Summary
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache chirurgische Entfernung des Blinddarms (Kaecal-Patch) in einer Maus, gefolgt von der Induktion von entzündlichem Darmerkrankungen-assoziiertem Dickdarmkrebs. Dieses murine Appendektomie-Modell ermöglicht die Untersuchung der biologischen Rolle des Blinddarms bei der Pathogenese der menschlichen Magen-Darm-Krankheit.
Abstract
Der menschliche Blinddarm wurde vor kurzem involviert, um wichtige biologische Rollen bei der Pathogenese verschiedener komplexer Krankheiten wie Dickdarmkrebs, entzündliche Darmerkrankungen und Parkinson zu spielen. Um die Funktion des Blinddarms zu untersuchen, wurde ein Darmkrankheits-assoziiertes taurines Appendektomie-Modell etabliert und sein Schritt-für-Schritt-Protokoll wird hier beschrieben. Dieser Bericht führt ein leichtes Protokoll für die Entfernung von Kaecal-Pflastern bei Mäusen ein, gefolgt von der chemischen Induktion von chronischem Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs unter Verwendung einer Kombination aus Dextransulfat-Natrium (DSS) und Azoxymethan (AOM). IgA-spezifische Zellen und IgA-Konzentration wurden bei der Entfernung des Kaecal-Patches bei männlichen C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu denen in der Scheingruppe signifikant reduziert. Gleichzeitige Verabreichung von 2% DSS und AOM führte zu fast 80% Mäuseüberleben in Schein- und Appendektomiegruppen ohne signifikanten Gewichtsverlust des Körpers. Histologische Ergebnisse bestätigten eine Darmentzündung und verschiedene Grade des Adenokarzinoms. Dieses Modell kann für die Untersuchung der funktionellen Rolle des Blinddarms bei der Aufrechterhaltung der Darmmikrobiota-Homöostase und Pathogenese von Darmkolitis und Malignitäten sowie für die mögliche Entwicklung von Medikament-Targeting-Therapien verwendet werden.
Introduction
Die klinische Appendektomie ist ein Standard-chirurgisches Verfahren mit Entfernung des Blinddarms vor allem aufgrund von Entzündungen (z.B. Appendizitis)1,2,3. Die biologische Funktion des vermiformen menschlichen Blinddarms bleibt jedoch umstritten4,5,6. Der Blinddarm wurde als vestigialer Überrest betrachtet, der aus dem Cecum im Großdarm projiziert wird. Bis vor kurzem haben evolutionäre, immunologische, morphologische und mikrobiologische Studien darauf hingedeutet, dass der Anhang unterschiedliche Funktionen besitzen kann. Zu diesen Rollen gehören die Produktion von Immunglobinen (z. B. IgA und IgG), eine Vielzahl von B-Zellen und T-Zellen, die für adaptive Immunantworten innerhalb der Darm-assoziierten Lymphgewebe (GALTs) entscheidend sind, und die Auffüllung des Großdarms mit commensalen Mikrobiotas. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12.
Klinische epidemiologische Studien von Patienten mit früherer Appendektomie oder akuter Appendizitis haben auch ihre potenzielle Rolle bei der Pathogenese menschlicher Krankheiten, wie entzündliche Darmerkrankungen (IBD), Dickdarmkrebs und nicht-gastrointestinal Erkrankungen (z.B. Parkinson und Herz-Kreislauf-Erkrankungen)13,14,15,16,17,18. So zeigte eine große asiatische Populationskohortenstudie mit 75.979 Appendektomie-Patienten kürzlich einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Blinddarmkrebs- und Sterblichkeit14,19. Dementsprechend wird die Erstellung eines geeigneten Tier-Appendektomie-Modells, das einem Menschen ähnelt, hilfreich sein, um die biologischen Funktionen und molekularen Mechanismen des Blinddarms in der Krankheitspathogenese zu untersuchen.
