Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Udvinding og analyse af taiwanske grønne Propolis

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

Summary

Vi præsenterer en protokol til brug af ætanol som opløsningsmiddel til at udtrække og karakterisere taiwanske grønne propolis, der udstiller antibakterielle aktivitet.

Abstract

Taiwanske grønne propolis er rig på prenylated flavonoider og udstiller en bred vifte af biologiske aktiviteter, såsom antioxidant, antibakterielle, og anticancer ones. De bioaktive stoffer af taiwanske grønne propolis er propolins, nemlig C, D, F og G. Koncentrationen af propolins i taiwanske grønne propolis varierer afhængigt af sæson og geografisk placering. Det er således afgørende at indføre en standard og repeterbare procedure for bestemmelse af kvaliteten af taiwanske grønne propolis. Vi præsenterer her, en protokol, der bruger ethanol-baseret udvinding, high-performance væskekromatografi og antibakterielle aktivitet analyse for at karakterisere taiwanske grønne propolis kvalitet. Denne metode angiver, at 95% og 99,5% ethanol ekstraktioner opnå maksimal tørstof udbyttet fra taiwanske grønne propolis, hvilket giver de højeste koncentrationer af propolins, der har antibakterielle egenskaber. Ifølge disse resultater anses denne protokol for pålidelige og repeterbare for bestemmelse af kvaliteten af taiwanske grønne propolis.

Introduction

Propolis er et naturligt harpiksholdige blanding fremstillet af arternes bi Apis mellifera. Propolis har været bredt anvendt siden oldtiden i folkemusik medicin. En undersøgelse for nylig rapporteret, at propolis er gavnlige for at forhindre mikrobielle infektioner og betændelse1. Talrige undersøgelser har vist, at de vigtigste bioaktive stoffer i propolis er flavonoider, phenol acid estere, prenylated p-coumaric syrer og diterpenic syrer2,3. Til dato, er 10 prenylated flavanone derivater fra taiwanske grønne propolis blevet identificeret gennem high-performance væskekromatografi (HPLC)4,5,6,7. Den mest udbredte blandt disse er propolins C, D, F og G5,7. De store biologiske effekter af taiwanske grønne propolis er korreleret med dens høje indhold af propolins8.

Koncentrationerne af bioaktive stoffer i propolis varierer meget afhængigt af sæson og geografiske placering som propolis er fremstillet. Europæiske propolis indeholder hovedsagelig flavonoid-aglycone og phenolforbindelser syrer-9. De store bioaktive stoffer i propolis fra Brasilien er prenylated p-coumaric syrer, såsom artepillin C10. En undersøgelse viste, at sæsonen er en kritisk faktor for bestemmelse af det samlede propolin indholdet i taiwanske grønne propolis11. Propolin indhold i taiwanske grønne propolis er højeste om sommeren (maj - juli) og lavest i vinteren11. Propolis antibakterielle ejendom har været almindeligt anset for at være en indikator for biologisk aktivitet. Generelt, prøver af propolis er indsamlet fra forskellige regioner har udstillet en lignende antibakterielle ejendom; for eksempel, det er generelt effektivt mod næsten alle gram-positive bakterier og udstiller en begrænset antibakterielle effekt mod gram-negative bakterier10,12,13. Synergistisk interaktioner mellem flavonoider i propolis påvistes for at har en antibakteriel virkning14. På samme måde, taiwanske grønne propolis blev rapporteret at have en antimikrobiel virkning mod gram-positive bakterier15. Derudover identificeret en undersøgelse også en antimikrobiel virkning af vekselvirkninger mellem propolins i taiwanske grønne propolis8.

