Summary
Vi beskriver prosedyrer for behandling av nyfødte rotte hjernen vev for å få høyoppløselig elektron micrographs for morphometric analyse av Synaptic vesicle distribusjon på nerve terminaler. Micrographs innhentet med disse metodene kan også brukes til å studere morfologi av en rekke andre cellulære komponenter og deres dimensjonale strukturelle relasjoner.
Abstract
Vårt laboratorium og mange andre har utnyttet den høye løse kraften i overføring elektron mikroskopi å studere morfologi og romlig organisering av Synaptic blemmer. For å oppnå høy kvalitet elektron micrographs som kan gi graden av morfologiske detaljer er nødvendig for kvantitativ analyse av pre-Synaptic vesicle fordeling, er optimal prøveforberedelse kritisk. Kjemisk fiksering er det første skrittet i prosessen med forberedelse av prøver, og av største viktighet for å bevare fin Ultrastructure. Vaskulær fiksering med en glutaraldehyde-formaldehyd løsning, etterfulgt av behandling av vibratome-delt prøver med Osmium tetroxide, stabiliserer maksimalt antall molekyler, spesielt proteiner og lipider, og resulterer i overlegen bevaring av Ultrastructure. Tissue blir deretter behandlet med counterstaining, sekvensiell dehydrering og harpiks-innebygging. En blokk farging med uranylnitratet acetate (dvs. farging av vibratome-delt vev før harpiks Embedding) forbedrer endogene kontrasten og stabiliserer celle komponenter mot ekstraksjon under prøve behandling. Kontrasten kan økes ytterligere ved å påføre uranylnitratet acetate som et post-flekken på ultratynne seksjoner. Double-farging av ultratynne seksjoner med bly citrate etter uranylnitratet acetate behandling også forbedrer bildeoppløsning, ved å intensivere elektron-opacity av nukleinsyre syre-inneholdende strukturer gjennom selektiv binding av bly til uranylnitratet acetate. Transmission Electron mikroskopi er et kraftig verktøy for karakterisering av morfologiske detaljer av Synaptic blemmer og kvantifisering av deres størrelse og romlig organisasjon i terminalen Bouton. Men fordi den bruker fast vev, kan overføring elektron mikroskopi bare gi indirekte informasjon om levende eller utviklende prosesser. Derfor bør andre teknikker vurderes når Hovedmålet er å studere dynamiske eller funksjonelle aspekter av Synaptic vesicle smugling og exocytosis.
Introduction
Vi beskriver metoder for utarbeidelse av nyfødte rotte hjernevev for å oppnå høy kvalitet elektron micrographs for grundig morphometric analyse av Synaptic vesicle romlig fordeling på nerve terminaler1,2. Høy kontrast micrographs som kan oppnås ved å behandle prøver som følge av disse metodene kan også brukes til å studere den detaljerte morfologi av en rekke cellulære komponenter og deres dimensjonale strukturelle forhold3,4.
Overføringen elektronmikroskop (TEM) er et kraftig verktøy for å studere morfologi av organeller og andre cellulære strukturer kvantitativt. Fra og med dette tiåret, er det ingen andre metoder for etterforskning som kan gi samme grad av oppløsning av lipid membraner og organeller uten Immuno-merking, med unntak av cryofixation ved høyt trykk frysing. Men fryse substitusjon teknikker er ikke mye brukt, og normalt krever dyrt utstyr og lang forberedelse ganger.
For å dra nytte av TEM høy løse kraft, er optimal prøveforberedelse av største betydning. De viktigste målene for prøven forberedelse er å bevare vev struktur med minimal endring fra den levende tilstand, forbedre prøven kontrast, og stabilisere vevet mot ekstraksjon av cellulære komponenter under behandling og eksponering for elektron Stråle. Tallrike protokoller for TEM-vevs forberedelser har blitt innført og perfeksjonert av flere laboratorier gjennom årene. Mange av dem har fokusert på metoder for optimal visualisering av Synaptic blemmer5,6,7,8,9,10,11. Blant en rekke veletablerte, gull standard metoder som er i bruk, vi valgte prosedyrer for kjemisk fiksering, post fiksering, en blokk farging, sekvensiell dehydrering, harpiks innebygging og post flekker som tar sikte på å bevare optimal vev struktur og oppnå utmerket bilde kontrast. Av notatet, bevaring av fine Ultrastructure kan være spesielt utfordrende når du arbeider med nyfødte rotte hjernevev. Faktisk er det sentrale nervesystemet av svært unge dyr preget av en høyere vanninnhold enn den voksne hjernen, mer fremtredende utvidelse av ekstracellulære mellomrom, og løsere forbindelser mellom cellene12. Dette gjør nyfødt rotte hjernevev dypt følsomme for endringer i OSMOLARITETSSYSTEM, og utsøkt utsatt for artifactual krymping og/eller hevelse når de behandles gjennom sekvensielle løsninger av ulike tonisitet12. Derfor våre metoder ansatt løsninger for prøve behandling som er av OSMOLARITETSSYSTEM så nær som mulig til at av rotte nyfødte hjernen. Vårt mål var å få høykvalitets, høyoppløselig elektron mikroskopi bilder for kvantitativ vurdering av Synaptic vesicle romlig distribusjon på nerve terminaler. Nærmere bestemt har vi søkt å måle antall blemmer i nerve terminalen, avstanden Synaptic blemmer fra pre-Synaptic plasma membran, antall blemmer forankret på pre-Synaptic membran, størrelsen på Synaptic blemmer og mellom vesicle avstander1.