Viele Säugetiere besitzen einen Blinddarm oder ein Blinddarm-ähnliches Organ, einschließlich Primaten, Lagomorphen (z.B. Kaninchen), einige Nagetiere und Beuteltiere20. Bei kleinen und häufig verwendeten Labortieren besitzt das Kaninchen den vermiformenen Blinddarm, der dem menschlichen21,22ähnelt, aber GALT beim Kaninchen ist im Vergleich zum Menschen extrem groß, da die Mehrheit der Lymphgewebe finden sich auch in Peyers Pflastern, die sich sowohl im Dünn- als auch im Dickdarm befinden21. Darüber hinaus zeigt das Kaninchen eine andere lymphoide follikelische Struktur, T-Zell-Verteilung, und Immunglobulindichte vom Menschen, die das Studium ihrer Anhänge ungeeignet macht21.
Mäuse sind das am häufigsten verwendete Tiermodell, um die humane Pathophysiologie zu studieren und die verschiedenen bestehenden und neuartigen Therapuetika23,24,25zu testen. Der einzelne weiße große Lymphoidhaufen an der Spitze des Caecums bei Mäusen, bekannt als der Kaecal-Patch, wird angenommen, dass er ähnliche Funktionen wie der menschliche Blinddarm26,27,28ausführt. Dennoch ist es praktisch schwierig, den Kaecal-Patch von Caecum bei Mäusen zu trennen. Bisher beinhalten die üblichen chirurgischen Verfahren zur Induktion von Blinddarmentzündungen in einem Mausmodell einen relativ großen Schnitt (z. B. 1–2 cm) durch die Bauchwand, um Zugang zum gesamten Caecum zu erhalten (Zusatztabelle 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.
Hierin, um ein Appendektomie-Modell im Zusammenhang mit Magen-Darm-Erkrankungen zu generieren, stellt dieser Bericht ein leichtes chirurgisches Protokoll für die Entfernung von Kaecal-Pflasterbeiten bei Mäusen vor. Es folgt die kombinierte Verabreichung des genotoxischen Mittels AOM und des proinflammatorischen Mittels DSS zur Induktion von Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs ähnlich dem beim Menschen. IBD hat sich als Risikofaktor für Darmkrebs37,38gezeigt. Die Kombination von AOM/DSS-induziertem chronischem Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs ist gut etabliert, und Leser können sich auf Neufert et al. und Thaker et al. für detaillierte Verfahren39,40beziehen. Dieses reproduzierbare und schnelle murine Appendektomie-Modell kann verwendet werden, um Blinddarm-modulierte Darmentzündungen und Dickdarm-Mikrobiota zu studieren, insbesondere bei der Entwicklung und Progression von IBD und Dickdarmkrebs.
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Protocol
Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Xi'an Jiaotong University (Nr. XJTULAC2019-1023).
1. Mäuse-Appendektomie
- Haus 8–10 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse in einer zertifizierten spezifisch-pathogenfreien (SPF) Umgebung für 1 Woche vor der Operation.
- Bereiten Sie folgende sterile chirurgische Instrumente vor: ein Paar Mikroschere, ein Paar Mikrozange, zwei Größen (4-0 und 8-0) sterilisierter nicht resorbierbarer Nähte, ein elektrischer Gerinnungsstift mit Nadelhalter, 75% medizinischer Alkohol, Jod-basiertes Peeling ( z. B. Entojod) und eine Packung steriler Wattestäbchen.
- Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit vorgewärmter 0,9% physiologischer Salzlösung für die Bauchspülung und Hydratation während der Operation.
- Anästhetisieren Sie eine nicht-schnelle Maus intraperitoneal (i.p.) mit 1% Natriumpentobarbital in einer Dosis von 100 mg/kg. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf Pedalreflexe.