Karakterisering af de bioaktive stoffer i propolis er vanskeligt, fordi dens kemiske sammensætning kan variere alt efter sit udspring af oprindelse. Det er derfor nødvendigt at fastsætte en realistisk og repeterbare metode til bestemmelse af kvaliteten af den taiwanske grønne propolis. Dog er der opstillet ingen standardprocedure for taiwanske grønne propolis ekstraktion og efterfølgende funktionalanalyse. Flere metoder, der skiftevis gælder organiske og uorganiske opløsningsmidler har været foreslået for propolis udvinding16,17,18,19,20. Da propolis er en lipofile blanding, har undersøgelser vist at økologisk udvinding er bedre end uorganiske udvinding8,18,19. Den samlede propolin koncentration i taiwanske grønne propolis og dens antibakterielle egenskaber er vigtige indikatorer for kvaliteten af taiwanske grønne propolis. Formålet med denne undersøgelse er således, at præsentere en protokol til brug af ætanol som opløsningsmiddel til at udtrække og karakterisere de antibakterielle egenskaber af taiwanske grønne propolis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fremstilling af Ethanol-udvundet forbindelser

  1. Vejer 10 g frosne taiwanske grønne propolis, som blev indsamlet fra bistader i Taiwan fra maj til juli, og male det ved hjælp af krydderi kværn. Bekræfte, at hele stykker af taiwanske grønne propolis er malet til et fint pulver uden nogen store partikler.
  2. Der tilsættes 100 mL af forskellige koncentrationer ethanol (60%, 70%, 80%, 95% og 99,5%) og vand til at adskille kolber og mix hver koncentration med 10 g af jorden propolis.
  3. Der inkuberes ved 25 ° C og Kolben rystes ved 250 rpm for 48 h.
  4. Filtrer ethanol Uddrag gennem filtrerpapir med en 25 μm porestørrelse.
  5. Rekonstruere Filtraterne til deres oprindelige volumen (100 mL) med 95% ethanol ved hjælp af en målekolbe.
  6. Gemme ethanol Uddrag ved-20 ° C.
    Bemærk: Protokollen kan pause her.

2. fremstilling af Ethanol uddrag til HPLC

  1. Koncentrere 10 mL ethanol Uddrag af vakuum fordampning ved 40 ° C i 15 min.
  2. Bage tørstoffet på 45 ° C i 24 timer.
  3. Rekonstruere tørstof med 10 mL 95% ethanol.
  4. Filter 1 mL ethanol Uddrag ved hjælp af en steril sprøjte filter med en porestørrelse på 0,45 µm.
  5. Genfiltrer ethanol Uddrag ved hjælp af en steril sprøjte filter med en 0,22 µm porestørrelse. Filtratet er indsamlet og kan analyseres direkte ved hjælp af HPLC.

3. analyse af Propolin indhold ved hjælp af HPLC

  1. Etablering af standard kurver af propolins
    1. Forberede 1 L af den mobile fase af 88.8:11.2 (v/v) metanol: vand løsning.
    2. Forberede serielle fortyndinger af propolin standard (C, D, F og G) koncentrationer (15.625 mg/mL, 31,25 mg/mL, 62,5 mg/mL og 125 mg/mL, henholdsvis) ved hjælp af den mobile fase løsning som opløsningsmiddel.
    3. Indsprøjtes 20 µL af propolin standard koncentrationer i omvendt-fase kolonne, sekventielt fra den lave koncentration til den høje koncentration.
    4. Angive kolonnen HPLC ved 30 ° C og strømningshastighed til 1 mL/min.
    5. Bølgelængden for UV-detektor til 280 nm og optager tid til 20 min.
    6. Analysere standarder mindst 3 x.
    7. Plot måling svar (y-aksen) mod koncentration (x-akse) ved hjælp af beregningen ark software og oprette en standardkurve med ligning og R-kvadrat værdi.
  2. Analyse af ethanol Uddrag s
    1. Indsprøjtes 20 µL af ethanol Uddrag fra trin 2.5 i kolonnen omvendt-fase.
    2. Angive kolonnen HPLC ved 30 ° C og strømningshastighed til 1 mL/min.
    3. Bølgelængden for UV-detektor til 280 nm og optager tid til 20 min.
    4. Analysere standarder mindst 3 x.
    5. Beregne koncentrationen af propolin i ethanol Uddrag, ved hjælp af ligningen til standardkurven fremstillet af trin 3.1.7 der bruger toparealet for hver propolin.

4. mindste hæmmende koncentration og mindst bakteriedræbende koncentration analyse

Bemærk: Metoden microdilution bruges til at evaluere den antibakterielle effekt af ethanol-udtrukket propolins fra taiwanske grønne propolis.

  1. Forberedelse af testorganismerne
    1. Tø bakteriestammer, Staphylococcus aureus og Escherichia coli, og derefter, kultur dem i tryptic soja bouillon og næringsstof bouillon, henholdsvis ved 37 ° C i 24 timer.
    2. Passage S. aureus ved hjælp af tryptic soja bouillon og E. coli ved hjælp af næringsstof bouillon i to generationer, og derefter beregne kolonidannende enheder ved at tælle enkelte kolonier på en agar plade.
  2. Forberedelse af ethanol Uddrag for antibakterielle aktivitet test
    1. Koncentrere ethanol Uddrag fra trin 1.5 af vakuum fordampning ved 40 ° C i 15 min.
    2. Rekonstruere tørstof med dimethylsulfoxid (DMSO) og justere koncentrationen af ekstrakt til 12,8 mg/mL.
    3. Gøre en seriel fortynding (koncentrationer: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 og 640 µg/mL) ethanol Uddrag ved hjælp af bouillon.
  3. Mindste hæmmende koncentration tests
    1. Tilsæt 10 µL fortyndet ethanol Uddrag spænder fra 0.156 til 640.0 µg/mL i en 96-brønd plade.
    2. Du bruger bouillon, justere lydstyrken til 100 µL, og vedligeholde 5% DMSO i alle fortyndinger.
    3. Podes 100 µL af bakteriekulturen (1 x 106/mL) i 96-brønd pladen.
    4. Kultur inokulum som indeholder forskellige koncentrationer ethanol Uddrag ved 37 ° C i 48 timer.
    5. Analysere bakterievækst Turbiditet og ved hjælp af optisk densitet (mikrotiterplade reader) på 590 nm til at bestemme de mindste hæmmende koncentration (MIC).
  4. Minimum bakteriedræbende koncentration tests
    1. Podes 10 µL af flydende kultur fra hver brønd af MIC-testen, udstillet ingen vækst på en agar plade.
    2. Der inkuberes ved 37 ° C i 24 timer.
    3. Bestemme de bakteriedræbende aktivitet ved at identificere den laveste koncentration, der afslørede ingen synlige bakterievækst. Den koncentration, der helt fjerner cellevækst anses for at være den mindste bakteriel koncentration (MBC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Positive repræsentative data for ethanol udvinding er præsenteret i tabel 1. Tørstof udbyttet fra taiwanske grønne propolis var positivt forbundet med koncentrationen af ethanol. 95% og 99,5% ethanol uddragene havde den højeste tørstof udbytte fra taiwanske grønne propolis. Det laveste tørstof udbytte fra taiwanske grønne propolis opstod når vand blev brugt som ekstraktionsmidlet. Disse resultater viser, at et organisk opløsningsmiddel, såsom ethanol, fungerer bedst for taiwanske grønne propolis udvinding. Signal af standard propolins C, D, F og G var identificeres og kvantificeres ved hjælp af HPLC (figur 1a). Signal af propolins i ethanol Uddrag var karakteriseret ved hjælp af individuelle propolin standarder og HPLC (figur 1b). Normalt, er koncentrationen af propolins (C, D, F og G) i taiwanske grønne propolis positivt associeret med ethanol koncentrationen under udvinding (tabel 1). Det størst mulige udbytte af propolins i taiwanske grønne propolis var produceret i 95% og 99,5% ethanol uddragene.

Positive repræsentative data for den antibakterielle virkning af ethanol Uddrag præsenteres i tabel 2. Antibakterielle aktivitet mod S. aureus og E. coli i ethanol Uddrag blev undersøgt. Den gennemsnitlige MIC og MBC af ethanol Uddrag for S. aureus var 10-20 µg/mL og 20 µg/mL, henholdsvis (tabel 2). Vand ekstrakter har ikke antibakterielle virkninger mod S. aureus (tabel 2). Ingen antibakterielle effekt på E. coli blev observeret med enten ethanol eller vand ekstrakter (tabel 2).

Figure 1
Figur 1: identifikation af propolins i taiwanske grønne propolis. Disse paneler viser (en) standarder for propolins og (b) måling af propolins i taiwanske grønne propolis ved hjælp af HPLC. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Opløsningsmiddel * Udbytte (%) Propolin (C + D + F + G)
(mg/mL)
99,5% EtOH 66.75 ± 0,5en** 36.73 ± 0,80en
95% EtOH 66.25 ± 0,50en 37.55 ± 1.29en
80% EtOH 64.75 ± 0,96b 34.25 ± 0,71b
70% EtOH 63.25 ± 0,96c 31.53 ± 0.31c
60% EtOH 59.00 ± 1,41d 29.34 ± 1,59d
Vand 7.00 ± 0,82e ND ***

Tabel 1: tør sag udbytte (%) og propolin indhold (mg/mL) i taiwanske grønne propolis udvundet ved hjælp af forskellige opløsningsmidler. * 10 g af propolis blev udvundet ved hjælp af 100 mL opløsningsmiddel, og uddrag blev endelig rekonstitueres til 100 mL. ** Værdierne er den gennemsnit ± standardafvigelse (SD). a-e Midler inden for en kolonne, der har ingen fælles hævet er signifikant forskellige (P < 0,05). ND = ikke opdaget. Denne tabel er ændret fra Chen et al. 8.

Uddrag Staphylococcus aureus Escherichia coli
MIC (µg/mL) MBC (µg/mL) MIC (µg/mL)
99,5% EtOH 10 20 > 640
95% EtOH 10 20 > 640
80% EtOH 20 20 > 640
70% EtOH 10 20 > 640
60% EtOH 20 20 > 640
Vand ND ND ND

Tabel 2: MIC og MBC (µg/mL) af forskellige ekstrakter mod S. aureus og E. coli. Denne tabel er ændret fra Chen et al. 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En undersøgelse rapporterede, at udblødning, ved hjælp af forskellige koncentrationer af ethanol, kunne anvendes til brasilianske propolis udvinding17; Men, processen var tidskrævende17. Det tog mindst 10 dage til at udtrække de bioaktive stoffer, såsom phenol indhold, fra brasilianske propolis17. Alternativt, ethanol udvinding i kombination med opvarmning ved 37 ° C, 50 ° C og 70 ° C i 30 min er blevet foreslået til at udtrække brasilianske propolis19,21,22. Det var fast besluttet på at bioaktive stoffer i brasilianske propolis kunne udvindes varierende alt efter procentdelen af ethanol19. Ekstraktionseffektivitet af bioaktive stoffer i propolis kan variere på grund af de forskellige kemiske sammensætninger af brasilianske propolis og taiwanske grønne propolis. Her, leverer vi en pålidelig og repeterbare protokol til at udtrække taiwanske grønne propolis. De bioaktive stoffer i taiwanske grønne propolis kunne høstes inden for 2 dage, med ethanol som opløsningsmiddel. Et lignende resultat også understøtter protokollen præsenteres her og fast besluttet på at propolins (C, D, F og G) fra taiwanske grønne propolis kunne udvindes med 95% ethanol i kombination med en 3 dages udvinding23. En anden undersøgelse viste, at 95% ethanol i kombination med en 21 h udvinding var i stand til at høste propolins fra taiwanske grønne propolis24. Men den nøjagtige koncentration af propolins efter 21 h ethanol ekstraktion skal verificeres. Forskere har foreslået, at den varme proces øger ekstraktionseffektivitet for brasilianske propolis19,21,22. Om propolins fra taiwanske grønne propolis kan udvindes ved opvarmning skal undersøges.

Ethanol Uddrag fra taiwanske grønne propolis har antibakterielle virkninger mod gram-positive patogener. Fordi propolis er hydrofobe, har undersøgelser vist, at et organisk opløsningsmiddel som ethanol er en egnet opløsningsmiddel for propolis udvinding8,16,17,18,19, 20. Undersøgelser har også vist, at en øget ethanol koncentrationen fører til mere udtrukne bioaktive stoffer8,17,18,20. I denne protokol, den maksimale tørstof udbyttet af taiwanske grønne propolis er observeret i 95% og 99,5% ethanolen ekstrakter, samt den højeste koncentration af propolins og antibakterielle aktivitet.

Denne protokol er udviklet til taiwanske grønne propolis ekstraktion med ethanol, og kvalitetsvurdering er foretaget på grundlag af indholdet af propolins. Men nogle ethanol-uopløselige bioaktive stoffer i taiwanske grønne propolis kan ikke ordentligt isoleres ved hjælp af denne protokol.

Det mest afgørende aspekt af metoden med hensyn til eksisterende metoder er, at denne metode sparer tid i forhold til metoder foreslået i andre undersøgelser17,23. Desuden udstillet 95% og 99,5% ethanol uddragene af taiwanske grønne propolis en høj koncentration af propolins og antibakterielle aktivitet.

Denne tilgang har direkte ansøgninger om kendetegner andre ukendte ethanol-opløselige bioaktive stoffer i taiwanske grønne propolis. Derudover kunne ethanol Uddrag indeholdende propolins anvendes til bestemmelse af andre bioactivities.

En af de vigtigste eksperimentelle procedurer er at sikre ensartethed af den taiwanske grønne propolis under slibningen (protokol trin 1.1). Upassende slibning af taiwanske grønne propolis kan føre til lavt tørstof udbyttet og propolin indhold. Det er vigtigt at bruge en ordentlig slibning apparater, som et krydderi kværn, væv vinkelsliber eller homogeniseringsapparat, og sørge for, at propolis bliver et fint pulver uden store partikler tilbage efter slibning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at erklære.

Acknowledgments

Dette håndskrift blev redigeret af Wallace akademiske redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ethanol Sigma-Aldrich E7023
Whatman no. 4 filter paper Sigma-Aldrich WHA1004125
methanol Sigma-Aldrich 34860
reverse phase RP-18 column Phenomenex Inc. 00G-0234-E0
Staphylococcus aureus ATCC BCRC 10780
Escherichia coli ATCC BCRC 10675
tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092
nutrient broth Sigma-Aldrich 70122
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
spice grinder Waring WSG60K
microplate Reader Molecular Devices EMAX PLUS
HPLC system Agilent 1200 Series
vacuum evaporation BÜCHI Rotavapor R-215

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zabaiou, N., et al. Biological properties of propolis extracts: Something new from an ancient product. Chemistry and Physics of Lipids. 207 (Pt B), 214-222 (2017).
  2. Bankova, V. B., De Castro, S. L., Marcucci, M. C. Propolis: Recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie. 31 (1), 3-15 (2000).
  3. Park, Y. K., Alencar, S. M., Aguiar, C. L. Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (9), 2502-2506 (2002).
  4. Chen, C. N., Wu, C. L., Shy, H. S., Lin, J. K. Cytotoxic prenylflavanones from Taiwanese propolis. Journal of Natural Products. 66 (4), 503-506 (2003).
  5. Chen, C. N., Weng, M. S., Wu, C. L., Lin, J. K. Comparison of radical scavenging activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by Taiwanese propolis from different sources. Evidence-Based Complementary and Alternative. 1 (2), 175-185 (2004).
  6. Chen, C. N., Wu, C. L., Lin, J. K. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwanese propolis. Cancer Letters. 24 (1-2), 218-231 (2007).
  7. Huang, W. J., et al. Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase-dependent apoptosis in brain cancer cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (18), 7366-7376 (2007).
  8. Chen, Y. W., Ye, S. R., Ting, C., Yu, Y. H. Antibacterial activity of propolins from Taiwanese green propolis. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 761-768 (2018).
  9. Hegazi, A. G., Abd El Hady, F. K., Abd Allah, F. A. M. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Zeitschrift für Naturforschung. 55 (1-2), 70-75 (2000).
  10. Sforcin, J. M., Fernandes, A., Lopes, C. A. M., Bankova, V., Funari, S. R. C. Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity. Journal of Ethnopharmacology. 73 (1-2), 243-249 (2000).
  11. Chen, Y. W., et al. Characterization of Taiwanese propolis collected from different locations and seasons. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88 (3), 412-419 (2008).
  12. Grange, J. M., Davey, R. W. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal of the Royal Society of Medicine. 83 (3), 159-160 (1990).
  13. Kujumgiev, A., et al. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origins. Journal of Ethnopharmacology. 64 (3), 235-240 (1999).
  14. Krol, W., Scheller, S., Shani, J., Pietsz, G., Czuba, Z. Synergistic effect of ethanol extract of propolis and antibiotics in the growth of Staphylococcus aureus. Drug Research. 43 (5), 607-609 (1993).
  15. Lu, L. C., Chen, Y. W., Chou, C. C. Antibacterial and DPPH free radical-scavenging activities of the ethanol extract of propolis collected in Taiwan. Journal of Food and Drug Analysis. 11 (4), 277-282 (2003).
  16. Tosi, B., Donini, A., Romagnoli, C., Bruni, A. Antimicrobial activity of some commercial extracts of propolis prepared with different solvents. Phytotherapy Research. 10 (4), 335-336 (1996).
  17. Cunha, I. B. S., et al. Factors that influence the yield and composition of Brazilian propolis extracts. Journal of the Brazilian Chemical Society. 15 (6), 964-970 (2004).
  18. Woo, S. O., Hong, I. P., Han, S. M. Extraction properties of propolis with ethanol concentration. Journal of Apicultural Research. 30 (3), 211-216 (2015).
  19. Park, Y. K., Ikegaki, M. Preparation of water and ethanolic extracts of propolis and evaluation of the preparations. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (11), 2230-2232 (1998).
  20. Ramanauskienė, K., Inkėnienė, A. M. Propolis oil extract: quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity. Natural Product Research. 25 (15), 1463-1468 (2011).
  21. Machado, B. A., et al. Chemical composition and biological activity of extracts obtained by supercritical extraction and ethanolic extraction of brown, green and red propolis derived from different geographic regions in brazil. PLoS One. 11 (1), e0145954 (2016).
  22. Monroy, Y. M., et al. Brazilian green propolis extracts obtained by conventional processes and by processes at high pressure with supercritical carbon dioxide, ethanol and water. The Journal of Supercritical Fluids. 130, 189-197 (2017).
  23. Popova, M., Chen, C. N., Chen, P. Y., Huang, C. Y., Bankova, V. A validated spectrophotometric method for quantification of prenylated flavanones in pacific propolis from Taiwan. Phytochemical Analysis. 21 (2), 186-191 (2010).
  24. Chen, L. H., et al. Taiwanese green propolis ethanol extract delays the progression of type 2 diabetes mellitus in rats treated with streptozotocin/high-fat diet. Nutrients. 10 (4), e503 (2018).

Tags

Biokemi spørgsmålet 143 antibakterielle aktivitet ethanol udvinding propolins Taiwan grønne propolis
Udvinding og analyse af taiwanske grønne Propolis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y.… More

Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter