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Neuroscience

इन विट्रो नियोनेटल रोडेंट ब्रेनथेम-स्पाइनल कॉर्ड और पतले स्लाइस में लयतापूर्वक-सक्रिय की तैयारी

Published: March 23, 2019 doi: 10.3791/58870
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1
1Center for Perinatal Biology, Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 2Department of Biology, The College of New Jersey, 3Department of Neurosurgery, Loma Linda University

Summary

इस प्रोटोकाल में दोनों दृष्टिहीनता से ब्रेन्हेम-स्पाइनल कॉर्ड तैयार करते हैं और एक व्यापक कदम-दर-कदम पर ब्रेन्हेम अनुप्रस्थ स्लाइस तैयार करने को स्पष्ट करते हैं । यह पुनरुत्पादन में वृद्धि करने के लिए डिज़ाइन किया गया था और व्यावहारिक, लंबे समय तक चलने, लयबद्ध-सक्रिय स्लाइस के श्वसन क्षेत्रों से तंत्रिका उत्पादन रिकॉर्डिंग के लिए प्राप्त करने की संभावना में वृद्धि ।

Abstract

स्तनधारी प्रश्वसन लय मज्जा के एक क्षेत्र में एक न्यूरोनल नेटवर्क से उत्पंन prebötzinger परिसर (pbc) कहा जाता है, जो एक संकेत प्रश्वसन मांसपेशियों के लयबद्ध संकुचन ड्राइविंग पैदा करता है । लयबद्ध तंत्रिका pbc में उत्पंन गतिविधि और अंय न्यूरोनल पूल के लिए ले जाया श्वास की मांसपेशियों को ड्राइव करने के लिए एन ब्लॉक तंत्रिका रिकॉर्डिंग और अनुप्रस्थ स्लाइस रिकॉर्डिंग सहित विभिंन दृष्टिकोणों का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है । हालांकि, पहले से प्रकाशित विधियों बड़े पैमाने पर नहीं बताया है ब्रेनिएम-स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन प्रक्रिया भविष्य के अध्ययनों के लिए एक पारदर्शी और reproducible तरीके से । यहां, हम एक विधि का एक व्यापक सिंहावलोकन प्रस्तुत करने के लिए पुनरुत्पादक-सक्रिय ब्रेनहेम के लिए आवश्यक और पर्याप्त ंयूरोनल circuitry युक्त स्लाइस में कटौती और प्रश्वसन ड्राइव संचारण के लिए इस्तेमाल किया । यह काम पिछले ब्रेनफिन पर बनाता है-रीढ़ की हड्डी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रोटोकॉल pbc, हाइपोग्लोसल premotor ंयूरॉंस (बारहवीं pmn) से न्यूरोनल उत्पादन रिकॉर्डिंग के लिए मज़बूती से व्यवहार्य और लयबद्ध-सक्रिय स्लाइस प्राप्त करने की संभावना को बढ़ाने के लिए, और अधोजिह् वा मोटर ंयूरॉंस (XII MN) । प्रस्तुत काम विस्तृत प्रदान करके पिछले प्रकाशित तरीकों पर फैलता है, विच्छेदन के कदम दर कदम चित्र, पूरे चूहे pup से, के लिए बारहवीं rootlets युक्त में विट्रो टुकड़ा ।

Introduction

ब्रेनहेम के श्वसन तंत्रिका नेटवर्क लयबद्ध तंत्रिका नेटवर्क की सामान्य विशेषताओं को समझने के लिए एक उपजाऊ डोमेन प्रदान करता है । विशेष रूप से, ब्याज नवजात कृंतक श्वास और समझ कैसे श्वास लय विकसित के विकास में है । यह एक बहु स्तरीय दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है, सहित vivo पूरे पशु plethysmography में, विट्रो एन ब्लॉक तंत्रिका रिकॉर्डिंग में, और विट्रो स्लाइस रिकॉर्डिंग है कि श्वास ताल जनरेटर होते हैं । विट्रो एन ब्लॉक और स्लाइस रिकॉर्डिंग में Reductionist एक लाभप्रद तरीका है जब श्वसन के पीछे तंत्र से पूछताछ का उपयोग कर रहे है लयथमोजेनेसिस और न्यूरल circuitry के ब्रेनहेम-रीढ़ की हड्डी के विकास के क्षेत्र में रोडेंट्स । विकासशील श्वसन प्रणाली लगभग ४० सेल प्रकार, गोलीबारी पैटर्न की विशेषता, केंद्रीय श्वसन के उन सहित1,2भी शामिल है । केंद्रीय श्वसन नेटवर्क के एक समूह में शामिल है लयकीय सक्रिय ंयूरॉन्स में स्थित रोस्ट्रल ventroपार्श्विक मज्जा1,3. स्तनधारी श्वसन लयतंत्र एक autorhythmic interneuron नेटवर्क से उत्पंन preBötzinger परिसर (pBC), जो दोनों टुकड़ा और एन ब्लॉक नवजात स्तनधारी की तैयारी के माध्यम से प्रायोगिक तौर पर स्थानीयकृत किया गया है करार दिया है ब्रेनो-स्पाइनल डोरियों3,4,5,6,7,8. इस क्षेत्र में एक समान कार्य करने के लिए सिनोअलिताल नोड (एसए) दिल में कार्य करता है और श्वसन ड्राइव करने के लिए एक प्रश्वसन समय प्रणाली उत्पन्न करता है । पीबीसी से, प्रश्वसन ताल (हाइपोग्लोसल मोटर नाभिक सहित) और रीढ़ की हड्डी मोटर पूल (जैसे कि मध्यच्छद मोटर ंयूरॉंस कि डायाफ्राम ड्राइव)9के अंय क्षेत्रों के लिए किया जाता है ।

लयबद्ध गतिविधि को ब्रेंहेम स्पाइनल कॉर्ड एन ब्लॉक तैयारियों या स्लाइस का उपयोग करके सेल की आबादी की एक किस्म से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें C3-C5 तंत्रिका rootlets, बारहवीं तंत्रिका rootlets, हाइपोग्लोसल मोटर नाभिक (XII MN), हाइपोग्लोसल premotor ंयूरॉंस (XII pMN), और पीबीसी3,10,11,12। जबकि डेटा संग्रह के इन तरीकों प्रयोगशालाओं के एक मुट्ठी भर में सफल रहा है, प्रोटोकॉल के कई एक तरह से है कि नए क्षेत्र में प्रवेश शोधकर्ताओं के लिए पूरी तरह से reproducible है में प्रस्तुत नहीं कर रहे हैं । व्यवहार्य और लययोग्य सक्रिय एन ब्लॉक और स्लाइस तैयारी प्राप्त करने के विच्छेदन और स्लाइस काटने प्रोटोकॉल के सभी चरणों के माध्यम से विस्तार के लिए एक तीव्र ध्यान की आवश्यकता है । पिछले प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर विभिंन रिकॉर्डिंग प्रक्रियाओं और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का वर्णन है, अभी तक एक व्यवहार्य ऊतक तैयारी प्राप्त करने का सबसे महत्वपूर्ण भाग में विस्तार की कमी: ब्रेन्हेम-स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन और टुकड़ा प्रक्रिया प्रदर्शन ।