HINWEIS: Es wird eine einzelne Anästhesiedosis verabreicht, um eine vollständige beruhigende Wirkung in der Maus zu gewährleisten. Unter den Umständen kurzer Verfahren können 50 mg/kg Natriumpentobarbital i.p. ausreichen. - Rasieren Sie das Bauchhaar vorsichtig mit einem elektrischen Rasierer.
- Legen Sie die Maus auf das Heizkissen, um Unterkühlung zu verhindern.
- Sichern Sie die Maus auf einer Plattform in einer Supine-Position, indem Sie vier Streifen medizinisches Klebeband über die Gliedmaßen legen, um Haltungsbewegungen während der Operation zu verhindern.
- Berühren Sie sanft den ganzen Bauch, um das Gefühl einer Beule zu finden.
HINWEIS: In den meisten Fällen gibt das Gefühl einer Beule immer die genaue Position des Caecums an. Um mögliche Schäden am Rest des Darms zu vermeiden, ist diese Vorortung des Cecums vor dem Bauchschnitt wichtig. - Mit einem sterilen Vorhang abdecken und den rasierten Bereich des Bauches desinfizieren, indem Sie abwechselnd chirurgische Peelings von Jodlösung und 75% Alkohol anwenden. Wiederholen Sie den Vorgang 2x.
- Machen Sie einen Längsschnitt zwischen 0,5 und 1,0 cm an der Mittellinie des Bauches.
- Nach der vorgegebenen Position des Caecums erreichen Sie das Caecum und entfernen Sie sanft (caecal patch). Verwenden Sie eine sterile, vorgewärmte Salzlösung des physiologischen pH-Werts, um den Darm zu hydratisieren.
HINWEIS: Der Kaecal-Patch einer Maus ist Teil des Caecums und zeichnet sich durch das Vorhandensein von weißen eiförmigen Follikel auf der Oberfläche aus. - Um mögliche Komplikationen der postoperativen Blutung und Infektion zu verhindern, ligate die mesentischen Blutgefäße des Caecums mit dem 8-0 naht. Das Caecum mit steriler Saline hydratisieren.
- Markieren Sie den Resektionsbereich mit der 4-0-Naht mit einer offenen Schleife in der Nähe des Scheitelpunkts des Caecums am proximalen Dickdarm.
HINWEIS: Das Markieren des Caecums mit einer offenen Schleife verhindert auch das Auslaufen von Kaekalinhalten aus dem Schnitt. - Schneiden Sie den Kaecal-Patch unterhalb der markierten Resektion mit Mikroscheren ab und wischen Sie den restlichen Kaekalgehalt mit medizinischen Wattestäbchen aus. Dann desinfizieren Sie den Stumpf von Caecum mit Jod-basiertem Peeling.
- Schließen Sie den Stumpf mit der laufenden Naht mit dem 8-0 naht.
- Entfernen Sie vorsichtig die 4-0-Gewindeschleife, die zuvor zur Markierung der Resektion am Stumpf des Caecums verwendet wurde.
- Sterilisieren Sie die vernähte Position mit Jod-basiertem Peeling. Rehydrieren Sie die chirurgische Stelle mit Saline wieder.
- Schließen Sie die Muskulaturschicht mit der laufenden Naht mit 8-0 Nahtgewinde.
- Schließen Sie die Hautschichten mit unterbrochenen Nähten mit 4-0 Nahtfaden.
- Desinfizieren Sie den chirurgischen Schnitt 2x mit Jod-basiertes Peeling, dann entfernen Sie Jod mit 75% medizinischem Alkohol.
- Drehen Sie die Maus vorsichtig zurück, subkutan (s.c.) injizieren 0,1 mg/kg Körpergewicht von Buprenorphin und 0,4 ml physiologische reine Salzlinie und lassen Sie die Maus auf dem Heatpad ruhen, bis sie ins Bewusstsein zurückkehrt.
- Setzen Sie die Maus zurück in den sterilen Käfig und beobachten Sie 3 Tage nach der Operation 3 Tage lang genau auf Anzeichen von Schmerzen, um die Genesung sicherzustellen.
HINWEIS: Zur Schmerzlinderung der einzelnen Maus kann eine postoperative Anwendung von 0,05 mg/kg Buprenorphin erforderlich sein. Erlauben Sie Mäusen, sich 7 Tage nach der Operation zur weiteren Induktion von Colitis-assoziierten Dickdarmkrebs zu erholen.
2. Induktion von chronischem Colitis-assoziiertem Dickdarmkrebs mit AOM und DSS
HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren 7 Tage nach der Appendektomie durch.
- Bereiten Sie die AOM-Stammlösung vor, indem Sie 25 mg AOM in 2,5 ml 0,9% steriler Saline in einer Konzentration von 10 mg/ml auflösen.
HINWEIS: AOM ist lichtempfindlich.- Aliquot 2,5 ml vorbereitete AOM-Lagerlösung in 5 ml Glasrohre, die mit Aluminiumfolie umwickelt sind, und bei jedem Gebrauch bei -20 °C lagern.
- Ein Aliquot von AOM einmal auftauen und auf eine Konzentration von 1 mg/ml mit 0,9% steriler Salzin verdünnen (Verhältnis 1:10).
VORSICHT: AOM ist extrem krebserregend; führen Sie daher den gesamten Vorbereitungsvorgang in einer Dunstabzugshaube durch.
- 4 g DSS-Pulver in 200 ml autoklaviertem Wasser auflösen, um 2% (w/v) DSS-Lösung vorzubereiten.
HINWEIS: Die Konzentration von DSS kann je nach Mausstamm, Geschlecht und Induktionszyklus variieren; 3% DSS kann für andere Mäusestämme verwendet werden. - Gleichzeitig das frisch zubereitete AOM/DSS an die Mäuse anbringen. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.
- Intraperitoneal injizieren 0,01 ml/g frisch zubereitete AOM-Arbeitslösung für jede Maus und ersetzen Sie das autoklavierte Wasser durch 2% DSS-Lösung für 5 Tage ad libitum.
HINWEIS: Jeder Käfig enthält fünf Mäuse; überprüfen Sie regelmäßig die DSS-Trinkflasche, um sicherzustellen, dass während der Behandlungszeit kein Niederschlag auftritt. - Gewicht und genau überwachen jede Maus jeden Tag.
HINWEIS: Während der Verabreichung, einschläfern Mäuse mit bis zu 20% Gewichtsverlust im Vergleich zu seinem anfänglichen Gewicht oder Anzeichen der Huddle, Schielen, Unterkühlung, und schlechte Aktivität.
- Intraperitoneal injizieren 0,01 ml/g frisch zubereitete AOM-Arbeitslösung für jede Maus und ersetzen Sie das autoklavierte Wasser durch 2% DSS-Lösung für 5 Tage ad libitum.
- Geben Sie eine frische Flasche autoklaviertes Wasser am Tag 6 nach der Verabreichung von AOM/DSS bis zum 21. Tag (Abbildung 1B).
HINWEIS: Dies ist ein vollständiger Zyklus, der 21 Tage umfasst. - Wiederholen Sie die Schritte 2.3–2.4 für weitere zwei Zyklen und opfern Sie die Mäuse an Tag 70.
3. Bewertung von Darmentzündung und Tumor (70 Tage nach der Verabreichung von AOM)
- Opfern Sie die Mäuse durch CO2-Inhalation mit einer Füllrate von 10% in der Euthanasiekammer, gefolgt von zervikaler Dislokation.
- Ernten Sie den gesamten Dickdarm von oben die ileo-kolikische Kreuzung zum Anus.
- Setzen Sie die Lumenseite aus, indem Sie den Kolon längs öffnen. Schneiden Sie den ganzen Dickdarm in 10 cm lange Stücke und fixieren Sie das Dickdarmgewebe in 10% Formalin für 72 h für Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung.
