इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शन कैसे Astyanax mexicanus वयस्कों नस्ल, लार्वा जुटाने के लिए, और पोस्ट-लार्वा मछली पर पूरे माउंट immunohistochemistry प्रदर्शन करने के लिए सतह और गुफा phenotypes की morphotypes तुलना करें ।
Astyanax mexicanus के नदी और गुफा-अनुकूलित आबादी आकृति विज्ञान, फिजियोलॉजी, और व्यवहार में अंतर दिखाएँ । वयस्क रूपों की तुलना पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान इन मतभेदों में से कुछ के आनुवंशिक आधार से पता चला है । कम के बारे में जाना जाता है कि आबादी के बाद लार्वा चरणों में अलग (खिलाने की शुरुआत में) । इस तरह के अध्ययनों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है कैसे cavefish अपने प्राकृतिक वातावरण में वयस्कता के माध्यम से जीवित रहते हैं । प्रयोगशाला में लार्वा विकास के बाद की तुलना के लिए तरीके मानकीकृत जलीय कृषि और खिला शासन की आवश्यकता है । यहां हम वर्णन कैसे पोषक तत्वों की एक आहार पर मछली बढ़ाने के लिए गैर में-परिसंचारी पानी के लिए दो हफ्तों के बाद निषेचन के लिए जल rotifers । हम इस नर्सरी प्रणाली से पोस्ट-लार्वा मछली इकट्ठा करने और पूरे माउंट immunostaining प्रदर्शन करने के लिए कैसे प्रदर्शन करते हैं । Immunostaining एक mexicanusमें विकास और जीन समारोह की जांच के लिए transgene अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक आकर्षक विकल्प है । नर्सरी विधि भी वयस्कों में विकास के लिए घनत्व मिलान आबादी की स्थापना के लिए एक मानक प्रोटोकॉल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
मैक्सिकन टेट्रा, Astyanax mexicanus, मछली की एक प्रजाति है कि नदी के रूप में मौजूद है आबादी (सतह मछली) और गुफा के एक नंबर आवास आबादी (cavefish) गुफाओं वे निवास के लिए नाम (यानी, Tinaja, Molino, Pachón) । शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या का उपयोग कर रहे हैं एक. mexicanus व्यवहार के आनुवंशिक और विकास के ठिकानों की जांच करने के लिए1,2,3,4, चयापचय5,6 ,7, 8, और रूपात्मक विकास9,10,11। a. mexicanus की पढ़ाई के लिए उपलब्ध संसाधन एक अनुक्रम और व्याख्या जीनोम12शामिल हैं; transcriptome13; विकास स्टैगिंग तालिका14; और15,16,17प्रजनन के लिए तरीके,18transgenics बनाने, और संपादन जीन19। अतिरिक्त उपकरणों के प्रसार और अद्यतन मानक प्रोटोकॉल cavefish अनुसंधान समुदाय के विकास में तेजी लाने (इस तरीके संग्रह20देखें) होगा ।
हमारा लक्ष्य प्रयोगशालाओं के बीच तुलनीय तरीके से, पोस्ट-लार्वा a. mexicanusमें सीटू में जीन गतिविधि का आकलन करने के लिए एक सुदृढ़ विधि प्रदान करके उपकरणों की मौजूदा प्रदर्शनियों को जोड़ने का है. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए दो चुनौतियाँ हैं. पहले, वहां के लिए मानकीकृत सरकारों के लिए एक की जरूरत है सेने और प्रयोगशालाओं के बीच मछली स्थापना, जैसे कि भोजन और घनत्व को प्रभावित विकास और परिपक्वता के रूप में मानकों में अंतर है, जिससे जीन गतिविधि प्रभावित । दूसरा, वहां के बाद लार्वा मछली में जीन गतिविधि के पैटर्न की जांच के लिए एक मानकीकृत अभी तक अनुकूलनीय विधि के लिए एक की जरूरत है । हम इन मुद्दों पर यहां पता, के बाद लार्वा चरणों के लिए मछली स्थापना के लिए मानक प्रथाओं की स्थापना और एक मजबूत पूरे-माउंट immunohistochemistry (आइएचसी) एक. mexicanusमें जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का परिचय ।
