Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Katherine Chan; Amy  Hin Yan Tong; Kevin  R Brown; Patricia Mero; Jason Moffat

doi:10.3791/59780

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Methodenartikel

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

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DOI:

10.3791/59780

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4. September 2019

Katherine Chan^*¹ , Amy Hin Yan Tong^*¹ , Kevin R Brown¹ , Patricia Mero¹ , Jason Moffat¹^,²^,³

¹Donnelly Centre, University of Toronto, ²Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ³Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Zusammenfassung

Die Genombearbeitung mit dem CRISPR-Cas-System hat die Fähigkeit, die Genome verschiedener Organismen präzise zu bearbeiten, erheblich erweitert. Im Kontext von Säugetierzellen stellt diese Technologie ein neuartiges Mittel dar, um genomweite genetische Screens für funktionelle Genomstudien durchzuführen. Bibliotheken von Guide RNAs (sgRNA), die auf alle offenen Leserahmen abzielen, ermöglichen die einfache Generierung von Tausenden von genetischen Störungen in einem einzigen Pool von Zellen, die auf bestimmte Phänotypen untersucht werden können, um Genfunktion und zelluläre Prozesse in einem unvoreingenommenund systematisch. CRISPR-Cas-Bildschirme bieten Forschern eine einfache, effiziente und kostengünstige Methode, um die genetischen Blaupausen für zelluläre Phänotypen aufzudecken. Darüber hinaus kann die Differentialanalyse von Bildschirmen, die in verschiedenen Zelllinien und aus verschiedenen Krebsarten durchgeführt werden, Gene identifizieren, die kontextuell in Tumorzellen wichtig sind, und potenzielle Ziele für spezifische Krebstherapien aufzeigen. Die Durchführung genomweiter Bildschirme in menschlichen Zellen kann entmutigend sein, da dies den Umgang mit zig Millionen Zellen beinhaltet und eine Analyse großer Datenmengen erfordert. Die Details dieser Bildschirme, wie z. B. die Charakterisierung von Zellenlinien, Überlegungen zur CRISPR-Bibliothek und das Verständnis der Einschränkungen und Fähigkeiten der CRISPR-Technologie während der Analyse, werden häufig übersehen. Hier ist ein detailliertes Protokoll für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-basierten Bildschirmen vorgesehen.

Einleitung

CRISPR-Cas, kurz für gruppierte, regelmäßig interspaceierte kurze palindromische Wiederholungen und CRISPR-assoziierte Nuklease, besteht aus einem einzigen Nukleaseprotein (z.B. Cas9) in Komplex mit einer synthetischen Guide RNA (sgRNA). Dieser Ribonukleoprotein-Komplex zielt auf das Cas9-Enzym ab, um doppelsträngige DNA-Brüche an einem bestimmten genomischen Ort¹zu induzieren. Doppelsträngige Brüche können durch homology directed repair (HDR) oder, häufiger, durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) repariert werden, ein fehleranfälliger Reparaturmechanismus, der zum Einfügen und/oder Löschen (INDELS) führt, das häufig die Genfunktion stört. <....