कुशलता से एक लयपूर्ण सक्रिय और व्यवहार्य एन ब्लॉक या स्लाइस तैयारी ब्रेनहेम प्राप्त-रीढ़ की हड्डी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है कि सभी चरणों का सही ढंग से प्रदर्शन किया, ध्यान से, और तेजी से (आमतौर पर, पूरे यहां संबंधित प्रक्रिया हो सकता है लगभग 30 मिनट में प्रदर्शन किया) । ब्रेन्हेम-स्पाइनल कॉर्ड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रोटोकॉल है कि पहले अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया गया है के महत्वपूर्ण बिंदुओं तंत्रिका rootlets के विच्छेदन और vibratome पर टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल के लिए सबसे पहले पदश: नेत्रहीन दोनों नए शोधकर्ताओं और क्षेत्र में विशेषज्ञों के लिए ब्रेननेम-स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन संवाद है । इस प्रोटोकॉल को भी अच्छी तरह से शल्य तकनीक, स्थलों, और अंय प्रक्रियाओं के मानकीकरण में भविष्य के शोधकर्ताओं की सहायता के लिए स्लाइस और एन ब्लॉक तैयारी सटीक circuitry प्रत्येक प्रयोग में वांछित शामिल बताते हैं । यहां प्रस्तुत प्रक्रियाओं चूहा और माउस दोनों नवजात pups में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकोल को लोमा लिंडा विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु परिचर्या एवं उपयोग समिति (आईएयूसी) द्वारा स्वीकार एवं अनुमोदित किया गया है. NIH जानवरों के एथिकल ट्रीटमेंट के लिए दिशानिर्देश प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया सभी पशु प्रयोगों में पीछा कर रहे हैं । सभी नैतिक मानकों इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन व्यक्तियों द्वारा बनाए रखा गया ।

1. समाधान

  1. कृत्रिम सेरेब्रल स्पाइनल द्रव (aCSF) तैयार करें ।
    1. 1 एल बैचेस में एक प्रयोग से पहले शाम को ताजा aCSF तैयार करें निंनलिखित नुस्खा का उपयोग: ७.२५० जी NaCl (१२४ मिमी), ०.२२४ ग्राम केसीएल (3 मिमी), २.१०० जी नहको3 (25 मिमी), ०.०६९ g णः2PO4 • एच2ओ (०.५ मिमी), ०.२४७ जी mgso4 • 7h2 ओ (१.० मिमी), और ५.४१० जी डी-ग्लूकोज (30 मिमी), ०.२२१ ग्राम CaCl2 • 2h2ओ (१.५ मिमी). हमेशा CaCl2 • 2h2ओ पिछले जोड़ें ।
    2. विआयनित पानी के 1 एल में घटकों को भंग । 20-30 मिनट के लिए हलचल ।
    3. aCSF के पीएच उपाय और छोटे संस्करणों का उपयोग कर ७.४० ± ०.०२ को समायोजित (आम तौर पर < 0.5 मिलीलीटर) पतला NaOH, कोह, या एचसीएल के ।
      नोट: तैयार aCSF रेफ्रिजरेटर में भंडारित किया जा सकता है (4 डिग्री सेल्सियस, पीएच ७.४० ± ०.०२) तीन दिनों के लिए पहले जीवाणु विकास एक प्रयोग के दौरान ऊतक की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है । ०.२ μm फिल्टर का उपयोग करने के लिए कवक या प्रयोगशाला में मौजूद बैक्टीरिया द्वारा संदूषण को कम करने के बाद से प्रयोग कर सकते है ३६ एच तक पिछले । दक्षता के लिए, वर्णित aCSF नुस्खा 4 एल बैचों के लिए एक ही प्रोटोकॉल के बाद बढ़ाया जा सकता है और यह मात्रा प्रयोगों के तीन दिनों तक के लिए पिछले जाएगा ।

2. विच्छेदन और Vibratome रिग की तैयारी

  1. ब्लेड सेट करें ।
    1. एक vibratome पर ऊतक काटने के लिए एक ताजा डबल धार रेवर ब्लेड का प्रयोग करें । १००% इथेनॉल के साथ ब्लेड धोने और काटने या आधे में ब्लेड तड़क और vibratome पर बढ़ते दबाना में ब्लेड डालने से पहले विआयनीकृत पानी के साथ कुल्ला ।
    2. ब्लेड बदलें हर बार एक नया ऊतक तैयार टुकड़ा करने की क्रिया के लिए vibratome पर घुड़सवार या यदि यह पैराफिन स्लैब में कटौती करते हुए टुकड़ा करने की क्रिया है । किसी भी पैराफिन अवशेषों यह लगभग नवजात तंत्रिका ऊतक के माध्यम से सफाई से कटौती करने के लिए असंभव कर देगा ।
  2. पैराफिन मोम स्लैब की स्थापना की ।
    1. किसी भी embedding शैली पैराफिन मोम का प्रयोग करें । एक गर्मी सहिष्णु गिलास बीकर में मीडिया embedding के 10 ग्राम प्लेस और कम गर्मी का उपयोग करने के लिए तरल पैराफिन मोम मोती पिघल ।
    2. लगभग ०.५ ग्राम ग्रेफाइट पाउडर और मिश्रण समाधान अच्छी तरह से और समान रूप से तरल पैराफिन में जोड़ें ।
    3. पैराफिन के लिए सब्सट्रेट के रूप में एक छोटे प्लास्टिक स्लैब का उपयोग करें । एक छोटे (०.५-1 सेमी मोटी और लगभग 2 x 2 सेमी2 चौड़ा) प्लास्टिक के टुकड़े (polycarbonate या एल्यूमीनियम भी इस्तेमाल किया जा सकता है) में कटौती । प्लास्टिक में खांचे खरोंच करने के लिए एक machinist फ़ाइल का प्रयोग करें asthis यह सुनिश्चित करेगा कि पैराफिन प्लास्टिक का पालन करता है ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक गरम 18 जी सीरिंज सुई का उपयोग करने के लिए चादर में angled छेद जगह सुनिश्चित करने के लिए कि पैराफिन ग्रेफाइट मिश्रण प्लास्टिक का पालन करता है ।
    4. एक कपास टिप applicator के पीछे का प्रयोग करें-प्लास्टिक पर पैराफिन ग्रेफाइट मिश्रण ड्रिप करने के लिए बार से पिघला हुआ पैराफिन में applicator सूई-ग्रेफाइट मिश्रण, प्लास्टिक ब्लॉक पर घोल टपकाव, और पैराफिन ग्रेफाइट के निर्माण के लिए प्लास्टिक के शीर्ष पर मोटाई में लगभग १.५ सेमी ।
    5. एक बार पैराफिन ग्रेफाइट मिश्रण की एक पर्याप्त मोटी परत ब्लॉक पर जमा हो जाती है, एक तरफ ब्लॉक शांत करने के लिए सेट और फिर ब्रेन्हेम रीढ़ की हड्डी को समायोजित करने के लिए आकार ।

3. विच्छेदन और तंत्रिका अक्ष के अलगाव

  1. प्रारंभिक विच्छेदन और anesthetization प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट:     इस अध्ययन में प्रयुक्त पशु भ्रूण दिवस 18 से आकार में रेंज कर सकते हैं (E18) चूहों में प्रसव के दिन 10-20, या E18 से प्रसव के दिन 5/6 से लेकर चूहों. चूहों या किसी भी तनाव, उपचार, या लिंग के चूहों, प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है । एक धूआं हुड के तहत anस्थेसिया और प्रारंभिक विच्छेदन प्रदर्शन isoflurane के बाद से (एक 25 मिलीलीटर चैंबर में ०.२५ मिलीलीटर) का उपयोग किया जाता है ।
    1. पिल्ला वजन और फिर यह एक anस्थेसिया कक्ष में जगह एक 2 x 2 इंच के जाली का टुकड़ा 2 पर रखा isoflurane के ०.२५ मिलीलीटर से युक्त । के बाद पशु anस्थेसिया के एक सर्जिकल विमान तक पहुंचता है (कोई वापसी पलटा के साथ पैर की अंगुली चुटकी द्वारा सत्यापित), एक पेट्री डिश पैराफिन या सिलिकॉन elastomer से भरा पर पशु पिन ।
      नोट: नवजात कुतर भी ऑक्सीजन के साथ संतुलित13,14, आइसोफ्लूराइन वाष्पीकरण15, या इंजेक्शन16 के माध्यम से ऊपर हो सकता है ।
    2. पशु अधर पक्ष नीचे प्लेस और एक संख्या 10 या 11 स्केलपेल ब्लेड या शल्य कैंची के साथ रीढ़ की हड्डी स्तंभ के मध्य काठ का क्षेत्र के लिए सिर्फ आंखों के पीछे से एक मिडलाइन चीरा बनाते हैं । त्वचा को प्रतिबिंबित और परितल के स्तर पर जानवर decerebrate/पश्चकपाल सीवन ( चित्र 1देखें) और डायाफ्राम नीचे जानवर transecting त्वचा को हटा दें । फिर हथियारों को कैंची या स्केलपेल के साथ कंधे के जोड़ पर काट कर हटा दें ।
    3. एक बार त्वचा को हटा दिया जाता है, आगे विच्छेदन और ब्रेंहेम रीढ़ की हड्डी की तैयारी के लिए सिलिकॉन elastomerin नीचे के साथ एक छिड़काव चैंबर के लिए पशु स्थानांतरण ।
    4. बुलबुला एक acsf जलाशय (५०० मिलीलीटर साइड-पोर्ट बोतल) के साथ लगातार ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस, पीएच ७.४० ± ०.०२) acsf और आक्सीजन ९५% ओ2 और 5% सह2 के मिश्रण के साथ (भी कहा जाता है "कार्बोजेन") । विच्छेदन के दौरान, ठंडा aCSF का उपयोग करने के लिए आवधिक रूप से चैंबर फ्लश, ब्रेनेएम रीढ़ की हड्डी के अलगाव भर में ताजा oxygenated aCSF प्रदान करते हैं ।
      नोट: लाल रक्त कोशिकाओं शेष धमनियों और नसों में देखा जा सकता है और, जब पर्याप्त oxygenated, ये चमकदार लाल हैं ।
    5. ट्यूबिंग और एक stopcock के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण प्रवाह छिड़काव का प्रयोग करें, आवर्तक रूप या लगातार oxygenated acsf के साथ ऊतक शवद (बोलस मात्रा या धीमी गति से ड्रिप के माध्यम से एक stopcock का उपयोग कर, लगभग ०.५-१.० मिलीलीटर/ यह ऊतक oxygenates और एक स्पष्ट शल्य क्षेत्र का कहना है ।
    6. वैक्यूम चूषण निस्पंदन प्रणाली द्वारा की जरूरत के रूप में अतिरिक्त तरल पदार्थ निकालें ।
    7. विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग कर विच्छेदन कार्य करें । एक निरंतर ज़ूम मॉडल आवर्धन के ठीक समायोजन की अनुमति और विच्छेदन के प्रत्येक चरण के दौरान ब्याज के क्षेत्र के इष्टतम दृश्य की अनुमति के लिए पसंद है ।
      नोट: माइक्रोसर्जरी उपकरण की सिफारिश की एक रेंज शामिल दांते ऊतक forceps, कुंद forceps, #5 forceps, कोणीय ऊतक forceps, माइक्रो विदारक कैंची की एक सीमा (वसंत कैंची), और नियमित रूप से कीट और माइक्रो विदारक पिन ।
    8. सममितार्इ सीवन के साथ खोपड़ी के मध्य लाइन अनुभाग के माध्यम से मस्तिष्क बेनकाब तो माइक्रो विदारक पिन के साथ परिलक्षित फ्लैप नीचे पिन और एक 27 ग्राम का उपयोग कर विच्छेदन चैंबर के सिलिकॉन-कवर नीचे के लिए पुच्छ अंत में रीढ़ की हड्डी स्तंभ पिन सुई.
      नोट: शेष विच्छेदन के लिए एक विच्छेदन खुर्दबीन की आवश्यकता है और ऊतक के स्पष्ट दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया स्थलों के लिए ब्रेनिज्म और रीढ़ की हड्डी के कपाल rootlets पर लयबद्ध कल्पित उत्पादन प्राप्त करने की अधिकतम संभावना सुनिश्चित करने के लिए प्रयुक्त । मध्यम वसंत कैंची या आइरिस कैंची और ठीक forceps का उपयोग विच्छेदन के इन चरणों का पालन करें ।
  2. पशुओं के पृथक ट्रंक को वातित विच्छेदन कक्ष में तुरंत अंतरित करें । कक्ष के सामने का सामना करना पड़ रोस्ट्रल अंत (मस्तिष्क) के साथ ऊतक पृष्ठीय पक्ष प्लेस । कंधे पर ऊतक पिन और रीढ़ की हड्डी के सबसे पुच्छ अंत.
    1. खोपड़ी के माध्यम से एक मध्य-सैमिटल चीरा बनाने के लिए प्रांतस्था और ब्रेनहेम अंतर्निहित को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए कपाल के बाद खोपड़ी ।
      नोट: नवजात अस्थि ऊतक पूरी तरह से कैल्सिफाइड नहीं है और बहुत भंगुर है । हड्डी ऊतक एक डिग्री के लिए लचीला हो जाएगा, लेकिन आसपास के संयोजी और मांसपेशियों के ऊतकों की तुलना में मुश्किल ।
    2. मध्यम वसंत या आइरिस कैंची का उपयोग करने के लिए खोपड़ी के पश्चकपाल टांके snip, सामीतल सीवन में शुरुआत और लैटरली काम । यह खोपड़ी के "flaps" कि परिलक्षित किया जा सकता है और खोपड़ी के रोस्ट्रल भाग लंगर और ऊतक के लिए कुछ स्थिरता प्रदान करने के लिए पिन ( चित्र 2एदेखें) बनाया जाएगा ।
    3. खोपड़ी flaps को प्रतिबिंबित करने के बाद, मस्तिष्क प्रांतस्था के बाकी काट, सेरिबैलम (vermis) अपेक्षाकृत बरकरार (चित्रा 2बी) के पुच्छ भाग छोड़ने ।
  3. पृष्ठीय laminectomy प्रदर्शन ।
    1. खोपड़ी और कशेरुका स्तंभ माइक्रो स्प्रिंग कैंची और forceps का उपयोग कर आसपास के पेशियां निकालें । रिब पिंजरे के पृष्ठीय पक्ष के साथ ऊतक निकालें, रिब पिंजरे को बरकरार छोड़, क्योंकि यह बाद में अधर laminectomy के दौरान ऊतक लंगर, रीढ़ की हड्डी को नुकसान की संभावना को कम करने के लिए पिन किया जाएगा ।
    2. मध्यम वसंत कैंची या ठीक आइरिस कैंची का उपयोग कर कशेरुका लमीनी की पार्श्व प्रक्रियाओं को ध्यान से दूर snip. किसी भी ऊतक को पींस और मेडुला के ऊपर से काटें । vermis, सेरिबैलम, pons, और रीढ़ की हड्डी की शुरुआत अब स्पष्ट रूप से दिखाई देगा (चित्रा 2सी) ।
  4. अधर laminectomy प्रदर्शन ।
    1. ऊतक पृष्ठीय ओर मुड़ें और रिब पिंजरे में पिन और रीढ़ की सबसे पुच्छ अंत । खोपड़ी फ्लैप (चित्रा 3ए) का उपयोग कर नीचे ऊतक के रोस्ट्रल पक्ष पिन ।
    2. एक ही कैंची और forceps का उपयोग उरोस्थि और सभी उदर अंगों सहित, रिब पिंजरे के अधर आधा हटा दें । पसलियों और रीढ़ की हड्डी को उजागर ribcage से जुड़ी कोमल ऊतक दूर काटना (चित्रा 3बी) ।
    3. जीभ, घुटकी, श्वासनली, गला, और अन्य सभी कोमल ऊतक और खोपड़ी और स्पाइनल कॉलम ( चित्र 3गमें देखा) के आधार Overlying पेशियां निकालें ।
    4. काटना मुश्किल फूस के overlying ऊतक । खोपड़ी के आधार पर हड्डी की एक आयताकार प्लेट का पता लगाकर कठोर तातुस की पहचान करें, जो उस पर एक वि-आकृति इंडेंटेशन (चित्र 3ग) के साथ है । तालते की मिडलाइन के साथ काटें, ध्यान से ऊपर की ओर उठाएं, और इसे निकालने के लिए अनुप्रस्थ काट करें (चित्र 4a) ।
    5. एक अधर laminectomy शुरू करने के लिए लैमिनो को हटाने के द्वारा ब्रेनहेम की अधर सतह को उजागर और रीढ़ की हड्डी पहली ग्रीवा कशेरुका से लगभग वक्ष कशेरूका 7 (T7) के रूप में चित्रा 4बीमें देखा.
    6. इस स्तर पर, अधर rootlets दिखाई देगा । छोटे लघु विच्छेदन या वसंत कैंची का प्रयोग, के रूप में कटौती करने के लिए ध्यान रखना लेमिनी के करीब है और के रूप में संभव के रूप में रीढ़ की हड्डी में जड़ों से दूर ' मूल; जड़ों को खींचने से बचें ।
    7. Snip 5-10 mm में स्पाइनल कॉलम के दोनों किनारों के साथ laminae । रीढ़ की हड्डी के पास या कशेरुका में भी कटौती न करें । इस कदम को रीढ़ की हड्डी को बेनकाब करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा कशेरुका को हटाने की अनुमति देता है । rootlets काटने से बचें ।
    8. Snip rootlets लगभग 20-25 mm (द्विपक्षीय) स्पाइनल कॉलम (लगभग T7) के साथ । इस प्रक्रिया के दौरान रीढ़ की हड्डी में कटौती और कशेरुका के किनारों में हेरफेर से बचने के रूप में चित्रा 4सीमें देखा ।
    9. ध्यान से प्रत्येक कशेरुकीय के रोस्ट्रल किनारे को उठाने और हड्डी के नीचे बारीकी से snipping द्वारा C1, C2, और C3 निकालें । हड्डी के करीब है कि कटौती कर दिया है, अब rootlet । उपयोग कांटे की शकल या तुला संदंश प्रत्येक ग्रीवा कशेरुका पर एक फर्म पकड़ को प्राप्त करने में मदद करते हुए कटौती (चित्रा 4सी) ।
    10. एक बार रीढ़ की हड्डी की वांछित लंबाई अलग है और कशेरुका स्तंभ से विच्छेदार, रीढ़ की हड्डी को दूर करने के लिए एक अनुप्रस्थ काट बनाने (चित्रा 5a और चित्रा 5बी).
  5. बाडी मेटर हटा दें ।
    नोट:     अलग ब्रेंहेम-रीढ़ की हड्डी को इन विट्रो रिकॉर्डिंग में एन ब्लॉक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जैसा कि पहले बताया जा चुका है3,7. मस्तिष्कीय मेरुरज्जु से रीढ़ की हड्डी को हटाने के साथ, दउरा काट कपाल और रीढ़ की हड्डी से रिकॉर्डिंग करने के लिए सक्शन इलेक्ट्रोड के लिए इष्टतम पहुँच प्रदान करने के लिए हटा दिया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, बाडी को हटाने से यह संभव है कि आप ब्रेनहेम को साफ-सुथरा स्लाइस कर सके और इन विट्रो रिकॉर्डिंग के लिए लयबद्ध रूप से सक्रिय पतले स्लाइस प्राप्त कर सके ।
    1. ध्यान से अलग ब्रेनो-स्पाइनल कॉर्ड ऊतक पृष्ठीय पक्ष ऊपर कपाल rootles आसपास बाडी के लिए उपयोग की अनुमति के लिए पिन (चित्रा 5बी) । पिन ब्रेनो के पार्श्व मार्जिन के माध्यम से लागू किया जाना चाहिए, बारहवीं rootlets के लिए रोस्ट्रल.
    2. दउरा की पृष्ठीय सतह से बाडी को हटाकर बाडी के पृष् ठ के हाशिए पर (#5) और ठीक स्प्रिंग कैंची के साथ ब्रेस् ट की लंबाई में पार्श्व-से-मध् यस् थ से काट कर ब्रेस् को के पृष् ठ की पृष् ठ से हटा दें । खुद को ब्रेनो में काटने से बचने के लिए सावधान रहें । ब्रेनहेम की सतह से रक्त वाहिकाओं को धीरे से उठाएं और ब्रेनहेम को सेशनिंग करते समय कंपन ब्लेड की रुकावट से बचने के लिए काटें ।
    3. ध्यान से मध्यीय और ब्रेन्युम के पार्श्व पहलुओं से दउरा, कपाल तंत्रिका rootlets के रूप में बाडी के माध्यम से पारित और आसानी से दूर फट जब बाडी उठाया है । rootlets की संभावना को कम से धीरे छोटे वसंत कैंची के साथ उंहें चारों ओर काटने से खींच लिया जा रहा है ।
    4. ब्रेनहेम-स्पाइनल कॉर्ड को पलटें ताकि अधर की सतह खिल जाए और कपाल की जड़ साफ दिखाई दे । डउरा को धीरे से क्षेत्र के पोस्त्रमा पर सीधे उठाने के द्वारा ब्रेण्ड्रोम के पृष्ठीय ओर से, दउरा को काट कर, रोस्ट्रल से पुच्छ को काटना । इस क्षेत्र के perfusing microcapillaries की बड़ी संख्या के कारण क्षेत्र postrema थोड़ा गुलाबी दिखाई देगा ।
    5. किसी भी शेष बाडी को दूर करने के लिए एक महीन कीट पिन का प्रयोग करें और कपाल तथा ग्रीवा की रूटों के निकट शेष रक्त वाहिकाओं को हटा दें ।

4. स्लाइस प्रोटोकॉल

  1. बाडी हटाने के बाद, प्लास्टिक ब्लॉक (इसके बाद के रूप में संदर्भित करने के लिए "काटने ब्लॉक") पर पैराफिन मंच के केंद्र में ब्रेनस जगह । बारीक कीट पिनों का उपयोग करके, जो चित्र 5गमें दर्शाए अनुसार लंबाई में 1 बउ से अधिक की छंटनी की गई है, ब्रेनहेम के पुच्छ सिरे को डिसल स्पाइनल कॉर्ड के माध्यम से पिन करें ।
  2. पैराफिन कवर काटने ब्लॉक vibratome ब्लॉक धारक में टिकी ब्रेन्टम के साथ संरेखित करें ताकि ब्लेड ब्रेन्टम के रोस्ट्रल चेहरे के लंबवत कटौती ।
  3. एक प्रारंभिक स्लाइस को हटाने के लिए असमान, बाहरी ऊतक पर-सबसे अंत । इस प्रारंभिक कटौती २००-३०० μm आम तौर पर किया जा सकता है, लेकिन ध्यान से नौवीं, एक्स, और बारहवीं कपाल rootlets के हटाने से बचें । यह कदम आम तौर पर चेहरे के नाभिक (VII) और जिह्वा-फैरिन्जियल rootlets की पुच्छ सीमा को प्रकट करेगा और यह संभव है कि इसके चेहरे को vibratome ब्लेड के बराबर है, तो ब्रेननेम संरेखित करने के लिए बनाता है । बराबर-planarity सुनिश्चित करने के लिए और असमान है कि ऊतक को दूर करने के लिए छोटे कटौती करने के लिए आवश्यक के रूप में छोटे समायोजन करें ।
    नोट: जिह्वा (IX) rootlets ब्रेनहेम के पार्श्व किनारे पर दिखाई देगा के रूप में एक हर लगातार स्लाइस कटौती, और इन के लिए एक मील का पत्थर प्रदान करता है रोस्ट्रो-पुच्छक दूरी के लिए ब्रेननेम तंत्रिका circuitry के लिए आवश्यक ताल-पीढ़ी । ब्रेनहेम के वेंट्रल साइड पर, हाइपोग्लोसल रूलेट्स (XII) में भी नौवीं rootlets दिखाने वाले कट चेहरे को थोड़ा पुच्छ दिखाई देना चाहिए. एक अंतिम मील का पत्थर obex (मानव मस्तिष्क में जिस पर चौथा वेंट्रिकल संकरी रीढ़ की हड्डी के केंद्रीय नहर बनने के लिए बिंदु) ब्रेनहेम के पृष्ठीय चेहरे पर होगा । संदर्भ के इन तीन बिंदुओं के साथ दिखाई देते हैं, सही काटने विमान की स्थापना की है ( चित्र 6ए) और एक लयहीन-सक्रिय टुकड़ा मज़बूती से प्राप्त किया जाएगा ।
  4. जब तक नौवीं rootlets ब्रेनो के कट चेहरे की सतह के पास कर रहे हैं, तब तक रोस्ट्रल-करने के लिए caudal काटने जारी रखें ।
  5. लैंडमार्क और सही ओरिएंटेशन के लिए चित्र 6 देखें । vibratome दबाना में पैराफिन-स्लैब को समायोजित करें ताकि transection के अगले कोण एक बहुत ही मामूली "कील" आकार में कटौती टुकड़ा और लगभग १००-२०० μm के काट स्लाइस बनाने के लिए वर्णित स्थलों स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है जब तक (चित्रा 6ए) ।
    नोट: इस मामूली कील काटने के स्लाइस में कब्जा कर लिया बारहवीं मोटर ंयूरॉंस की संख्या बढ़ जाती है और रिकॉर्डिंग के दौरान लयबद्ध गतिविधि प्राप्त करने की संभावना अधिकतम । वर्णित स्थलों का उपयोग (रॉस्ट्रल rootlets से जिह्वाग्रसनी तंत्रिका बंडल, अधोजिह्वा तंत्रिका बंडल, obex से rootlets) यह सुनिश्चित करेगा कि स्लाइस reproducibly कम से कम pbc के एक बड़े हिस्से में शामिल है (चित्रा 6बी) ।
  6. पीबीसी और एसोसिएटेड ट्रांसमिशन circuitry पर कब्जा करने के लिए इन रोस्ट्रल neuroसंरचनात्मक मार्कर से ब्रेंहेम के ३००-५०० μm स्लाइस काटें ।
    नोट: एक "आदर्श" टुकड़ा हाइपोग्लोसल मूलिका बंडल की सबसे रोस्ट्रल मूलिका शामिल करने के लिए मज़बूती से सतह रिकॉर्डिंग का सहारा के बिना लय पर एक सक्शन इलेक्ट्रोड का उपयोग कर के लिए प्रश्वसन गतिविधि प्राप्त होगा/ Brainstem.

5. रिकॉर्डिंग प्रक्रियाएं

  1. एक रिकॉर्डिंग कक्ष में स्लाइस रखें, acsf के साथ लगातार शवद (०.५-१.० मिलीलीटर/मिनट) और बारहवीं rootlets से या pbc, बारहवीं pmns, या बारहवीं motoneurons से जनसंख्या गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए चूषण या extracellular इलेक्ट्रोड का उपयोग करें । विस्तृत रिकॉर्डिंग प्रक्रियाओं के लिए, ब्रेंहेम-स्पाइनल कॉर्ड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और पैच क्लैंपिंग10,11पर पिछले प्रकाशनों देखें ।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत की विधि एक शोधकर्ता के लिए एक तरह से ब्रेनहेम के लयबद्ध सक्रिय स्लाइसें प्राप्त करने में रुचि reproducibly और मज़बूती से एक व्यवहार्य, मजबूत टुकड़ा है कि कई घंटे के लिए कल्पित मोटर उत्पादन की रिकॉर्डिंग की अनुमति देगा कटौती की अनुमति देता है । उत्पंन करने के लिए ंयूनतम आवश्यक तंत्रिका परिपथ तत्वों के सभी और प्रश्वसन ताल संचारण एक पतली इस विधि का उपयोग कर स्लाइस में कब्जा कर लिया जा सकता है । इन तत्वों में शामिल हैं: preBötzinger जटिल, premotor हाइपोग्लोकल मोटर ंयूरॉंस के लिए पेश ंयूरॉंस (pXII मनसे) और हाइपोग्लोसल मोटर ंयूरॉंस (बारहवीं मनसे), और हाइपोग्लोसल तंत्रिका rootlets । pbc, xiin, और C4 तंत्रिका rootlets सामांयतः प्रश्वसन ताल रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाता है, के रूप में चित्रा 7में सचित्र ।

इस प्रक्रिया का सफल उपयोग 10-15 मिनट में एक व्यवहार्य और लयतापूर्वक सक्रिय एन ब्लॉक तैयारी, या < 30 मिनट में एक लयहीन-सक्रिय स्लाइस का उत्पादन करेगा । एन ब्लॉक ब्रेन्हेम-स्पाइनल कॉर्ड या पतले स्लाइस के अलगाव के बाद, रिकॉर्डिंग चैंबर में 15 मिनट का साम्य, काल्पनिक मोटर आउटपुट के उत्पादन के लिए पर्याप्त है । स्लाइस के मामले में, extracellular बढ़ाने [कश्मीर +] के लिए लगभग 8-9 mM मजबूत तंत्रिका ड्राइव है कि 24 के लिए पिछले कर सकते है उत्पादन होगा इस प्रयोगशाला के अनुभव में ३६ ज । तैयारी लगातार कार्बोजनरेटेड (९५% O2/5% सह2) और गरम acsf (~ 27 डिग्री सेल्सियस) के साथ superfused किया जाना चाहिए । सफल विच्छेदों का प्रदर्शन शीघ्रता से किया जाता है और रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग की जाने वाली पिचिंग, स्ट्रेचिंग या हानिकारक तंत्रिका rootlets से बचें । इष्टतम परिणामों के लिए, प्रक्रिया में सभी चरणों तेजी से किया जाता है और ऊतक स्नान किया जाना चाहिए या लगातार कार्बोजेरेटेड aCSF के साथ perfused जब विच्छेदन और ऊतक अलगाव प्रदर्शन (जैसा कि ऊपर वर्णित है) । न्यूरोएनाटॉमी और ब्रेननेम के सटीक एटलसेस के विषय में विस्तृत जानकारी के लिए कृपया रुआंगकिट्सकुल एट अल.13,14, बैलंयी15 और सहयोगियों का काम देखें । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक तरीका है कि वरिष्ठ लेखक की प्रयोगशाला में विश्वसनीय साबित कर दिया है और इस रिपोर्ट को एक ग्राफिक प्रदान करता है, इन केवल सतह पर निर्भर स्थलों पर भरोसा स्लाइस पैदा करने के लिए कदम दर कदम विधि है ब्रेनीएम या भीतर यहां के रूप में विस्तृत ब्रेनो ।

Figure 1
चित्रा 1 : ब्रेनीम-स्पाइनल कॉर्ड निष्कर्षण के लिए प्रारंभिक विच्छेदन । (क) विच्छेदन के लिए एक एनस्थेटाइज्ड पीयूपी पर टिकी डैश्ड लाइंस त्वचा और अनुप्रस्थ काट में समसादी चीरा के लिए चीरा दिशा निर्देशों का संकेत आंखों के लिए और डायाफ्राम के नीचे काऊडल कटौती । (ख) पशु से त्वचा और forelimbs को हटाने के लिए गाइड । (ग) चमड़ी वाले रोडेंट का पृष्ठीय पहलू । डैश्ड लाइंस खोपड़ी के लिए चीरा दिशा निर्देशों का संकेत-फ्लैप "सीपी" जोखिम । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : पृष्ठीय laminectomy के चरणों । (क) डैश्ड लाइनें, सेरेब्रम को हटाने के लिए चीरा दिशा-निर्देश दर्शाती हैं । (ख) ऊतक निकालने के बाद परिणाम । डैश्ड रेखाएं पृष्ठीय laminectomy के लिए चीरा दिशा निर्देशों का संकेत है । (ग) पृष्ठीय laminectomy के बाद ब्रेननेम-स्पाइनल कॉर्ड का पर्दाफाश । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रारंभिक अधर विच्छेदन के चरण । (क) एक चमड़ी वाले रोडेंट के अधर पार्श्व मस्तिष्क और उदर के साथ । डैश्ड लाइंस xyphoid प्रक्रिया को हटाने और बाद में पेट और वक्ष गुहा अंगों को हटाने के लिए रिब पिंजरे खोलने के लिए चीरा दिशा निर्देशों का संकेत । (ख) उदर और वक्ष गुहा अंगों को हटा दिया । (ग) ओरोपास्थि संरचनाओं को हटा दिया गया है । डैश्ड रेखाएं कठिन तालते हटाने के लिए चीरा दिशानिर्देश इंगित करती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : अधर laminectomy के चरणों । (क) कठोर ताकते और शेष खोपड़ी भागों को हटा दिया । चीरा दिशानिर्देश संकेत देते हैं कि ब्रेनस-स्पाइनल कॉर्ड के आसपास के बचे हुए ऊतकों को कैसे हटाया जाए । (ब) प्रथम ग्रीवा कशेरुका (ब्ब्ए) प्रखरता । (ग) C1 उठाने पर प्रदर्शन और इसे हटाने के लिए कशेरुका शरीर के लिए एक अनुप्रस्थ काट कर । नसों ध्यान से इसे हटाने से पहले कशेरुका शरीर के पृष्ठीय पक्ष को फ्लश काट रहे हैं । यह विच्छेदन में सबसे महत्वपूर्ण कदम है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 5
चित्रा 5 : टुकड़ा करने की क्रिया के लिए ब्रेनो-स्पाइनल कॉर्ड तैयार करना । (क) रीढ़ की हड्डी से निकाला गया C1-C3 । चीरा दिशा निर्देश इंगित करते हैं कि पुच्छ रीढ़ की हड्डी से ब्रेनस-स्पाइनल कॉर्ड विच्छेद कहाँ करें. (ख) ब्रेननेम-मेरुरज्जु की मेरुदण्ड के साथ-साथ लेबल वाली तंत्रिका रूटलेट्स । चीरा दिशानिर्देश ब्रेंहेम-स्पाइनल कॉर्ड क्षेत्र से रिकार्डिंग करने से पहले पोन्टो-मेंडुलरी में अनुशंसित ट्रांससेक्शन या शेष रोस्ट्रल संरचनाओं को दर्शाते हैं । (ग) vibratome पर टुकड़ा करने की क्रिया के लिए पैराफिन स्लैब सेटअप । टुकड़ा करने की क्रिया क्षेत्र कपाल नसों IX और XII के बीच ऊतक भी शामिल है । माइक्रोपिंस को टुकड़ा करने की क्रिया क्षेत्र में न रखें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 6
चित्रा 6 : एक बरकरार हाइपोग्लोमल मोटर नाभिक और PreBötzinger परिसर के साथ स्लाइस प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया स्थलों । (क) प्रारंभिक कटौती के बाद ब्रेनहेम-स्पाइनल कॉर्ड के अनुप्रस्थ दृश्य को जिह्वा (IX) रूटों के लिए रोस्ट्रल बनाया गया है । चीरा दिशानिर्देश इंगित करता है कि ट्रासेक्शन स्तर सिर्फ हाइपोग्लोसल (XII) की रूटों के लिए पुच्छ है । (ख) पीबीसी और हाइपोग्लोसल मोटर न्यूक्लियस युक्त स्लाइस को काटने से पहले ब्लेड से पैराफिन ब्लॉक का अभिविन्यास । बनाने के एक समलंबी "कील" आकार में कटौती रिकॉर्डिंग के दौरान लयबद्ध गतिविधि प्राप्त करने के लिए स्लाइस में पर्याप्त प्रश्वसन ंयूरॉंस कैप्चरिंग की संभावना अधिकतम । कील pBC शामिल होंगे, हाइपोग्लोसल premotor ंयूरॉंस, और हाइपोजिग्मल मोटर ंयूरॉंस, जो सामूहिक रूप से आवश्यक circuitry प्रदान करने के लिए लयबद्ध ड्राइव संचारित, जो श्वसन लयतंत्र का एक सूचकांक है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7 : एन ब्लॉक या स्लाइस तैयारी से प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग । (क) बारहवीं रूलेट से इंटीग्रेटेड स्ट्रेस । (ख) पीएमबीसी से एकीकृत ट्रेस । एक एन ब्लॉक तैयारी का उपयोग कर pBC से रिकॉर्डिंग एक अंधा पैच दबाना की आवश्यकता होगी । (ग) C4 तंत्रिका rootlet से एकीकृत ट्रेस । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एक एन ब्लॉक या टुकड़ा कार्यप्रवाह में यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल Adapting प्रयोगशालाओं और अध्ययन है कि या तो एन ब्लॉक ब्रेनन-रीढ़ की हड्डी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए पतले स्लाइस तैयारी का उपयोग करना चाहते है के लिए लाभप्रद है । विच्छेदन और स्लाइस विधि प्रस्तुत, पहले अंय17,18,19द्वारा सूचित विधियों के साथ संयुक्त, मजबूत और व्यवहार्य ऊतक है कि व्यापक रूप से एक सीमा के लिए अनुकूलनीय है की reproducible तैयारी की अनुमति होगी रोडेंट हिंदमस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी का उपयोग कर प्रयोगों । विच्छेदन प्रस्तुत अत्यधिक विस्तृत है और पृष्ठीय और अधर laminectomy के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ब्रेननेम के उन्मुखीकरण के बारे में व्यापक विस्तार-रीढ़ की हड्डी जब स्लाइस में कटौती की तैयारी शामिल है । विस्तृत विच्छेदन और स्लाइस प्रोटोकॉल प्रस्तुत शोधकर्ता पीढ़ी और प्रश्वसन लय के संचरण के लिए आवश्यक सभी circuitry शामिल करने के लिए अनुमति देता है । मुख्य तंत्रिका आबादी/संरचनाओं कि इस विधि का उपयोग कर कब्जा किया जा सकता है शामिल हैं: हाइपोग्लोसल premotor ंयूरॉंस, हाइपोग्लोमल मोटर नाभिक, और preBötzinger परिसर । ध्यान दें कि ब्रेंहेम के क्षेत्र जिनमें मध्य सह2 संवेदक या विस्तारक लय-सृजक परिपथ (आरटीएन/पीएफजी) हैं, को विस्तृत तैयारी में20,21तक शामिल नहीं किया गया है । एक बार एन ब्लॉक तैयारी या टुकड़ा प्राप्त किया गया है, लयबद्ध गतिविधि सक्शन इलेक्ट्रोड, सतह इलेक्ट्रोड, या एक सेल रिकॉर्डिंग विधियों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है जैसे extracellular इकाई या पैच-clamping तरीके3,10 ,11.

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य या तो एक ब्रेननेम-स्पाइनल कॉर्ड तैयार करने या एक पतली, लयहीन-सक्रिय स्लाइस पैदा करने के लिए एक स्पष्ट, आसान अनुवर्ती विधि प्रदान करना है । इस प्रोटोकॉल दोनों अनुभवी और नए अपने शस्त्राशय में लयबद्ध ब्रेनहेम/स्लाइस की तैयारी को शामिल करने में रुचि शोधकर्ताओं के लिए मूल्यवान होना चाहिए, क्योंकि वहां कई महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं है कि कब्जा की सुविधा के भीतर विस्तृत कदम हैं मज़बूत, पुनरुत्थानयोग्य, और लंबे समय तक चलने वाले लयहीन रूप से सक्रिय स्लाइस ।

एक बार शोधकर्ता संरचनात्मक स्थलों और विच्छेदन के लिए आवश्यक कौशल की पहचान के साथ सहज हो गया है, विच्छेदन की गति में वृद्धि होगी, और प्रक्रियाओं प्रत्येक व्यक्ति अन्वेषक के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल अपने पद के दौरान वरिष्ठ लेखक (CGW) को सिखाया गया था Jeffrey स्मिथ, लयबद्ध ब्रेंहेम स्लाइस तैयारी3के प्रवर्तक के साथ डॉक्टरेट काम करते हैं । दोनों स्लाइस और एन ब्लॉक तैयारी में लयबद्ध गतिविधि और व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, एक टुकड़ा उत्पन्न करने के लिए सभी प्रक्रियाओं रिकॉर्डिंग चैंबर में एक टुकड़ा करने के लिए प्रक्रिया की शुरुआत से लगभग 30 मिनट के भीतर समाप्त किया जाना चाहिए. लगातार छिड़काव के साथ, वहां ऊतक व्यवहार्यता पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है, लेकिन विच्छेदन के लिए समय को कम करने के लिए अब रिकॉर्डिंग और डेटा अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है । श्वसन अध्ययन के लिए, एक टुकड़ा है कि के रूप में पतली के रूप में लगभग २८० μm मोटी3 लयबद्ध, मजबूत प्रश्वसन गतिविधि होगा, लेकिन स्लाइसें ५५० μm17,18,19,22तक सीमा हो सकती है । सावधान अभ्यास इस प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक कौशल विकसित करने के लिए और प्रत्येक स्लाइस की मोटाई और सूक्ष्म-पुच्छ स्थिति में परिवर्तनशीलता को कम करने की आवश्यकता है । सहित या कुछ सेल आबादी को छोड़कर की गुणवत्ता और लयबद्ध गतिविधि की मजबूती को प्रभावित करेगा दोनों के रूप में बाद में रिकॉर्डिंग में उत्तेजक और निरोधात्मक नाभिक के रूप में ब्रेंस में एक टुकड़ा से रिकॉर्ड ताल की "गुणवत्ता" प्रभाव कर सकते हैं 3.

अंत में, यह भी महत्वपूर्ण है कि aCSF बिल्कुल प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार है, और एक मानकीकृत पीएच20, तापमान, और oxygenation स्तर पर है । Anoxic तैयारी लयतापूर्वक सक्रिय नहीं किया जाएगा और डेटा संग्रह21को प्रभावित करेगा ।

इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो व्यवहार्य और लयहीन ढंग से सक्रिय तैयारियों के अन्वेषक कैप्चर को सुगम बनाते हैं । अधर laminectomy के दौरान, पृष्ठीय रिब पिंजरे को बरकरार रखते हुए अतिरिक्त लाभ उठाने की अनुमति देता है और तैयारी को सुरक्षित करने के लिए और अधिक ऊतक प्रदान करता है जबकि ब्रेनहेम के अपेक्षाकृत नाजुक अलगाव-रीढ़ की हड्डी कशेरुका कॉलम से प्रदर्शन । विच्छेदन कदम यहां विस्तृत अन्वेषक आसानी से एन ब्लॉक तैयारी या पतले स्लाइस तो उत्पादन की अनुमति, आवश्यकता से, अतिरिक्त कदम है कि सिर्फ एक पतली टुकड़ा प्राप्त करने के लिए लोप किया जा सकता है विस्तृत कर रहे हैं । अंय उपयोगी सुझावों में शामिल हैं, जबकि अधर laminectomy प्रदर्शन, यह कशेरुका शरीर पर एक फर्म पकड़ हासिल करने के लिए यह ऊपर उठा, जबकि तंत्रिका rootlets विच्छेद महत्वपूर्ण है । एक बार ब्रेनहेम-स्पाइनल कॉर्ड को विच्छेदी और निकाले जाने के बाद, ड्यूरा मेटर और शेष वैस्कूचर को तंत्रिका ऊतक की सतह से विच्छेद किया जाना चाहिए । रक्त वाहिकाओं और दउरा कठिन कर रहे हैं और एक साफ टुकड़ा काटने से vibratome ब्लेड को रोकने कर सकते हैं । बाडी के विच्छेदन एन ब्लॉक तैयारी के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन तंत्रिका-सक्शन इलेक्ट्रोड युग्मन का अनुकूलन करने के लिए सिफारिश की है । अंत में, vibratome के उपयोग में सावधान और व्यवस्थित अभ्यास एक साफ, reproducible टुकड़ा काटने के लिए आवश्यक है । इस प्रोटोकॉल विच्छेदन और काटने प्रक्रियाओं के लिए विस्तृत चरणों की एक बहुत व्यापक सूची प्रदान करता है । यहां जोर एक अन्वेषक के लिए एक कदम दर कदम विस्तृत सूची प्रदान करने के लिए एक विश्वसनीय नींव और प्रशिक्षण उपकरण है जिसमें से वे जरूरत के रूप में अपनी प्रयोगशाला प्रक्रियाओं को संशोधित कर सकते हैं के रूप में उपयोग करने के लिए है ।

एक पूरे के रूप में, इस पद्धति का प्रतिनिधित्व करता है एक तीस साल के तरीकों के विकास विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में । इस पत्र की गुंजाइश एन ब्लॉक और स्लाइस ब्रेनिज्म के मानकीकरण पर केंद्रित है-रीढ़ की हड्डी रिकॉर्डिंग है कि आम तौर पर P0-P5 चूहों और22चूहों में प्रश्वसन गतिविधि का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, इस विच्छेदन प्रक्रिया पशु आकार, उंर की एक श्रृंखला में उपयोग किया जा सकता है, और प्रजातियों के अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए, E18 चूहों/चूहों, नवजात चूहों और चूहों सहित (प्रसवोत्तर दिन 0 से 6), और वयस्क चूहों । भविष्य के अध्ययन प्रजातियों और उंर भर में प्रोटोकॉल को कारगर बनाने के लिए प्रस्तुत विधियों का उपयोग कर सकते हैं, दोनों प्रजातियों और उंर में ताल पीढ़ी या अंय शारीरिक प्रक्रिया में तंत्र पूछताछ के लिए अध्ययन की अनुमति । अंत में, झुकाव, मोटाई, या स्लाइस या एन ब्लॉक तैयारी के स्थान बदल लयबद्ध गतिविधि23को प्रभावित करेगा । व्यापक साहित्य पिछले में प्रकाशित किया गया है तंत्रिका आबादी स्लाइस प्रक्रियाओं द्वारा कब्जा कर लिया और वहां stereotaxic चूहा और माउस को और अधिक विस्तार प्रदान करने के लिए उपलब्ध है तंत्रिका circuitry के विषय में यहां पर चर्चा की है24, 25,26. यहां प्रस्तुत प्रक्रियाओं स्पष्ट चित्र है कि एक नए अन्वेषक एक प्रयोगशाला विदारक गुंजाइश के तहत आसानी से दिखाई लैंडमार्क से लयबद्ध स्लाइस में कटौती करने के लिए सीखने की अनुमति के साथ व्यापक विस्तार प्रदान करते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एस. बी. पी एक Loma लिंडा विश्वविद्यालय ग्रीष्मकालीन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप के एक प्राप्तकर्ता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४५ ब्रेननेम-स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन vibratome sectioning एन ब्लॉक रिकॉर्डिंग इन विट्रो स्लाइस कपाल rootlets ग्रीवा rootlets लयबद्ध रूप से सक्रिय स्लाइस श्वसन पैटर्न पीढ़ी
इन विट्रो नियोनेटल रोडेंट ब्रेनथेम-स्पाइनल कॉर्ड और पतले स्लाइस में लयतापूर्वक-सक्रिय की तैयारी
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Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

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