हम पहले प्रदर्शित कैसे प्राकृतिक के माध्यम से मछली नस्ल को पैदा करने और निषेचित अंडे की पहचान । अगले वर्णित है कैसे निषेचित अंडे (लार्वा) हैच और उंहें नर्सरी कंटेनरों, जहां वे दो सप्ताह के लिए कंटेनर प्रति 20 मछली के एक घनत्व पर recirculat या पानी बदलने के बिना बनाए रखा जाता है हस्तांतरण के लिए । 5 दिनों के बाद निषेचन, मछली के बाद लार्वा चरणों (अब एक जर्दी की आपूर्ति होने) विकसित किया है और शैवाल खिलाया Brachionus plicatilis (rotifers) एक पोषक तत्व युक्त खाद्य स्रोत है कि दैनिक भरपाई की आवश्यकता नहीं के रूप में प्रदान की जाती हैं । इस विधि लार्वा और पोस्ट-लार्वा विकास के लिए लगातार वृद्धि मापदंडों प्रदान करता है ।
जीन समारोह का आकलन करने के लिए, हम प्रदर्शन कैसे नर्सरी कंटेनरों से मछली निकालने के लिए और पूरे माउंट आइएचसी प्रदर्शन । आइएचसी विधि प्रस्तुत ढाणियो rerio21 के साथ प्रयोग के लिए विकसित प्रोटोकॉल से अनुकूलित है और सभी A. mexicanus ऊतकों परीक्षण में एंटीजन की जांच के लिए प्रभावी है, मस्तिष्क सहित, आंत, और अग्ंयाशय. आइएचसी जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण की परीक्षा के लिए ट्रांसजेनिक पशुओं पैदा करने के लिए एक तेजी से विकल्प है । यह प्रोटोकॉल ए. mexicanus उगाने के उद्देश्य से अध्ययनों के लिए उपयोगी होगा और पश् लार्वा चरणों में सतह मछली और cavefish के phenotypes की तुलना करना ।
सतह और गुफा ए mexicanus के बीच जीन गतिविधि की तुलना सावधानी से नियंत्रित पर्यावरणीय मापदंडों और विधियों कि प्रयोगशालाओं में दोहराया जा सकता है की आवश्यकता है । mexicanus स्थापना के लिए हमारे प्रोटोकॉल के बाद लार्वा विकास के दौरान लगातार पोषण सामग्री प्रदान करता है । इस खिला शासन के बाद, जीन समारोह आत्मविश्वास से आबादी के बीच की तुलना में मजबूत immunohistochemistry प्रोटोकॉल हम वर्तमान का उपयोग कर सकते हैं । यहां हम इस विधि के महत्व के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपनी सीमाओं और भविष्य के अनुप्रयोगों पर चर्चा।
घनत्व मिलान वृद्धि प्राप्त करने के लिए, हमने पाया है कि पोस्ट-लार्वा मछली rotifers के एक आहार पर १.५ एल कंटेनरों में दो सप्ताह के लिए पानी के बिना परिसंचारी उठाया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल भी एक परिसंचारी प्रणाली पर मछली उठाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, rotifers टैंक बहिर्वाह के माध्यम से खो उन लोगों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए दैनिक जोड़ा जाना चाहिए । नव रचा Artemia nauplii सामांयतः जलीय कृषि में एक खाद्य स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है, लेकिन हमने पाया है कि rotifers का उपयोग काफी फायदे हैं, सहित: कम कीमत, बेहतर सुरक्षा, लगातार पोषण, और पानी की गुणवत्ता में सुधार (नीचे देखें) ।
सबसे पहले, उपभोग्य सामग्रियों में साप्ताहिक लागत rotifers के लिए 4 डॉलर है, Artemiaके लिए 14 डॉलर की तुलना में । जैविक सुरक्षा के बारे में, rotifers प्रयोगशाला में नियंत्रित परिस्थितियों में उठाया जाता है, जबकि Artemia जंगली से एकत्र कर रहे हैं और माइक्रोबियल या रोगज़नक़ सामग्री23में प्राकृतिक भिन्नता के अधीन । इसके अतिरिक्त, Artemia nauplii के पोषक तत्वों की संरचना पर्यावरण की दृष्टि से निर्धारित कर रहे है और इसलिए असंगत । Nauplii सेने के बाद अपने स्वयं के ऊर्जा भंडार पर पनपे; वे जल्दी से पोषण मूल्य ढीला के रूप में वे विकसित और इष्टतम कई घंटे के भीतर मछली को खिलाया जाना चाहिए । Artemia 12 घर के बाद सेने में खिला शुरू, पहली बार है कि वे पोषण समृद्ध हो सकता है का प्रतिनिधित्व; हालांकि, इस स्तर पर वे 5 dpf मछली के लिए बहुत बड़े हो गए है भस्म । इसकी तुलना में rotifers लगातार उच्च पोषक तत्व सामग्री में जिसके परिणामस्वरूप समुद्री सूक्ष्म शैवाल पर फ़ीड की परवाह किए बिना जब rotifers काटा जाता है । Rotifers Artmeia nauplii (१६० बनाम ४०० माइक्रोन) की तुलना में बहुत छोटे हैं, उन्हें आसानी से मछली पकड़ने और निगलने के लिए बना । पोस्ट-लार्वा सतह मछली और cavefish समान मात्रा में rotifers का उपभोग करने के लिए वरीयता या rotifers10पर कब्जा करने की क्षमता में कोई अंतर नहीं का सुझाव ।
अंत में, Artemia nauplii शुरू होने के बाद कई घंटे ताजे पानी में मरने लगते हैं । खाया nauplii क्षय होगा, तेजी से पानी की गुणवत्ता कम अगर वे मैंयुअल रूप से नहीं हटा रहे हैं । मृत Artemia को हटाना समय लेने वाली और पोस्ट-लार्वा मछली है कि Artemia से ज्यादा बड़ा नहीं कर रहे है और गलती से हटा दिया या घायल हो सकता है के लिए खतरनाक है । Rotifers नर्सरी कंटेनरों में अनिश्चित काल तक रह सकते है और पानी की गुणवत्ता को काफी प्रभावित किए बिना हर समय मछली को भोजन प्रदान करते हैं ।
जबकि एक खाद्य स्रोत के रूप में rotifers का उपयोग काफी लाभ है, rotifer शेयर बनाए रखने के लिए, शैवाल संस्कृति प्रणाली के लिए दैनिक जोड़ा जाना चाहिए । यह एक स्वचालित फीडर है कि rotifer संस्कृति कंटेनर में तरल शैवाल तिरस्कृत ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ प्राप्त किया जा सकता है । Rotifers भी संस्कृति के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए हर 24-48 घंटे इस सेट से काटा जाना चाहिए । शोधकर्ताओं कि नस्ल मछली बहुत अक्सर (एक बार एक साल, उदाहरण के लिए) और के बाद में आबादी के बीच तुलना बनाने के साथ संबंध नहीं है लार्वा चरणों एक खाद्य स्रोत के रूप में Artemia पसंद कर सकते हैं, के बाद से encysted भ्रूण किसी भी समय रचा जा सकता है ।
हम हैच और जीवित लार्वा की संख्या पर नज़र रखने के लिए सेने और विकास की सफलता पर नजर रखने की सलाह देते हैं । अगर ज्यादातर भ्रूण या लार्वा मर जाते हैं, तो यह जीवाणु या फंगल प्रदूषित होने के कारण हो सकता है । यह मछली के पानी की गुणवत्ता के लिए तैयार पानी की निगरानी और ७०% इथेनॉल के साथ किसी भी उपकरण को निष्फल करने की सिफारिश की है । नर्सरी कंटेनरों फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद वे साफ कर रहे है और निष्फल । रोग के जोखिम को कम करने के लिए, यह भी नर्सरी कंटेनरों से किसी भी मृत मछली को हटाने और 5 dpf से पहले rotifers नहीं जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है, जब मछली खाने के लिए शुरू ।
ए mexicanus लगभग एक वर्ष की उंर में यौन परिपक्व हैं । यह ढाणियो rerio (zebrafish) है कि 10-12 सप्ताह24में नस्ल कर रहे है की तुलना में ट्रांसजेनिक a. mexicanus पैदा करने के लिए एक सीमा है । Immunohistochemistry (आइएचसी) जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण की जांच करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल हर कदम पर अनुकूलित किया जा सकता है और ब्याज की किसी भी ऊतक में एंटीजन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, तथापि, कि कुछ ऊतकों को और अधिक हो सकता है की सतह मछली रंजकता के कारण में कल्पना मुश्किल (एक बाधा है कि विवर्णीय cavefish में मौजूद नहीं है), जो तुलनात्मक अध्ययन की व्याख्या को प्रभावित कर सकते हैं । इस संभावित समस्या का पता करने के लिए, सतह मछली वर्णक 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग कर निर्धारण के बाद ब्लीच किया जा सकता है ।
आइएचसी सफल ऊतक निर्धारण, अवरुद्ध, और एंटीबॉडी पैठ की आवश्यकता है । प्रत्येक के लिए तरीके ऊतक और ब्याज के प्रोटीन के आधार पर बदलती हैं । निर्धारण और निर्धारण समय प्रतिजन epitope बनाए रखते हुए सेल वास्तुकला की रक्षा करना चाहिए । इस प्रोटोकॉल के लिए, हम क्रॉस-लिंक करने वाले निर्धारण (paraformaldehyde) का उपयोग करते है और denaturing निर्धारण (जैसे मेथनॉल या एसीटोन) को छोड़ देते हैं । हमने पाया है कि एसीटोन में मशीन न्यूरॉन और अग्नाशय मार्करों के लिए एंटीबॉडी संकेत कम. अवरुद्ध कदम ऊतक में गैर लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्यकारी से एंटीबॉडी को रोकने के लिए आवश्यक है । इस विधि का एक संयोजन का उपयोग करता है सामांय सीरम (5%) और BSA (०.२%) ब्लॉकिंग समाधान में । अवरुद्ध समाधान एंटीबॉडी और प्रोटीन है कि ऊतक में प्रोटीन पर प्रतिक्रियाशील साइटों के लिए बाध्य होते हैं, कम गैर प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन ।
एंटीबॉडी प्रवेश प्राप्त करने के लिए, ऊतक permeabilized होना चाहिए । यह डिटर्जेंट या denaturing सॉल्वैंट्स के साथ प्राप्त किया जा सकता है लेकिन प्रतिजन epitope संरक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । हमारे प्रोटोकॉल ट्राइटन और dimethyl sulfoxide (DMSO) के संयोजन का उपयोग करता है । ट्राइटन और DMSO ०.५% और 1%, क्रमशः की सांद्रता पर अवरुद्ध और एंटीबॉडी गर्मी कदम के दौरान शामिल हैं । इस एकाग्रता का उपयोग करना, हम मस्तिष्क में दाग देखा है, अग्ंयाशय, आंत, और मांसपेशी, सुझाव है कि यह सभी ऊतकों के प्रवेश के लिए प्रभावी होने की संभावना है । मछली का आकार भी पैठ को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल है कि 14 दिनों से अधिक पुराने है मछली पर परीक्षण नहीं किया गया है (लगभग 7 मिमी लंबाई में) । धुंधला होने का निवारण करने के लिए, यह निर्धारण, अवरुद्ध, और एंटीबॉडी प्रवेश कदम को बदलने के लिए सिफारिश की है । यह भी महत्वपूर्ण है कि immunogen के mexicanus प्रोटीन के साथ के अनुक्रम संरक्षण की जांच करने के लिए उपलब्ध जीनोम25का उपयोग कर ब्याज की ।
ए mexicanus एक उत्कृष्ट एक ही प्रजाति है कि नाटकीय रूप से अलग वातावरण में विकसित किया है की आबादी के रूप में विकास की जांच मॉडल है सीधे प्रयोगशाला में तुलना में किया जा सकता है । मानक पशुपालन प्रोटोकॉल, दोनों के भीतर और प्रयोगशालाओं के बीच, सतह मछली और cavefish के बीच जैविक मतभेदों को समझने के लिए आवश्यक हैं । हमारे लेख के बाद लार्वा में विकास और जीन गतिविधि की जांच करने के लिए एक विधि प्रदान करता है लगातार विकास के मापदंडों को उजागर मछली ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [HD089934, DK108495] से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
Antibodies | |||
insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |