利用荧光标记蛋白和延时显微镜技术，可实时观察细胞分裂过程。通过本方案，用户可分析细胞分裂的时间动态、有丝分裂纺锤体的组装以及染色体的排列与分离。此外，还可评估并量化RNA干扰（RNAi）介导的基因敲低后上述事件中出现的异常。
本文内容
摘要
摘要
Drosophila S2 细胞是研究组织培养中细胞有丝分裂的重要工具，能够快速、高通量地揭示这一基本细胞过程的分子机制。S2 细胞已被证实适用于固定细胞和活细胞成像实验。特别是，活细胞成像可提供有价值的信息，揭示基因缺失或表达下调如何影响细胞分裂过程中关键事件的动力学和动态变化，包括有丝分裂纺锤体的组装、染色体排列与分离，以及整个细胞周期的时间进程。本文中，我们利用稳定转染了荧光标记 mCherry:α-tubulin（用于标记有丝分裂纺锤体）和 GFP:CENP-A（在 Drosophila 中称为“CID”基因，用于标记着丝粒）的 S2 细胞，分析关键有丝分裂基因对细胞分裂时间进程的影响，时间范围从前期（特别是核膜破裂，即 NEBD）到后期起始阶段。该成像方案还可实现对整个有丝分裂过程中纺锤体微管和染色体动态变化的可视化观察。本文旨在提供一个简单而全面的操作流程，帮助读者轻松将 S2 细胞应用于活细胞成像实验。此类实验所得结果将有助于通过定义相关基因在多个同步且动态事件中的作用，进一步加深我们对细胞分裂相关基因的理解。在此细胞培养系统中获得的观察结果，还可利用果蝇中强大的遗传学工具在体内进行验证和深入研究。
引言
细胞分裂是所有多细胞生物在发育和维持稳态过程中至关重要的过程1。Drosophila 长期被用作研究细胞分裂的模式生物，通过对不同类型组织和遗传条件下的实验，为该过程提供了关键性认识。尽管许多认识来源于固定细胞的研究，但细胞分裂是一个动态过程，包含多个运动组分，因此对活细胞进行可视化观察对于评估RNA干扰或基因敲除对细胞分裂多个环节（包括纺锤体形成、染色体排列与分离以及胞质分裂）的影响至关重要。
多年来，已开发并使用了多种方案以在体内观察Drosophila的细胞分裂。多个研究团队已建立了对幼虫成虫盘和幼虫大脑中细胞分裂进行成像的技术2,3,4,5,6,7,8。这些技术虽然适用于特定组织的成像，但在通量方面存在局限，且通常需要构建和维持遗传品系，以产生荧光组分并调控目标基因的表达。源自Drosophila的S2细胞培养体系提供了一种通量更高的替代方法，可用于快速检测各种基因在细胞分裂中的作用。此外，由于能够转染多种荧光蛋白，S2细胞可被快速改造，以确定RNA干扰介导的基因敲低对细胞分裂多个组分的影响。带有荧光标记的目标基因也可在细胞分裂过程中被观察，从而实现对其功能的动态表征9。
本文提供了利用我们近期描述的方法对有丝分裂S2细胞进行活体成像的详细实验方案10。该方法采用稳定转染的细胞，其微管和着丝粒带有荧光标记，这些标记的表达由铜诱导型启动子（金属硫蛋白启动子，pMT）调控。该技术可利用配备基础成像软件的普通荧光显微镜，对有丝分裂各个阶段的纺锤体和染色体动态进行成像。此外，该方法还可通过瞬时转染和RNA干扰（RNAi）进行个性化调整，从而拓展研究候选基因在有丝分裂中功能的可能性。由于该实验方案相对简便，也可用于小规模的功能缺失筛选，以鉴定那些值得在体内进一步研究的基因，从而为后续在果蝇中开展更有针对性和高效率的遗传操作奠定基础。
方案
1. RNAi 处理用 S2 细胞的制备
- 从融合的 pMT:GFP:CID 和 pMT:mCherry:α-tubulin 稳定转染的 S2 细胞储备培养物（约 80% 存活率；在 24–28 ˚C 下培养）中，将细胞以 1 × 106 个细胞/mL 的密度接种于 6 孔无菌培养板中，使用新鲜预热、含 10% 胎牛血清（FBS）的 Schneider 昆虫培养基（SIM）。
注意： 稳定转染的 S2 细胞可通过 Drosophila RNAi 筛选中心（DRSC）提供的方案制备（https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells）。尽管本实验所用的特定稳定 S2 细胞系使用 GFP 和 mCherry，但在这些荧光光谱内及其他光谱中均存在多种替代选择。关于这些荧光蛋白的详细讨论超出了本方案的范围，但其特性及潜在优缺点已在其他文献中得到专业综述11。- 使用细胞计数器或血细胞计数板，测定融合细胞储备液的密度。
- 计算为在总体积为 4 mL 时达到 1 × 106 个细胞/mL 所需的融合细胞悬液体积（例如，总共约 4 × 106 个细胞）。将该体积的细胞储备液加入适量新鲜 SIM 培养基中，使每孔总体积为 4 mL。通过将 100 μL 细胞直接从储备瓶中取出并与 100 μL 培养基混合进行 1:2 稀释，然后使用血细胞计数板手动计数或使用自动细胞计数器（如有）计数，以确定细胞储备液的密度（细胞/mL）。
