Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Charakterisierung von einem Trans- Cyclooctene (TCO)-modifizierte Antikörper und einem 177-Lu-Label kurz (Tz) Radioligand für pretargeted Radioimmuntherapie (Gewinn). Darüber hinaus enthält sie die Verwendung von diesen beiden Konstrukte für in Vivo Bioverteilung und längs Therapiestudien in einem Mausmodell des kolorektalen Karzinoms.
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Methodenartikel
Pretargeted Radioimmuntherapie basierend auf die Inverse Elektron Nachfrage Diels-Alder-Reaktion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Während Radioimmuntherapie (RIT) einen vielversprechenden Ansatz für die Behandlung von Krebs ist, kann die lange pharmakokinetische Halbwertszeit von radioaktiven Antikörper hohe Strahlendosen auf gesundes Gewebe führen. Vielleicht haben es überrascht nicht, verschiedene Strategien entwickelt, um diese beunruhigende Einschränkung zu umgehen. Eines der vielversprechendsten Ansätze ist pretargeted Radioimmuntherapie (Gewinn). Gewinn gründet sich auf Entkopplung Radionuklids aus dem Immunglobulin, Injektion von ihnen getrennt und dann erlauben sie, in Vivo im Zielgewebe zu kombinieren. Dieser Ansatz nutzt die außergewöhnliche Tumor-targeting Eigenschaften der Antikörper während Sockelleiste ihre pharmakokinetischen Nachteile, dadurch Senkung der Strahlenbelastung für Nichtziel-Gewebe und erleichtert den Einsatz von Radionukliden mit Halbwertszeiten, die als zu kurz für Einsatz in traditionellen Radioimmunoconjugates. In den letzten fünf Jahren haben unser Labor und andere ein Ansatz zur in-Vivo pretargeting basierend auf die inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder (IEDDA) Reaktion zwischen Trans- Cyclooctene (TCO) und kurz (Tz) entwickelt. Diese Strategie erfolgreich angewendet wurde, pretargeted Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und Single Photon Emission Computertomographie (SPECT) Bildgebung mit einer Vielzahl von Antikörper-Antigen-Systemen. Wir haben in ein paar Neuerscheinungen die Wirksamkeit des IEDDA-basierte Gewinn in murinen Modellen Duktales Pankreaskarzinom und kolorektalen Karzinom gezeigt. Wir beschreiben in diesem Protokoll Protokolle für Gewinn mit einem 177-Lu-DOTA-Label kurz Radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz) und einer TCO-modifizierte Variante des colorectal Krebses Ausrichtung auf huA33 Antikörper (huA33-TCO). Genauer gesagt, beschreiben wir den Bau der huA33-TCO, Synthese und enzymatische [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz, und die Leistung der in Vivo Bioverteilung und längs Therapiestudien in murinen Modellen der kolorektalen Karzinom.
Einleitung
Radioimmuntherapie (RIT) – die Verwendung von Antikörpern für die Lieferung von therapeutischen Radionuklide zu Tumoren – schon seit langem ein verlockender Ansatz zur Behandlung von Krebs1,2. In der Tat hat dieses Versprechen durch die United States Food and Drug Administration Zulassung von zwei Radioimmunoconjugates für die Behandlung von Non-Hodgkin Lymphom unterstrichen worden: 90Y-Ibritumomab Tiuxetan und 131-Tositumomab3 , 4. aber auch von ihren Anfängen, die klinische Perspektiven der RIT durch eine wichtige Komplikation b....
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Protokoll
Alle in Vivo Tierversuche in dieser Arbeit beschriebenen wurden nach genehmigten Protokolle durchgeführt und ausgeführt nach den ethischen Richtlinien der Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center und Hunter College Institutionelle Pflege der Tiere und Nutzung Ausschüsse (IACUC).
1. die Vorbereitung der huA33-TCO
Hinweis: Die Synthese von huA33-TCO wurde bereits berichtet29. Jedoch für den Leser zu erleichtern, ist es hier mit Anpassungen für optimale Bedingungen repliziert.
- In einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch, bereiten die 125 μL Lösung (....
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Ergebnisse
Die Konjugation des TCO, huA33 beruht auf der Kopplung zwischen den Amin-reaktive TCO-NHS und die Lysin-Rückstände auf der Oberfläche der Immunglobulin. Diese Methode ist sehr robust und reproduzierbare und zuverlässig liefert eine Grad-der-Kennzeichnung von 2-4 TCO/mAb. In diesem Fall wurde MALDI-ToF-Massenspektrometrie eingesetzt, um ein Maß für die Kennzeichnung von ca. 4,0 TCO/mAb zu bestätigen; ein ähnlicher Wert wurde mit einem Fluorophor-modifizierte kurz als ein Reporter
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Diskussion
Eine der Stärken dieses Ansatzes zu in Vivo pretargeting — vor allem in Bezug auf Strategien auf Bispezifische Antikörper ausgesagt und radioaktiv Haptens – ist seine Modularität: Trans- Cyclooctene Moieties können angehängt werden, um Antikörper und kurz Radioligands kann mit einer außergewöhnlichen Vielfalt von Radionukliden ohne Beeinträchtigung ihrer Reaktionsfähigkeit mit ihren Partnern klicken Sie radioaktiv sein. Die Anpassung dieses Konzepts auf andere Antikörper/Antigen-System ist noch nicht so.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Jacob Houghton für hilfreiche Gespräche. Die Autoren auch möchte die NIH für ihre großzügige Finanzierung (R00CA178205 und U01CA221046).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| (E)-Cyclooct-4-enyl-2,5-dioxo-1-pyrrolidinylcarbonat (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | lagern: -80 &de; C |
| 2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoat (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Bei -80 ° lagern; C |
| Acetonitril (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Ammoniumacetat (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
| Boc-PEG7-amin (O-(2-aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylenglykol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Bei -20 & deg lagern; C |
| Dichlormethan (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO), wasserfrei | Fisher Scientific | D12345 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-2 Zentrifugalfiltereinheit | Fisher | Scientific UFC205024 | |
| GE Healthcare Einweg-PD-10-Entsalzungssäulen | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| N, N-Dimethylformamid (DMF), wasserfrei | Fisher Scientific | AC610941000 | |
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x konzentrierte |
| p-SCN-Bn-DOTA | Makrozyklika | B-205 | Bei -20 &de; lagern; C |
| Triethylamin (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoressigsäure (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
| Tumormessgerät | Peira TM900 | Peira TM900 |
Referenzen
- Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
- Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Anti....
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Nachdrucke und Genehmigungen
