Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren in einem virusbasierten Dual-Fluoreszenz-markierten Tumor-Xenograft-Modell unter Verwendung von Larvenzebrafischen als Wirte. Dieses heterogene Xenograft-Modell imitiert die Gewebezusammensetzung der Mikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs in vivo und dient als präziseres Werkzeug zur Beurteilung von Arzneimittelreaktionen in personalisierten zPDX-Modellen (Zebrafish Patient-derived xenograft).

Zusammenfassung

Patienten-abgeleitetes Tumorxenograft (PDX) und zellabgeleitetes Tumorxenograft (CDX) sind wichtige Techniken für die präklinische Bewertung, Medikationsberatung und grundlegende Krebsforschung. Generationen von PDX-Modellen in traditionellen Wirtsmäusen sind zeitaufwändig und arbeiten nur für einen kleinen Teil der Proben. In letzter Zeit hat sich zebrafish PDX (zPDX) zu einem einzigartigen Wirtssystem entwickelt, mit den Eigenschaften von klein und hoch effizient. Hier beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Erzeugung eines dualen fluoreszenzmarkierten Tumor-Xenograft-Modells zur vergleichenden Chemotherapie-Bewertung in zPDX-Modellen. Tumorzellen und Fibroblasten wurden aus frisch geerntetem oder gefrorenem Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe unter verschiedenen Kulturbedingungen angereichert. Beide Zellgruppen wurden durch Lentivirus mit grünen oder roten fluoreszierenden Proteinen sowie einem Anti-Apoptose-Gen BCL2L1gekennzeichnet. Die transfizierten Zellen wurden vorgemischt und in die 2 dpf Larvenzebrafische mitinjiziert, die dann in modifiziertem E3-Medium bei 32 °C gezüchtet wurden. Die Xenograft-Modelle wurden mit Chemotherapie-Medikamenten und/oder BCL2L1-Hemmern behandelt, und die Viabilitäten von Tumorzellen und Fibroblasten wurden gleichzeitig untersucht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll es Forschern ermöglicht, schnell eine große Menge an zPDX-Modellen mit einer heterogenen Tumormikroumgebung zu generieren und bietet ein längeres Beobachtungsfenster und eine genauere Quantifizierung bei der Bewertung der Effizienz von Wirkstoffkandidaten.

Einleitung

Die Präzisionsonkologie zielt darauf ab, die vorteilhaftesten therapeutischen Strategien für den einzelnen Patienten zu finden¹. Derzeit werden zahlreiche präklinische Modelle wie In-vitro-Primärkultur, In-vitro-Organoidkultur²und patientenabgeleitete Xenografts (PDX) bei Mäusen vor oder nach der Organoidkultur zur Diagnose und zur Prüfung/Bewertung des Potenzials vorgeschlagen. therapeutische Entscheidungen³. PDX-Modell durch die Injektion von menschlichen primären Krebszellen in immungeschwächte Mäuse generiert, ist eines der vielversprechendsten Werkzeuge für personalisierte Arzneimittel-Screen....

Protokoll

Alle tierischen Verfahren wurden genehmigt und folgten den Richtlinien der Animal Ethics Committee an der Fudan University und alle Proben von Bauchspeicheldrüsenkrebs wurden vom Fudan University Shanghai Cancer Center bezogen. Die Ethikkommission der FUSCC erhielt die ethische Zustimmung, und jeder Patient erhielt die schriftliche Zustimmung in Kenntnis der Sachlage.

1. Vorbereitung der Ausrüstung für die Mikroinjektion

1. Vorbereitung der Injektionsplatte.
   1. Bereiten Sie eine 50 ml Lösung von 1% Agarose gelöst in E3-Lösung (0,6 g/L Aquariensalz in doppelt destilliertem Wasser + 0,01 mg/L Methylenblau). Die....

Ergebnisse

Eine schematisierte Gliederung der Prozedur ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, die primären Krebsgewebezellen wurden nach der Verdauung mit oder ohne Zugabe von Pankreaskrebs-Fibroblasten in das gesamte Medium eingesät. Krebszellen und Fibroblasten wurden als zwei verschiedene Populationen angereichert, die Fibroblasten ohne Inhibitoren dominierten, und das Wachstum von Krebszellen setzte sich nach der Zugabe von Inhibitoren durch (

Diskussion

Sowohl PDX- als auch CDX-Modelle sind wichtige Plattformen im Bereich der Tumorbiologie²², und der entscheidende Schritt einer erfolgreichen Tierübergreifenden Transplantation ist die Verbesserung des Überlebens des Xenografts.  Kürzlich haben einige Studien gezeigt, dass die transiente Expression von BCL2L1 (BCL-XL) oder BCL2 die Lebensfähigkeit menschlicher embryonaler Stammzellen in Mäusewirten signifikant verbessern kann, ohne die Zellidentitäten und Schicksale zu be.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	GIBCO	C11995500BT
FBS	Hyclone	sv30087.03
Y-27632	Cliniscience	Y0503	Rho-Kinase-Inhibitor
Primocin	invivogen	ant-pm-1	ein Antibiotikum für primäre Zellkulturen
Putrescindihydrochlorid	Sigma	P5780
Nicotinamid	Sigma	N3376
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15140122.00
Phosphatpuffer (PBS)	GIBCO	C10010500CP
HBSS	GIBCO	14170112.00
Kollagenase Typ IV	GIBCO	17104019.00
Hyaluronidase	Sigma	H3884
Dnase I	Sigma	D5025
Insulin	Sigma	I9278
b-FGF	GIBCO	PHG0264
EGF	GIBCO	PHG0314
Fibroblastenhemmer bei Bauchspeicheldrüsenkrebs	CHI Scientific	FibrOUT
0,45 μ m Sterilfilter	Millipore	SLHV033RB
Konzentrationssäule	Millipore Millipore	UFC910008	Konzentrat das Virus
Polybrene	Sigma	H9268
Hyaluronsäure Natriumsalz	Sigma	H7630
L-Glutamin	GIBCO	21051024.00
Gemcitabin	Gemzan
Methylcellulose	Sigma	M0262
Navitoclax(ABT-263)	Selleck	S1001	Bcl-xL Inhibitor
Equipment
Microinjector	NARISHIGE
Stereomikroskop	OLYMPUS	MVX10
Konfokalmikroskop	LEICA	SP8	0,00

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