Tilfredsstillende kjemisk fiksering er en forutsetning for å oppnå høykvalitets elektron micrographs som kan gi de morfologiske detaljer som er nødvendige for å studere Synaptic vesicle morfologi og romlig organisasjon. Selv om flere moduser av fiksering eksisterer, fiksering av hjernevev ved vaskulær blod er desidert overlegen andre metoder. Siden fiksering via vaskulær blod starter umiddelbart etter arrestasjonen av systemisk sirkulasjon, forkorter det intervallet mellom deoxygenation av hjernevevet og krysskobling av proteiner med fiksativene, noe som resulterer i minimale endringer i celle Struktur. Videre oppnår det rask og ensartet penetrasjon, på grunn av den raske flyten av bindemiddel fra vaskulær seng til ekstracellulære og cellulære rom12,13,14. Primær fiksering med glutaraldehyde, etterfulgt av sekundær fiksering (etter fiksering) med Osmium tetroxide, gir utmerket bevaring av den fine strukturen15,16,17. En blanding av glutaraldehyde og paraformaldehyde har den ekstra fordelen av raskere penetrasjon inn i vevet12.
Siden biologisk vev ikke er tilstrekkelig stive til å bli skåret i tynne seksjoner uten støtte fra en harpiks matrise, må de bygges inn i et medium før tynn snitting. Vann-ublandbare epoxy harpiks er ofte brukt som en embedding medium i TEM. Når denne typen matrise brukes, må alle prøve fritt vann erstattes med et organisk løsemiddel før harpiks infiltrasjon. Vann fjernes ved å sende prøven gjennom en rekke løsninger av stigende konsentrasjoner av etanol og/eller aceton12. I denne protokollen, prøvene er første flat innebygd mellom fleksible aclar ark, deretter innebygd i en kapsel. Det endelige resultatet er vev som ligger på spissen av en sylindrisk harpiks blokk, som har den ideelle geometrien til å være minst påvirket av vibrasjoner som oppstår under mikrotomen snitting.
Farging med tungmetaller for å forbedre endogene vev kontrasten er en annen viktig del av prøven forberedelse. Bildekontrasten i TEM skyldes elektron spredning av atomer i vevet. Imidlertid består biologiske materialer i stor grad av lav Atom vekt molekyler (dvs. karbon, hydrogen, oksygen og nitrogen). Derfor krever generering av tilstrekkelig spredning kontrast inkorporering av høy Atomic vekt atomer i cellulære komponenter av vevet. Dette oppnås gjennom farging av prøven med tungmetaller12,18,19. Osmium tetroxide, uran og bly, som binder sterkt til lipider, er de vanligste tungmetaller brukes som elektron flekker.
Osmium (atomnummer 76) er en av de tetteste metaller i eksistens. Det er både en bindemiddel og en flekk, selv om den primære rolle i TEM er som en pålitelig bindemiddel12. Blant ulike fiksering protokoller i bruk, metoden for dobbel fiksering med glutaraldehyde etterfulgt av Osmium er den mest effektive i å redusere ekstraksjon av celle bestanddeler under prøven forberedelse. Disse to fiksativene brukes til å stabilisere det maksimale antall ulike typer molekyler, spesielt proteiner og lipider, og resultere i overlegen bevaring av vev Ultrastructure12,14,15, 16 flere , 17av dem.
Uran (atomnummer 92) er det tyngste metallet som brukes som elektron beis, vanligvis i form av uranylnitratet acetate. På samme måte som Osmium, fungerer den som en flekk og bindemiddel, selv om den primære rolle i tem er som en flekk på20,21. Nukleinsyre acid-inneholdende og membranous strukturer er sterkt og fortrinnsvis beiset med uranylnitratet salter i aldehyd-faste vev22,23. Behandling av vev med uranylnitratet acetate etter osmication og før dehydrering resulterer i stabilisering av membranous og nukleinsyre syre-inneholdende strukturer, så vel som forbedret kontrast, og tillater identifisering av noen strukturelle detaljer som ikke ville lett oppdages i prøver beiset med Osmium alene12,24,25. Det er antatt at uranylnitratet acetate kan stabilisere den fine strukturen ved å kombinere med reduserte Osmium som har blitt avsatt på lipid membraner under osmication24. Maksimal kontrast oppnås når uranylnitratet acetate påføres før embedding og som en post-flekken i tynne seksjoner12.
Bly (Atomic nummer 82) er den vanligste flekken som brukes for TEM og er hovedsakelig ansatt for post-farging av tynne seksjoner. Bly salter har høy elektron tetthet og viser affinitet for et bredt spekter av cellulære strukturer, inkludert membraner, kjernefysiske og cytoplasmatiske proteiner, nukleinsyre syrer og glykogen26,27. Når den doble farging metoden er ansatt (dvs. farging med uranylnitratet acetate etterfølges av behandling med bly), sistnevnte fungerer som en utvikler av uranylnitratet acetate farging. For eksempel, bly post-farging av kromatin fast med glutaraldehyde øker uranylnitratet acetate opptak av en faktor på tre28,29,30,31,32. Bly også forbedrer farging formidles av andre metaller som Osmium. Det er antatt at bly salter flekker på membraner av Osmium-fast vev ved å feste til Polar gruppen av fosfatid i nærvær av reduserte Osmium33. En potensiell ulempe for farging med både uranylnitratet acetate og bly, spesielt for langvarig varighet, er at mange ulike strukturelle elementer er farget likt og ikke-spesielt, og dermed kan ikke være lett skilles fra hverandre12 .
Den nylige innføringen av alternative lyskilder, slik som i optisk super oppløselig bilde-aktivert lokalisering mikroskopi, har betydelig forbedret lys mikroskopi oppløsning34. Men fordi lys mikroskopi er avhengig av histochemical og immune-cytokjemiske metoder for å visualisere individuelt merkede proteiner eller enzymer, er kraften i TEM å vise alle strukturelle elementer samtidig uovertruffen for dyptgående studie av morfologi og dimensjonale relasjoner av vev strukturer. Spesielt ingen annen teknikk kan gi morfologiske detaljer er nødvendig for å utføre morphometric analyse av Synaptic vesicle distribusjon på pre-Synaptic nerve boutons. Likevel er det viktig å merke seg at elektron micrographs fange strukturen i vevet etter at organismen dør, og derfor kan de ikke gi informasjon om dynamikken i pre-Synaptic vesicle smugling og exocytosis. Derfor bør andre verktøy, slik som FM Dye-Live Imaging og patch-Clamp elektrofysiologi, vurderes når Hovedmålet er å studere dynamiske og/eller funksjonelle aspekter ved Synaptic vesicle smugling og exocytosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee ved University of Virginia (Charlottesville, VA) og gjennomføres i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer.
1. fiksering av vaskulær
Merk: En generell beskrivelse av metoden for rotte hjernen vaskulær blod er allerede beskrevet i denne tidsskriftet13 og er utenfor omfanget av denne protokollen. Men følgende trinn er spesifikke for utarbeidelse av nyfødte rotte hjernevev å få høy kvalitet elektron micrographs for kvantitativ analyse av Synaptic blemmer distribusjon på pre-Synaptic terminaler.
-
Forbered 4% paraformaldehyde
- Plasser 800 mL 0,1 M fosfat buffer (PB) i et glass beger på 2 liter på en røring plate under en avtrekksvifte. Varmes opp til ca. 60 ° c uten koking av buffer.
- Tilsett 40 g paraformaldehyde pulver. Rør kontinuerlig
- Mens måling pH, tilsett små dråper 10 N NaOH til løsningen klarner. Endelig pH bør være 7,2-7.4.
- Legg resterende 0,1 M PB til et endelig volum på 1 L. Avkjøl, Filtrer med en 0,45 μm membran og oppbevar ved 4 ° c over natten.
Merk: Forbered frisk paraformaldehyde dagen før.
Forsiktig: Inhalering av aldehyd damper kan forårsake nese symptomer og irritasjon av luftveiene. Kontakt med huden forårsaker dermatitt. Aldehyder skal håndteres i en avtrekksvifte mens du bruker hansker, en beskyttende kappe og vernebriller
-
Forbered Tyrode løsning
- Plasser 1 L destillert vann i et glass beger på en røring plate. Legg til NaCl (8 g), KCl (0,15 g), CaCl2 (0,1 g), MgCl2 (0,006 g), NaH2PO4 (0,055 g), NaHCO3 (1 g) og druesukker (1 g) i begeret.
- Rør kontinuerlig og måle pH. Hold pH mellom 7,2 og 7,4.
Merk: Tyrode løsning er også kommersielt tilgjengelig.
- Bland 4% paraformaldehyde med glutaraldehyde ved en endelig konsentrasjon på 2%. Tilsett 40 mL elektron mikroskopi-grade 50% glutaraldehyde til 1 L av 4% paraformaldehyde. Bland godt i en gripende plate
Merk: Ca 100 mL av paraformaldehyde-glutaraldehyde bindemiddel løsningen er nødvendig for å perfuse kroppen til en nyfødt rotte. Derfor, det vil si 10 nyfødt rotter kan perfusert med 1 L av bindemiddel. Ikke bland paraformaldehyde og glutaraldehyde før like før bruk. Bring alle løsninger til romtemperatur før - Når tilgang til venstre ventrikkel har blitt oppnådd (se hele dyre blod protokoll13), skyll det vaskulære systemet med Tyrode løsning for 30 s ved et trykk på 120 mmHg.
Merk: Suksessen av blod, avhenger delvis av fullstendig utelukkelse av blodet fra vaskulær seng - Skyll med paraformaldehyde-glutaraldehyde-oppløsning med samme trykk i 10 min.
Merk: Vedlikehold av konstant trykk er viktig for å unngå innføring av artefakter. Dessuten, temperaturen av det perfusate burde ikke være neden det rotten ' kropp temperatur å unngå vasokonstriksjon - Fjern den faste hjernen fra skallen og plasser i frisk paraformaldehyde-glutaraldehyde bindemiddel ved 4 ° c over natten.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her.
2. Brain kutting
- Bygg inn den faste hjernen i 4% agarose og lim hjernen-agarose blokk på en vibratome scene
Merk: Andre laboratorier har fått god kvalitet seksjoner ved å oppnå en stabil blokk på vibratome uten agar støtte - Snitt skiver 50 μm tykkelse. Sett mikrotomen til lav frekvens og hastighet.
Merk: Seksjoner kan lagres i 0,1 M PB med 0,05% natrium Natriumazid ved 4 ° c i flere år. - Plasser seksjonene i 0,1 M PB i en Petri-rett, Undersøk seksjonene under et disseksjon mikroskop og velg prøver for innebygging
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
3. skylle
Merk: Det er viktig å skylle prøven etter fiksering med aldehyder og før etter fiksering med Osmium, siden rest fiksativene kan produsere Osmium precipitates
- Pipetter 0,1 M PB i et kort hetteglass i bred munn med hette. Plasser én prøve i hvert hetteglass. Dekk helt til prøven slik at den ikke tørker.
Merk: Oppbevar prøver i samme hetteglass fra dette trinnet gjennom alle løsnings endringer av fiksering, dehydrering og infiltrasjon, til de er klare for flat innebygging. - Skyll prøven i 0,1 M PB i 3 min x 2, og fjern deretter PB med en micropipette.
Merk: Siden hjernen til den nyfødte rotta er dypt følsom for endringer i OSMOLARITETSSYSTEM12,35,36,37, utføre vasker i samme kjøretøy som det som brukes i bindemiddel blanding
4. etter fiksering med Osmium
-
Fremstilling av Osmium tetroxide (OsO4)
Merk: Dette forfatterens laboratorium benytter OsO4 4% leveres i en vandig løsning i glass ampuller (5 ml av OsO4 4% i H2O). Andre laboratorier har brukt OsO4 krystaller vellykket. Det er imidlertid nødvendig med flere timer for å oppløse OsO4 krystaller i et kjøretøy.- Ta 5 mL (en ampullen) på 4% OsO4/H2O, åpne den og plasser den i en brun glass flaske
Merk: OsO4 er et sterkt oksidasjonsmiddel og lett redusert ved eksponering for lys. Du kan unngå reduksjon under tilberedning ved å plassere OsO4 i en brun glass flaske - Tilsett 5 mL 0,2 M PB. Dette vil gi 10 mL 2% OsO4/0,1 M PB.
Merk: Siden hjernen til den nyfødte rotta er svært følsom for endringer i OSMOLARITETSSYSTEM, bruk samme buffer for å forberede aldehyd fiksativene og OsO4 løsning12,35,36,37 - Tilsett ytterligere 10 mL 0,1 M PB. Dette vil gi en endelig løsning på 20 mL 1% OsO4 i 0,1 m PB.
- Bruk en 20 mL sprøyte utstyrt med en lang nål for å trekke 1% OsO4 og legg den i en brun glass flaske eller et scint hetteglass dekket med aluminiumsfolie.
Forsiktig: OsO4 er ekstremt flyktig og røyken er giftig for nese, øyne og svelg. Alt arbeid skal utføres i en avtrekksvifte ved hjelp av hansker og verneklær, og ingen kroppsdeler bør utsettes for OsO4. Behandling og avfallshåndtering bør gjøres i henhold til institusjonens retningslinjer. Oppbevar den ubrukte OsO4 i en tett korket brun glass flaske med Teflon liner på glass proppen, Pakk flasken i dobbel aluminiumsfolie og oppbevar den i en dessicator. I nærvær av lekkasje røyk kan OsO4 misfarges innvendige flater og innholdet i kjøleskapet. Under de ovennevnte lagringsforhold er OsO4 Solution stabil i flere måneder. Når løsninger blir oksidert under lagring, blir de grå, i så fall må de kastes.
- Ta 5 mL (en ampullen) på 4% OsO4/H2O, åpne den og plasser den i en brun glass flaske
- Legg til 1% OsO4 i 0,1 M PB i hetteglasset med prøven og la sitte i 1 h. Pakk OsO4 etter 1 time med micropipette.
Merk: Før du påfører OsO4 til seksjonen, er det viktig å utfolde og flate ut prøven. Unngå påføring direkte på toppen av prøven, bruk i stedet veggene på hetteglasset til forsiktig å dryppe OsO4 til bunnen av hetteglasset. Prøven blir brun og stiv kort tid etter OsO4 anvendelse. Håndter forsiktig fra nå av for å unngå vevskader
5. skylle
Merk: Det er viktig å skylle prøven etter fiksering med OsO4 og før dehydrering, siden resterende fiksativene kan reagere med dehydrering agenter37.
- Skyll med 0,1 M PB i 3 min x 3.
Merk: Siden hjernen til den nyfødte rotta er svært følsom for endringer i OSMOLARITETSSYSTEM, utføre vasker i samme kjøretøy som det som brukes i bindemiddel blanding12,35,36,37. - Plasser den Osmium løsningen og de første to PB skyllinger i OsO4 avfall og kast den i henhold til institusjonens retningslinjer.
6. sekvensiell dehydrering og farging med Uranylnitratet acetate
Merk: Dette forfatterens laboratorium bruker vann-ublandbare epoxy harpiks for innebygging. Når epoxy harpiks brukes, må alle eksemplar gratis vann erstattes med et organisk løsemiddel før infiltrasjon av embedding medium. Vann fjernes ved å sende prøven gjennom en rekke løsninger av stigende konsentrasjoner av etanol og aceton12.
-
Fremstilling av uranylnitratet acetate (UA)
- Plasser en 200 mL volum glass kolbe som inneholder 100 mL EtOH 70% på en røring plate.
- Tilsett 4 g av UA til flasken. Pakk i aluminiumsfolie (UA precipitates når de utsettes for lys) og rør kontinuerlig.
Merk: UA oppløses langsomt og ufullstendig i 70% EtOH. Tillat uoppløste krystaller til å slå seg ned før du bruker løsningen. UA-løsning bør filtreres med et 0,45 μm-filter før bruk. UA kan tilberedes på forhånd og oppbevares i en brun flaske innpakket i aluminiumsfolie ved 4 ° c i månedsvis.
Forsiktig: UA er mildt radioaktivt og svært giftig. Innånding av UA pulver kan føre til øvre luftveier lidelser og sykdom i lungene, lever og nyrer. UA er farlig når den svelges eller når den kommer i direkte kontakt med hud og slimhinner. Alt arbeid skal utføres i en avtrekksvifte ved hjelp av hansker og verneklær. Behandling og avfallshåndtering bør gjøres i henhold til institusjonens retningslinjer.
- Tørke i 50% EtOH i 1 min. Fjern 50% EtOH før du legger til UA.
-
Legg til 4% UA i 70% EtOH. La sitte i 1 time eller over natten. Hvis natten, plasser i kjøleskapet ved 4 ° c.
Merk: hetteglasset for å unngå EtOH fordampning og dekk med aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lys. Protokollen kan stanses midlertidig her.- Kast UA-avfall og de to følgende skyllinger i henhold til institusjonens retningslinjer
- Tørke i 70% EtOH i 1 min.
- Tørke i 90% EtOH i 5 min.
- Tørke i 100% EtOH i 5 min x 2.
- Skyll prøven i aceton i 2 min x 3.
7. infiltrasjon og innebygging
Merk: Vev er ikke tilstrekkelig stive til å bli skåret i tynne seksjoner uten ytterligere støtte fra en harpiks matrise. Derfor må infiltrasjon og innebygging komme før snitting12.
-
Fremstilling av EPON harpiks
- Bruk en 60 mL gavage sprøyte. Fjern sprøytestempelet og hetten sprøyten med en sikkerhetsnål.
- Plasser sprøyten med den åpne siden opp og Legg volumet av hver ingrediens i harpiks Mix trinnvis. Tilsett 22 mL av embed-812 (harpiks). Tilsett DDSA (Herder) til et samlet volum på 37 mL. Tilsett NMA (Herder) til et samlet volum på 50,5 mL. Tilsett 525 μL av DMP-30 (akselerator) med en pipette. Flytt stempelet av pipette svært langsomt som DMP er svært tyktflytende.
Merk: det er viktig å legge til reagensene som skal bygges inn, i den angitte rekkefølgen. Akseleratoren (DMP-30) må legges til sist. For å få en herdet blokk som har de ønskede egenskaper, er det avgjørende å bruke den nøyaktige mengden av herder og gasspedalen. Ferskt forberedt embedding blandinger foretrekkes. - Sett stempelet tilbake og plasser sprøyten på en rocker med kontinuerlig risting i minst 30 min. farge endres fra gult til gult.
Merk: Alle ingrediensene må blandes veldig grundig. Unnlatelse av å gjøre dette resulterer i ujevn impregnering av vevsprøven og en blokk av ujevn hardhet
- Bland 1 bind med EPON harpiks med 1 volum aceton i et scint hetteglass og rist for å blande. Påfør 1:1 EPON: aceton blandingen på vevet etter fjerning av den siste aceton skylling. Hold dekket for å unngå aceton fordampning. Fjern 1:1 blanding av harpiks og aceton etter 2-4 h eller holde over natten.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. - Erstatt blandingen av harpiks og aceton med full harpiks. La sitte i 4 timer eller over natten. Sett alt EPON avfall i en oppsamlingsbeholder under panseret som skal polymerisert og kastes senere.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her.
8. flat-innebygging
Merk: Prøvene er flat-innebygd mellom to aclar filmer på en sandwich-lignende måte.
- Skjær to rektangulære stykker av klart aclar ark. Tørk av filmene rene med EtOH 70%. Trim arkene slik at det er minst 1,5 cm av vev-fri plast på hver side av seksjonen. Det aclar arket på toppen skal ha samme bredde som bunnen, og høyden bør være omtrent to tredjedeler av det nederste arket.
- Vipp hetteglasset langsomt med prøven og løft vevet forsiktig ned fra bunnen av hetteglasset.
- Bruk en mikro fleksibel slikkepott og en fin pensel til å nøye flytte den delen langs hetteglass vegger og overføre til aclar arket.
Merk: Håndter seksjoner forsiktig for å unngå prøveskade. - Plasser det aclar arket på toppen av prøven forsiktig.
Merk: Kontroller at det er nok harpiks mellom de to arkene til å forsegle sandwich- - Trykk forsiktig ut eventuelle innestengte luftbobler uten å utøve direkte trykk på delen. Tørk ut overflødig EPON.
Merk: Eliminering av luftbobler er viktig, som deres tilstedeværelse gjør visualisering av prøven vanskelig og svekker stabiliteten av harpiks obligasjoner. - Merk arkene med en løsemiddel resistent penn og plasser i ovnen ved 60 ͦC for 2-3 dager til polymeres.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her.
9. Capsule embedding
Merk: Ultramicrotomes leveres med Chucks for å holde sylindriske blokker innhentet fra embedding eksemplarer i kapsler. Sylindriske blokker har den ideelle geometrien til å være minst påvirket av vibrasjoner som oppstår under snitting.
- Forsiktig åpne klemt aclar filmer. Prøven vil følge en av de to aclar arkene.
- Bruk en løsemiddel resistent penn for å markere siden av aclar arket som inneholder seksjonen. Merk nær vevet.
Merk: Det er viktig å utføre dette trinnet før punching ut vevet av interesse. - Bruk en plate punch for å få en sirkel prøve av seksjonen. Pennen merket skal være en del av hullet ut vev.
- Klargjør hetten på en kapsel side med innebygging opp på en kapsel holder. Plasser en dråpe harpiks på lokket.
- Plasser hullet på innsiden av hetten med vevs delen vendt opp. Penne merket vil lyse når lyset shined på prøven.
- Sett en kapsel inn i hetten og bruk fin pinsett for å sette inn merkingen. Rull og senk et trykt 2 cm langt papir inn i kapselen. Gjør etiketten for å passe til krumning av sideveggene i kapselen. Vent til polymerisering er ferdig, slik at etiketten blir permanent innebygd i harpiks.
- Hell den innebygde harpiks inne i kapselen og fyll til kanten av kapselen.
- Skyv vevsprøven ned til bunnen av kapselen ved hjelp av en spiss tre pinne og plasser i ovnen ved 60 ° c i 2-3 dager.
Merk: Pass på å ikke trykke på vevet for hardt, i stedet la det ligge løst slik at et tynt lag av embedding medium er til stede mellom vevet og kapselen overflaten. Protokollen kan stanses midlertidig her.
10. trimming av blokk Face
Merk: Liten størrelse og passende fasong på blokk ansiktet er forutsetninger for tilfredsstillende snitting. Derfor er trimming av prøveblokken en nødvendighet.
- Bruk en skarp en-kant barberhøvel blad. Rengjøres med aceton umiddelbart før bruk.
- Monter kapsel blokken i en blokk holder og plasser blokk holde ren på scenen i en stereomikroskopet.
Merk: Den trimming prosedyren bør utføres under mikroskop kikkert og skrå belysning. - Fjern det aclar arket fra tuppen av kapselen ved hjelp av et barberblad. Det aclar arket vises som et skinnende lag under lys av dissekere omfang.
- Hold barberbladet i en vinkel på 45 grader og gjør kutt ned fire sider av kapselen blokken.
Merk: Bedre kontroll over trimming oppnås hvis bladet holdes med begge hender. - Lag korte kutt slik at blokken tar form av en kort pyramide med vegg vinkler på ca 45 °.
Merk: Prøven ansiktet støttes mye bedre hvis sidene fører til det holdes kort. Hvis blokk tuppen er for tynn og lang, vil den vibrere under tynn snitting. Ideelt sett bør det området av interesse være sentrert i blokken ansiktet. - Trim tuppen av kapselen for å forkaste overflødig vev og bare bevare området av interesse.
Merk: Ingen del av seksjonen bør være uten vev, som variasjoner i tettheten av blokken ansiktet er en viktig årsak til vanskeligheter i snitting. Ideelt sett bør overflatearealet av kapselen ansiktet ikke være mer enn 1 mm2. - Trim kapselen ansiktet i form av en scalene trapes. Fordi i en scalene trapes ingen side er lik, er denne formen best å orientere området av interesse i forhold til resten av prøven.
Merk: Under snitting støttes den trapes-formede ansiktet mye bedre enn noen annen form.
11. mikrotomen snitting
Merk: Flertallet av biologiske prøvene er for tykke i sin naturlige tilstand til å bli gjennomsyret av et elektronstråle. Derfor må materialet kuttes i tynne seksjoner som kan bli penetrert av elektron bjelken.
- Skjær tynne seksjoner (sølv forstyrrelser farge, 600-900 å) på en ultramicrotome på fly parallelt med overflaten.
- Plasser inndelingene på rutenett. Denne forfatterens Lab bruker kobber nett av 3,05 mm i ytre diameter.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
12. post-farging med Uranylnitratet acetate
- Forbered 2% UA i destillert vann. Plasser en 200 mL volum glass kolbe som inneholder 100 mL destillert vann på en røring plate. Tilsett 2 g av UA til flasken. Pakk i aluminiumsfolie (UA precipitates når de utsettes for lys) og rør kontinuerlig.
Merk: For detaljer om UA-forberedelse, se avsnitt 6 i denne protokollen. - Plasser flere individuelle dråper med 2% UA på et rent ark med Dental voks i en Petri parabolen.
- Float rutenettet med prøven (delen side ned) på en dråpe UA i 25 min.
Merk: Float hvert rutenett på en egen dråpe UA. - Hold rutenettet på kanten med pinsett og skyll to ganger under en mild stråle av kokt destillert vann ved romtemperatur fra en plast vask flaske.
Merk: Ikke la rutenettet tørke før farging med bly.
13. post-farging med bly
- Forbered en CO2-Free CHAMBER (co2 i luften er den viktigste kilden til bly nedbør). Plasser et stykke filter papir fuktet med 1 N NaOH i en Petri parabolen. Plasser et lite ark med ren Dental voks på toppen av filteret papir og plassere flere NaOH pellets på den ene siden av fatet. Dekk fatet.
Merk: Forbered dette oppsettet før rutenettene er farget med UA, slik at atmosfæren i kammeret er fri for CO2 og klar for bly flekker av klokken UA farging er fullført. - Gjør 4% NaOH. Tilsett 0,2 g NaOH til 5 mL destillert vann.
- Forbered Sato ' s trippel bly løsning. For å forberede 10 mL, tilsett 0,1 g bly nitrat, 0,1 g bly citrate, 0,1 g bly acetate og 0,2 g natrium citrate i en glass flaske. Tilsett 8,2 mL destillert vann og rist kraftig i 5 min. Sonikere for 30 s, legg deretter til 1,8 mL av ferskt laget 4% NaOH.
- Plasser flere dråper Sato ' s bly på voks i Petri parabolen.
- Plasser rutenettet beiset med UA (delen side ned) på drop av bly.
Merk: Hvert rutenett skal være fløt på en egen dråpe bly. Hver dråpe skal være liten nok til at rutenettet til å flyte på toppen av kuppelen på drop i stedet for å skli ned på sidene. - Dekk fatet og la flekken i 5 min.
- Hold rutenettet på kanten med pinsett og vask grundig under en mild stråle av kokt destillert vann ved romtemperatur fra en plast vask flaske.
- Blot tørke rutenettet på filter papir og lagre rutenettet.
Merk: Kontroller at delen ikke kommer i direkte kontakt med filter papiret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generelle kriterier som for det meste aksepteres som en indikasjon på tilfredsstillende eller defekt bevaring av prøve for TEM er fastslått. Disse kriteriene er eksempler på fire utvalgte elektron micrographs (to eksempler på optimal forberedelse, to eksempler på defekt forberedelse) som ble oppnådd ved å behandle unge rotte hjernevev etter metodene som er beskrevet i denne protokollen.
Generelt, en god kvalitet elektronmikroskop vises som en ryddig, distinkt og generell grå bilde. I en tilfredsstillende forberedt prøve, bør mellomrom mellom membraner fylles med kornet materiale, og bør ikke være tom. På samme måte bør det ikke finnes tomme mellomrom i det cytoplasmatiske grunn stoffet eller innenfor organeller (sammenlign figur 1a og figur 2a med Figur 3 og Figur 4). Likevel er det viktig å merke seg at sentralnervesystemet av svært unge dyr viser en viss grad av utvidelse av ekstracellulære områder i forhold til den voksne hjernen, med løsere forbindelser mellom celler og en samlet hvitere, mindre elektron-tette utseende. Membraner skal være kontinuerlig, uten forvrengning eller brudd (figur 1a og figur 2a). Stroma av mitokondrier skal vises ensartet og tett, uten tomme mellomrom. Cristae skal være intakt og ikke hoven, og mitokondrie ytre dobbel membran bør være ubrutt (sammenlign figur 1a med Figur 3). For å lette morphometric analyse av pre-Synaptic vesicle organisasjon, pre-og post-Synaptic membraner må være intakt og i hovedsak parallelt med hverandre (se figur 1). De blemmer i Synaptic bør være sporbare og bundet av en kontinuerlig enkelt membran (se figur 2).
Viktigere, selv når beste praksis er fulgt, behandling av prøven med fiksativene, flekker og harpiks introduserer gjenstander. Siden artefakter ikke kan elimineres, er det avgjørende å forstå hvilken prosess som stammer dem, slik at utseendet på prøven kan tolkes med hensyn til behandlingen som den gjennomgikk12. Et eksempel på en gjenstand-blant flere som kan genereres under prøveforberedelse for TEM-er en myelin figur, en membranous lamellær inkludering som ligner myelin hylser. Selv om myelin tall kan sees i patologisk forhold12, de oftest skyldes ekstraksjon av membran lipider under fiksering med aldehyder (se Figur 4).
Figur 1: elektronmikroskop representant for tilfredsstillende bevaring av cellestruktur (eksempel 1). (A) neuronal cellemembraner er lagdelt og uten pauser. Cytoplasma er fint kornet og uten tomme områder. Mitokondrier er hverken hoven eller krympet. Deres ytre dobbel membran er bevart, og interne cristae er intakt. (B) detalj av panel A, eksemplifiserer en metode for å måle avstanden av Synaptic blemmer fra pre-Synaptic membran. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: elektronmikroskop representant for tilfredsstillende bevaring av cellestruktur (eksempel 2). (A) Synaptic blemmer er distinkte og foret med en ubrutt enkelt membran. For å tillate morphometric analyse av Synaptic vesicle distribusjon, pre-Synaptic og post-Synaptic membraner må være parallelle og deres kontinuitet bevart. (B) detalj av panel A, eksemplifiserer telling av Synaptic blemmer i pre-Synaptic Terminal. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: elektronmikroskop representant for defekt bevaring av vevs strukturen (eksempel 1). Legg merke til forvrengning og brudd på neuronal cellemembraner og tilstedeværelsen av markert forstørret ekstracellulære mellomrom (merket med *). Mitokondrier vises oppblåst og har hovne cristae (merket med pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: elektronmikroskop representant for defekt bevaring av vevs strukturen (eksempel 2). Merk tilstedeværelsen av store hvite tomme områder innenfor cytoplasma (merket med ǂ), i stedet for fint kornet cytoplasmatiske substans. Ekstracellulære mellomrom vises forstørret. En artifactual membranous Slyngning (myelin figur), sannsynligvis skyldes mobilisering av lipider under fiksering med glutaraldehyde, er merket med akronym MF. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Håndtering av vevs deler under prøveforberedelse for TEM krever en betydelig grad av finesse, konsentrasjon og tålmodighet. Når du bruker en micropipette til å legge til og fjerne løsninger, kan prøver suges inn i pipette spissen ved overflatespenning, så stor forsiktighet bør tas for å unngå vevskader av pipette. Også visse trinn av dehydrering sekvensen kan være så rask som 1 min, derav operatøren må arbeide raskt for å sikre at neste dehydrering trinn er startet på tid og prøven ikke tørr eller rynke. En prosedyre som krever spesiell oppmerksomhet er etter fiksering med Osmium. Seksjonene blir stive etter behandling med Osmium og kan lett skades. Før du legger Osmium, er det viktig at delene er flatet i bunnen av hetteglasset, ellers noen fold vil resultere i vev brudd. Håndtering av osmicated vev er spesielt utfordrende ved overføring av seksjoner til aclar filmer for flate innebygging. Spesiell forsiktighet er nødvendig når du løfter prøven fra bunnen av hetteglasset for å unngå fragmentering, og når du skyver luftbobler ut av film sandwich. Mens det er viktig å presse ut noen fanget luft, som det gjør visualisering av prøven vanskelig og svekker stabiliteten av harpiks obligasjoner, direkte press på osmicated vev kan lett påføre skade. Et annet skritt som nødvendiggjør ekstra omsorg er utarbeidelse av harpiks blanding for prøve infiltrasjon og innebygging. EPON, den mest brukte embedding harpiks, kan være herdet med tillegg av en herder og en akselerator. Det er viktig å bruke nøyaktig mengde herder og akselerator for å få en herdet blokk med de ønskede egenskaper. Både gravimetrisk og volum metoder er beskrevet for måling av viskøs harpiks. Selv om gravimetrisk metoder har blitt tradisjonelt ansett som mer presis12, har dette forfatterens laboratorium hatt god suksess med volum moduser (dvs. legge volumet av hver ingrediens i harpiks Mix trinnvis ved hjelp av en gavage sprøyte) . Etter at harpiks komponentene har blitt nøye målt, må de blandes veldig grundig for å oppnå ensartet impregnering, siden de har ulike viskositeter og utbredelsen av polymerisering. Unnlatelse av å oppnå fullstendig miksing vil resultere i en blokk med ujevn hardhet som er uegnet for tynn snitting.
Markerte endringer i tonisitet av løsningene som brukes til å behandle deler av unge rotte hjernen kan forårsake krymping og/eller hevelse i ekstracellulære rom og cellulære komponenter12,35,36,37 . Under fiksering, de beste resultatene oppnås når osmotisk trykket av perfusate er holdt så lik som mulig til at av vevet under studien. Rotte hjernen osmolalitet er ca 330 mOsm. En 2% glutaraldehyde i 0,1 M PB løsning er bare litt hypertonic (400-450 mOsm) og minimerer utvidelse av ekstravaskulær plass12. Spesielt, membraner forbli følsomme for endringer i det osmotisk trykket av skylling og dehydrering løsninger etter fiksering med aldehyder. Derfor er det også viktig å minimere forskjellene mellom OSMOLARITETSSYSTEM av bindemiddel og løsningene som brukes senere12,35,36,37. Av denne grunn brukes det samme kjøretøyet (0,1 M PB, omtrentlig OSMOLARITETSSYSTEM 440 mOsM) som et løsningsmiddel for alle løsninger i denne protokollen. Imidlertid bør det bemerkes at flere forskjellige buffere har blitt brukt med hell under prøveforberedelse for TEM og ingen enkelt buffer kan kreve universell overlegenhet over de andre. Når buffere av lavere tonisitet foretrekkes, har andre laboratorier valgt å øke OSMOLARITETSSYSTEM med elektrolytter eller ikke-elektrolytter12.
Flere trinn i denne protokollen krever bruk av kjemikalier som kan være giftig når den ikke håndteres på riktig måte. Viktigheten av å arbeide under en røyk-hette og iført personlig verneutstyr under håndtering av aldehyder, Osmium, uran og bly forbindelser kan ikke være overdrevet. Mens automatiserte kontrasterende systemer kan hjelpe dempe noen av risiko og er kommersielt tilgjengelig, kan de være ganske dyrt og kan ikke være rimelig av laboratorier som ikke gjør rutinemessig bruk av TEM. Selv om laboratoriet for elektronmikroskop kan være et farlig sted, er prøve behandling for TEM generelt sikkert når det utføres strengt.
Nylig har innføringen av super-oppløsning lys mikroskopi økt optisk Imaging løse makt til ca 15 NM34. Men når målet er å utføre morphometric analyse av Synaptic vesicle romlig organisasjon på pre-Synaptic terminaler, ingen teknikk gir samme grad av morfologiske detaljer. Viktigere er TEM begrenset av behovet for at prøven skal være død før den kan behandles og visualisere. Derfor, når studien mål er å undersøke dynamiske eller funksjonelle aspekter av Synaptic vesicle smugling og exocytosis, bør verktøy enn TEM vurderes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette manuskriptet ble støttet av NIH/NIGMS K08 123321 (til N.L.) og av midler fra Department of Anesthesiology ved University of Virginia. Forfatterne ønsker å takke Alev Erisir (Department of Biology, University of Virginia, Charlottesville, VA) for utmerket opplæring og teknisk assistanse med TEM, og for hennes uvurderlige manuskript kritikk. Forfatterne takker også Advanced Electron mikroskopi anlegget ved University of Virginia for teknisk assistanse med prøve snitting og post-farging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. Santini, M. , Raven Press. NY. 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. Hayat, M. A. , Cambridge University Press. 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. Hayat, M. A. , Academic Press. San Diego. (1981).
- Behrman, E. J., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. Revel, J. P., et al. , Scanning Electron microscopy Inc, AMF. O’Hare, Chicago. 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. Heyn, C., Forssmann, W. G. , Springer. Berlin. 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
