og er medlem av Xona Microfluidics, LLC. V.P. er ansatt i Xona Microfluidics, LLC. J.H. er medlem av Xona Microfluidics, LLC. T.N. angir ingen konkurrerende økonomiske interesser. Open access publisering av denne artikkelen er sponset av Xona Microfluidics.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter tekniske eller innholdsmessige assistanse fra Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) og Brad Taylor (Xona). Forfatterne bekrefter støtte fra Xona Microfluidics, LLC og National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Bildebehandling ble delvis støttet av Confocal og Multiphoton Imaging Core anlegg av NINDS Center Grant P30 NS045892 NICHD Center Grant (U54 HD079124). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
| Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
| Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
| E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
| neuronal culture media: | |||
| - Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| -B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
| -GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| -Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
| normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
References
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington's Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell Reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
- Yang, Y., et al. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61 (6), 880-894 (2009).
- Sutton, M. A., Taylor, A. M., Ito, H. T., Pham, A., Schuman, E. M. Postsynaptic decoding of neural activity: eEF2 as a biochemical sensor coupling miniature synaptic transmission to local protein synthesis. Neuron. 55 (4), 648-661 (2007).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nature Cell Biology. 11 (8), 1024-1030 (2009).
- Sharma, N., et al. Long-distance control of synapse assembly by target-derived NGF. Neuron. 67 (3), 422-434 (2010).
- Harrington, A. W., et al. Recruitment of actin modifiers to TrkA endosomes governs retrograde NGF signaling and survival. Cell. 146 (3), 421-434 (2011).
- Zhang, Y., et al. Assembly and maintenance of nodes of ranvier rely on distinct sources of proteins and targeting mechanisms. Neuron. 73 (1), 92-107 (2012).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Tran, H. T., et al. Alpha-synuclein immunotherapy blocks uptake and templated propagation of misfolded alpha-synuclein and neurodegeneration. Cell Reports. 7 (6), 2054-2065 (2014).
- Calafate, S., et al. Synaptic Contacts Enhance Cell-to-Cell Tau Pathology Propagation. Cell Reports. 11 (8), 1176-1183 (2015).
- Cosker, K. E., Fenstermacher, S. J., Pazyra-Murphy, M. F., Elliott, H. L., Segal, R. A. The RNA-binding protein SFPQ orchestrates an RNA regulon to promote axon viability. Nature Neuroscience. 19 (5), 690-696 (2016).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
- Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).
- Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes? Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , Second edition, MIT Press. (1998).