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Representative Results
Etablierung eines murinen Appendektomiemodells
Dieses murine Appendektomie-Modell des chronischen Colitis assoziierten Dickdarmkrebses kann durch Befolgen der sequenziellen chirurgischen und Induktionsschritte erzeugt werden, wie in Abbildung 1dargestellt. Die häufigsten Positionen von caecum sind in der linken und rechten iliac fossa gefolgt von der Mittellinie des Bauches (Abbildung 2). Die erfolgreiche Rate der Vorlokalisierung von Caecum vor dem Bauchschnitt mit der Palpation-Methode beträgt fast 70% (Ergänzende Informationen, Tabelle S2). Die Appendektomieverfahren umfassen im Wesentlichen sechs wichtige Schritte (Abbildung 3). Während der Blinddarmoperation ist ein Mittellinienschnitt von bis zu 0,5–1,0 cm Länge entscheidend, um ein chirurgisches Trauma zu minimieren (Abbildung 3A). Im Falle der intraperitonealen Leckage sind die Ligadierung mesangialer Gefäße und das Schließen des Stumpfes des Caecums erforderlich, mit laufenden Nähten anstelle einer einfachen Ligation (Abbildung 3B,C,D,E).
Bewertung von IgA als Biomarker bei Appendektomiemäusen
Zur Bestätigung der Blinddarm-Mykotomie wurden der Dickdarm von Mäusen und der Fäkaliengehalt nach der Operation geerntet, um die Konzentrationen von IgA-spezifischen Plasmazellen und sekretorische IgA-Konzentrationen (sIgA) zu bestimmen. Die Appendektomie-Mäuse zeigten eine signifikante Verringerung des Prozentsatzes der B220-IgA+ spezifischen Plasmazellen im Vergleich zur Scheingruppe (Abbildung 4A,B). Darüber hinaus hielten Scheinmäuse im Vergleich zu ihrem eigenen Ausgangszustand vor der Operation die fäkale SIgA-Konzentration über 14 Tage nach der Operation aufrecht, während die Appendektomiegruppe am Tag 14 eine signifikante SlgA-Reduktion aufwies (Abbildung 4C).
Validierung von Colitis-assoziierten Dickdarmkrebs bei Blinddarmmäusen
Im Vergleich zu 3% DSS, bei dem die meisten Mäuse in der Appendektomie-Gruppe schwere Komplikationen und signifikante Nutzgewichtsabnahme zeigten (Abbildung 5A), lieferten 2% DSS in Kombination mit AOM 80% der Überlebensrate sowohl in Schein- als auch in Appendektomie-Gruppen, angemessene Körpergewichtsänderungen (Abbildung 5E). Am Ende von drei Behandlungszyklen wurde der großfängliche Darm für eine pathologische Beurteilung geerntet. Visuelle Inspektion und H&E-Färbung zeigten die Kolontumoren mit Dickdarmentzündung und verschiedenen Graden von Adenokarzinome (gut-, mittel- und schlecht differenzierte Adenokarzinome) bei Mäusen, die mit 2% AOM/DSS behandelt wurden (Abbildung 6).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Etablierung des murinen Appendektomiemodells des chronischen Kolitis-assoziierten Dickdarmkrebses.
(A) Ein Flussdiagramm der wichtigsten chirurgischen Schritte (erste drei sind kritisch) des Blinddarmoperationtums. (B) Induktion von Dickdarmkrebs. Sieben Tage nach der Blinddarmoperation wurden AOM und DSS gleichzeitig verabreicht. Mäusegewichte wurden zu verschiedenen Zeiten aufgezeichnet (rotes Dreieck). Am Tag 70 nach der Operation wurden Mäuse geopfert und Darmgewebe für weitere Untersuchungen geerntet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vorbestimmung der Kaecal-Patch-Position bei Mäusen vor dem Bauchschnitt.
(A) Zusammenfassung der Wahrscheinlichkeit, eine Caecum-Position zu finden. Anatomische Bilder von drei häufigsten Positionen des Caecums am (B) unten rechts, (C) Mitte und (D) niedriger linker Bauch der Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kritische Schritte der murinen Blinddarmktomie.
(A) Kleiner Schnitt, der 0,5–1,0 cm angeordnet ist; (B) Ziehen Sie den genauen Teil des Kaecal-Patches nach Vorpositionierung des Caecums heraus. (C) Ligation von mesenterischen Gefäßen, die das Caecum begleiten. (D) Markierung des Schnittbereichs des Caecums mit der Naht 4-0. (E) Schließen des Stumpfes mit laufenden Nähten mit dem 8-0 naht. (F) Schließen der Muskelschicht mit unterbrochenen Nähten mit dem 8-0 naht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quantifizierung von IgA-spezifischen Plasmazellen und Fäkalien-SIgA-Konzentration nach Appendektomie.
(A) Repräsentative Punktdiagramme für Zellen, die mit Anti-IgA und B220 im gesamten Dickdarm von Schein- und Appendektomiemäusen 1 Tag und 14 Tage nach der Operation gefärbt sind. Lymphozyten in Lamina propria wurden frisch zubereitet und mit FITC Anti-Maus IgA, PE Anti-Maus CD45R/B220 für Durchflusszytometrie gefärbt. Zahlen innerhalb von Diagrammen geben Prozentsätze von Zellen in den jeweiligen Bereichen an. (B) Quantitative Bestimmung von IgA-spezifischen Plasmazellen in Schein- und Appendektomiegruppen. Die Daten stellen den Mittelwert sD dar; n = 5–8 Mäuse; *p < 0.05, **p < 0.01 und ***p < 0.001. (C) Fecal sIgA Konzentrationen vor und nach der Operation. Fäkale Inhalte wurden zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt, und sIgA-Stufen wurden von ELISA getestet. Jeder Farbpunkt stellt die gleiche Maus über einen Zeitraum von 14 Tagen dar. Die statistische Analyse wurde mit einem ungepaarten t-Test durchgeführt, wobei p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Überlebensstatus von Tieren des chronischen Colitis-assoziierten Dickdarmkrebsmodells, das durch AOM/DSS-Kombination nach Appendektomie induziert wird.
(A) Die Überlebenskurve, die mit 3% DSS für die Kolitisinduktion in Schein- und Appendektomiegruppen ermittelt wurde. Schwere Komplikationen des Analprolaps (B) und des Wandabszesszeigten zeigten den Endpunkt des Tieres (C). (D) Die Überlebenskurve, die mit 2% DSS für die Kolitisinduktion in Schein- und Appendektomiegruppen ermittelt wurde; (E) Durchschnittliche Körpergewichtsänderung von Mäusen über 70 Tage. Die Daten stellen den Mittelwert sD, n = 6 Mäuse dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Bilder von chronischen Colitis-assoziierten Kolorektaltumoren, die durch Kombinationsbehandlung von 2% DSS und 10 mg/kg AOM induziert werden.
Fotos des sezierten Dickdarms mit Tumoren unter (A) Visuelle Inspektion und (B) Tieroperationsmikroskop. H&E-Färbungsbilder von Kolongeweben, die (C) Eine Darmentzündung, (D) gut differenziertes Adenokarzinom, (E) mäßig differenziertes Adenokarzinom und (F) hochdifferenziertes Adenokarzinom zeigen. Schwarzer Pfeil zeigt das Schleimhautgeschwür, schwarze Pfeilspitze zeigt Adenokarzinom, weißer Pfeil zeigt neutrophile Infiltration zwischen Drüsen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Tabelle 1: Literaturzusammenfassung der chirurgischen Methoden zur Blinddarminduktion bei häufig verwendeten Mäusestämmen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatztabelle 2: Standorte des Caecums bei Mäusen nach Laparotomie. Das exponierte Organ nach dem Einschnitt zeigt das Organ direkt an der vorpositionierten Position nach der Laparotomie an. Die Position des Caecums zeigt die Caecum-Position relativ zur Bauchregion/die Caecum-Position relativ zum Darm. Exposed zeigt an, dass das Caecum unter der Muskelschicht des Bauches und über anderen Teilen des Darms lag. Eingebettet zeigt an, dass das Caecum vom Darm bedeckt war. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Ein murines Appendektomie-Modell von Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs wurde mit chirurgischen Schritten mit einer hohen Überlebensrate bei Mäusen erhalten. In den meisten Fällen war es schwierig, seiner Lage ohne Laparotomie vorzugreifen, da das Caecum unter der Bauchwand positioniert war(Zusatztabelle 1, Zusatztabelle 2und Abbildung 2), da es schwierig war, seiner Lage ohne Laparotomie vorzugreifen. In diesem chirurgischen Protokoll wurde ein einfacher Schritt zur Berührung der Beule eingeführt, und auch die quantitative Bewertung des Cecum-Standorts wurde als Richtschnur zur Erhöhung der Genauigkeit für die Vorlokalisierung des Cecums bereitgestellt (Abbildung 2). Die Ausnutzung anatomischer Merkmale zur Entfernung des Kaecal-Patches minimierte Störungen unbeabsichtigter Teile des Darms, wodurch die Rate möglicher Komplikationen der Blinddarmentzündung und Infektion der Bauchhöhle verringert wurde.
In diesem Modell sind drei wichtige Schritte erforderlich. Erstens kann die visuelle Untersuchung und Palpation vor der Laparotomie hilfreich sein, um die allgemeine Lage des Caecums zu bestimmen. Trotz der Tatsache, dass das Caecum am ehesten in der linken Iliasregion des Bauches vorhanden ist, ist der Kaecal-Patch, der aus der Spitze des Caecums hervorragt, oft dissoziativ (d. h. sich bewegen oder eingebettet) und eher unter dem mittleren Peritoneum zu finden ist ( Abbildung 2). Zweitens wird ein kleiner Schnitt an der Mittellinie des Bauches und eine genaue Exposition des Kaecal-Patches bevorzugt. Dies liegt daran, dass es eine dünne Stelle an der Mittellinie des Bauches gibt, an der das Schneiden in diese Position mögliche Verletzungen der Bauchmuskelschicht verringern kann. Um den Volvulus bei der Blinddarmentzündung zu vermeiden, der Mäusen abträglich ist, minimiert die genaue Exposition des Kaecal-Pflasters die unbeabsichtigte Störung des Darms und verringert das Risiko eines Volvulusvorkommens. Darüber hinaus kann eine minimale Exposition der Bauchhöhle sicherstellen, dass der Darm unbelastet, warm und feucht bleibt; Andernfalls kann eine übermäßige Exposition zu erheblichem Wärmeverlust und Trocknen von Geweben führen41.
Drittens sind Desinfektion und Verschluss des Kaekalstumpfes mit laufenden Nähten anstelle einer einfachen Ligation notwendig, um eine mögliche Blutung und Desinfektion des Kaekalinhalts des Stumpfes zu verhindern. Der Gehalt an IgA-spezifischen Plasmazellen und Fäkalien im Großdarm von Mäusen wird durch eine Blinddarmoperation signifikant reduziert, was darauf hindeutet, dass der Kaecal-Patch der Hauptstandort für die Produktion von IgA ist, zumindest in der Anfangsphase33. Im Dickdarm fungiert sIgA als Schleimhaut-Gesundheitsverteidiger, indem es die normale Besiedlung der pflanzenlebenden Flora stabilisiert und pathogenen Mikroben entgegenwirkt42. Die Entfernung des Blinddarms reduziert die Produktion von IgA und kann die Schleimhautostase stören.
Die hohe Sterblichkeitsrate und klinische Anzeichen einer übermäßigen Kolitis-Induktion (d. h. schwerer blutiger Stuhl, Analprolaps und Bauchabszess43,44) wurden bei Mäusen beobachtet, die mit 3% DSS behandelt wurden (Abbildung 5). Jedoch, 2% DSS-Induktion nach drei Zyklen verursachte keine dieser Komplikationen, und die Überlebensrate wurde über 80% beibehalten. Dies deutet darauf hin, dass die kombinierte Verwendung von DSS und AOM validiert werden sollte, da die mangelnde Integrität von GALTs die Toleranz von Mäusen gegenüber der AOM- und DSS-Kombination in gewissem Maße verringern kann. Die Beobachtungsstudien aus klinisch begründeten Beweisen deuten darauf hin, dass der Blinddarm stark mit der Entwicklung von IBD und Dickdarmkrebs14,45,46verbunden ist. Die biologischen Funktionen und zugrunde liegenden Mechanismen des Blinddarms bei der Pathogenese chronischer Darmerkrankungen sind jedoch noch unklar. Es scheint, dass der Anhang als ein wichtiger Teil der GALTs und als Reservoir für Darm-Commensal-Flora zur Regulierung der Gesundheit oder erkrankten Staaten17,18,31. Die Etablierung dieses wiederholbaren und kostengünstigen murinen Appendektomiemodells kann verwendet werden, um die Rolle des Blinddarms bei IBD und Dickdarmkrebs im Kontext von Mikrobiota-Homöostase, Krebsprävention und Immuntherapie zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird teilweise durch Fundamental Research Funds for the Central University (G2018KY0302), University Fundamental Research Development Fund (KT00062), National Natural Science Foundation of China (81870380) und Clinical Research Award des Erstes angeschlossenes Krankenhaus der Xi'an Jiaotong Universität in China (Nr. XJTU1AF-CRF-2015-029). Die Autoren danken Dr. Chengxin Shi für seine technischen Vorschläge während der frühen Explorationsphase des murinen Appendektomiemodells sowie dem Pathologen Dr. Xi Liu für die Bewertung der H&E-Färbungsergebnisse von Kolitis und kolorektalen Tumoren. Y.L. führte die Operation Demonstration durch, führte Datenanalysen durch und schrieb den Entwurf des Manuskripts; J.L., G.L., Z.P. und Y.M. nahmen an der chirurgischen Vorbereitung, Gewebesammlungen und Videoproduktion teil; M.Z. führte die Durchflusszytometrie und ELISA durch; Q.W. und H.X. leisteten die technische Unterstützung bei der Erzeugung eines klinisch relevanten murinen Modells; R.X.Z. entwarf die Studie, überwachte die Forschung und schrieb und dokumentierte das Manuskript; J.S. überprüfte das Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane(AOM) | Sigma-Aldrich,Inc. | A5486 | |
| Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) | MP Biomedicals,Inc. | 160110 | |
| Entoiodine | Shanghai likon high technology disinfection co. LTD | 310102 | |
| digital caliper | Ningbo yuanneng trading co. LTD | 4859263 | |
| 4-0 Silk Sutures | Yuanlikang co. LTD | 20172650032 | |
| 8-0 Prolene Sutures | Yuanlikang co. LTD | 20172650032 | |
| Electric coagulation pen | Chuang mei medical equipment co. LTD | 28221777292 | |
| disposable syringe 1ml | Shengguang medical products co. LTD | 3262-2014 | |
| disposable syringe 10ml | Shengguang medical products co. LTD | 3262-2014 | |
| 75% Medicinal alcohol | Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD | 371402AAJ008 | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma-Aldrich,Inc. | 57-33-0 | |
| Physiological Saline | Shandong qidu pharmaceutical co. LTD | H37020766 | |
| Absorbent Cotton Swab | Henan ruike medical co., LTD | RK051 | |
| Surgical Instruments-Ophthalmic | Jinzhong Shanghai co.LTD | WA3050 |
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