Este método está diseñado para seguir la formación de dominios de cromatina mediadas por PRC2 en líneas celulares, y el método se puede adaptar a muchos otros sistemas.
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Artículo de método
Un método para estudiar la formación de novo de dominios de cromatina
En este artículo
Resumen
Resumen
La organización y la estructura de los dominios de cromatina son exclusivas de los linajes celulares individuales. Su mala regulación podría conducir a una pérdida en la identidad celular y / o enfermedad. A pesar de los enormes esfuerzos, nuestra comprensión de la formación y propagación de dominios de cromatina sigue siendo limitada. Los dominios de cromatina se han estudiado en condiciones estables, que no son propicias para seguir los acontecimientos iniciales durante su establecimiento. Aquí, presentamos un método para reconstruir inducibariamente dominios de cromatina y seguir su re-formación en función del tiempo. Aunque, aplicado primero al caso de la formación de dominios de cromatina represiva mediada por PRC2, podría adaptarse fácilmente a otros dominios de cromatina. La modificación y/o la combinación de este método con la genómica y las tecnologías de imagen proporcionarán herramientas invaluables para estudiar el establecimiento de dominios de cromatina con gran detalle. Creemos que este método revolucionará nuestra comprensión de cómo se forman los dominios de cromatina e interactúan entre sí.
Introducción
Los genomas eucariotas están altamente organizados y los cambios en la accesibilidad a la cromatina controlan directamente la transcripción genética1. El genoma contiene distintos tipos de dominios de cromatina, que se correlacionan con la actividad transcripcional y la sincronización de replicación2,3. Estos dominios de cromatina varían en tamaño de unas pocas kilobases (kb) a más de 100 kb y se caracterizan por un enriquecimiento en distintas modificaciones histonas4. Las preguntas centrales son: ¿cómo se forman estos dominios y cómo se propagan?
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Protocolo
Generación de mESC de rescate EED inducibles
1. Cultivo celular
- Utilice células madre embrionarias de ratón C57BL/6 libres de alimentación (mESC) que posean un transgén CreERT2 establemente integrado, que puede translocarse al núcleo tras la administración de 4-Hidroxitamoxifeno (4-OHT)13.
- Cultivar mESC en ESC medio convencional14,15, complementado con 1000 U/ml de LIF, 1 inhibidor de ERK DE M PD0325901 y 3 inhibidores GSK3 CHIR99021. Para el medio ESC convencional, utilice DMEM knockout que contenga 15% de suero bovino fe....
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Resultados
Un esquema general del sistema de rescate condicional
La Figura 1 muestra el esquema de apuntamiento para rescatar condicionalmente las células de EED KO con WT o EED mutante en jaula (Y365A) que se expresa desde el locus EED endógeno. Después de eliminar EED, una subunidad central de PRC2 que es esencial para su estabilidad y actividad enzimática, se introduce un casete dentro del intrón después del exón 9 de EED (Figura 1). El cassette cons.......
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Discusión
Un enfoque poderoso hacia la comprensión de los detalles mecanicistas durante la formación de un dominio de cromatina dado, es primero interrumpir el dominio y luego realizar un seguimiento de su reconstrucción en curso dentro de las células. El proceso se puede pausar en cualquier momento durante la reconstrucción para analizar en detalle los eventos en curso. Estudios previos sobre dominios de cromatina no pudieron resolver tales eventos, ya que se realizaron en condiciones de estado estacionario (por ejemplo, comparan.......
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Divulgaciones
D.R. es cofundador de Constellation Pharmaceuticals y Fulcrum Therapeutics. Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a los doctores L. Vales, D. Ozata y H. Mou por la revisión del manuscrito. El D.R. Lab cuenta con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes y los Institutos Nacionales de Salud (R01CA199652 y R01NS100897).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| (Z)-4-hidroxitamoxifeno (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | Para la inducción de la expresión de EED |
| 16% Solución acuosa de paraformaldehído (10x10 ml) | Microscopía electrónica Sciences | 15710 | Para inmunofluorescencia |
| 2-mercaptoetanol | LifeTechnologies | 21985-023 | Para cultivo de mESCs |
| Solución de gelatina al 2% | Sigma | G1393-100ml | Para mESCs cultivo |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | Para mESCs cultivo |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | para inmunofluorescencia |
| Aqua-Mount medio de montaje | FISHER/VWR | 41799-008 | Para inmunofluorescencia |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | Para inmunofluorescencia |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato) - 10 mg | Life Tech | D1306 | Para inmunofluorescencia |
| Inhibidor de ERK, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Para cultivo de mESCs |
| ESGRO Ratón recombinante LIF Proteína | Millipore/Fisher | ESG1107 | Para el cultivo de mESCs |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | Para cultivo de mESCs |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Para clonación de plantilla de donante |
| Inhibidor de GSK3, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Para cultivo de mESCs |
| H3K27me2 (D18C8) conejo Señalización | células | 9728S | para ChIP-seq |
| H3K27me3 | Señalización | celular Anticuerpo 9733S | para ChIP-seq |
| Histone H2Av anticuerpo (pAb) | Motivo activo | 39715 | Control de picos para ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | Para cultivo de mESCs |
| L-glutamina | Sigma | G7513 | Para cultivo de mESCs |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | Para la transfección |
| MangoTaq ADN polimerasa | Bioline | BIO-21079 | para genotipado PCR |
| Suero de burro normal (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Para inmunofluorescencia |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma/Roche | P0781 | Para cultivo de mESCs |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | Para clonación de ARNg |
| Solución de extracción de ADN | QuickExtract Lucigen | QE0905T | para genotipado PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | para la clonación de plantillas de donantes |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Secuencia: ctctggctactgtcaactag. Los ARNg se emparejan para eliminar el EED en las ESC C57BL/6 para los sistemas i-WT-r e i-MT-r. | ||
| Secuencia EED-KO-gRNA-2 | : TAGGCTATGACGCAGCTCAG. Los ARNg se emparejan para eliminar EED en ESC C57BL/6 para sistemas i-WT-r e i-MT-r. | ||
| por EED-gRNA | : atggcaccccgaaattagaa. gRNA y donante para generar el sistema i-WT-r en el fondo EED-KO. | ||
| de i-WT-r | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA y donante para generar el sistema i-WT-r en el fondo EED-KO. | ||
| por EED-gRNA | : atggcaccccgaaattagaa. gRNA y donante para generar el sistema i-WT-r en el fondo EED-KO. | ||
| i-MT-r | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA y donante para generar el sistema i-MT-r en el fondo EED-KO. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Secuencia: ctgtaggctgccatctgtga. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de 1,9 kb. El alelo knockout producirá un producto de 200 pb. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Secuencia: agccagggctacacagagaa. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de 1,9 kb. El alelo knockout producirá un producto de 200 pb. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Secuencia: tgcagtgaaacaaatttggaa. Cuando se inserta el casete, los cebadores producirán 1863 pb. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de ~200 pb. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Secuencia: gagaggggtggcactgtaaa. Cuando se inserta el casete, los cebadores producirán 1863 pb. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de ~200 pb. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Secuencia: ccccctctctctctctctct Cuando se inserta el casete, los cebadores producirán 3200 bp. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de 1560 pb. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Secuencia: atgcctgggtgaatgaaaaa. Cuando se inserta el casete, los cebadores producirán 3200 bp. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de 1560 pb. |
Referencias
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (....
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