注意： 若使用非稳定转染的 S2 细胞，可进行瞬时转染实验，转染带有荧光标记（GFP、mCherry 等）的 α- 或 β-微管蛋白以及 DNA 标记物（CENP-A、组蛋白 H2B 等）。此外，Drosophila 遗传资源中心（https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog）提供多种带有不同有丝分裂纺锤体和 DNA 标记物的稳定转染细胞系，可能更符合用户的特定实验需求。 - 将新接种的细胞放入 24–28 ˚C 培养箱中培养 36–48 小时。
2. 对已接种细胞使用针对目的基因的dsRNA进行处理
注意： 下面的示例和结果部分将以Shortstop（Shot）作为目的基因，该基因为一种微丝-微管交联蛋白。应使用不加dsRNA的模拟处理，或使用针对无关基因（例如beta-半乳糖苷酶，lacZ）的dsRNA处理作为阴性对照。
- 在 24–28 ˚C 培养箱中预热未添加 FBS 的 Schneider 昆虫培养基（无血清培养基，SFM）。
- 将前一步接种的孔中的细胞（来自步骤 1.1.2）转移至一个 15 mL 无菌离心管中，并记录转移的细胞总体积。
- 保留少量细胞（约 100 µL）用于细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。
- 在室温下以 1,000 x g 离心 3 分钟，轻柔沉淀细胞。
- 在离心过程中，使用细胞计数仪或血细胞计数板测定每毫升细胞浓度。将该数值乘以离心的总体积（见步骤 1.2.2 记录值），得到细胞总数。
- 吸除细胞沉淀上的上清液。
- 用预热的 SFM 重悬细胞，使细胞浓度达到 3 × 106 个细胞/mL。
- 将 1 mL 重悬的细胞转移至 6 孔板中的新孔中。
- 将针对 Shot 基因（或目标基因）的 10–50 µg dsRNA（溶于 100 μL 无 RNA 酶的水中）直接加入细胞中，轻轻摇动培养板混匀。将培养板置于 24–28 ˚C 培养箱中孵育 1 小时，以使细胞直接摄取 dsRNA。
- 在 1 小时孵育期间，将添加了 10% FBS 的 SIM 培养基在 24–28 ˚C 培养箱中预热。
- dsRNA 孵育 1 小时后，直接向孔中加入 2 mL 添加 10% FBS 的 SIM 培养基，无需移除原有的 1 mL 培养基。
- 将细胞置于 24–28 ˚C 培养箱中继续培养 3–7 天。
注意： 与 dsRNA 浓度类似，总处理时间可能需要根据目标基因进行优化。为评估 RNA 干扰效率，可使用针对目标基因的抗体对全细胞裂解液进行 Western 印迹分析。若初始 dsRNA 靶序列效果不佳，可设计针对目标基因内其他独特序列的替代 dsRNA。
3. 诱导荧光蛋白表达及成像用细胞的制备
- 若使用 pMT 质粒（含有可诱导的金属硫蛋白启动子）如本文所述构建了稳定转染的细胞，则在成像前 24–36 小时以及 RNAi 处理后第 4 天，通过添加硫酸铜（CuSO4）至终浓度 500 µM 来诱导荧光蛋白的表达。若使用 pAct 等组成型表达质粒，则无需铜诱导。
- 准备用于成像的细胞
- 将含 10% FBS 的 SIM 培养基置于 24–28 ˚C 培养箱中预热 1 小时。
- 将细胞转移至一个 15 mL 无菌离心管中，并记录所转移细胞的总体积。
- 保留少量细胞（约 100 µL）用于细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。
- 在室温下以 1,000 x g 离心 3 分钟，轻柔沉淀细胞。
- 在离心过程中，使用细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞浓度（细胞/mL）。将该数值乘以待离心的细胞总体积（见步骤 2.2.2 中记录），得到细胞总数。
- 吸除沉淀细胞的上清液。
- 用新鲜预热的含 10% FBS 的 SIM 培养基重悬细胞，使细胞浓度达到 2 × 106 个细胞/mL，并加入适量 CuSO4 以维持 500 µM 的终浓度。
- 将 200–500 µL 重悬的细胞加入多孔活细胞成像培养皿的一个孔中，并置于倒置荧光显微镜下。成像前让细胞在培养皿中沉降 15–30 分钟。
注意：活细胞成像培养皿的孔可预先用多聚-L-赖氨酸包被，以增强细胞贴附。
4. 设置活细胞成像程序
注意： 本实验中的活细胞成像使用倒置成像系统及其配套软件（例如 Olympus IX83 搭配 cellSens Dimensions 软件包）完成。不同显微镜制造商和软件包的具体操作细节可能有所差异，因此以下列出通用的操作指南和步骤。
- 使用倒置荧光显微镜的控制软件，准备一个用于随时间成像细胞（或细胞群）的程序。
- 通过双击桌面上的软件图标来打开软件。
- 点击 文件，然后选择 新建实验文件，以创建一个新的实验文件。
- 首先，在程序中插入一个时间间隔循环，用于在设定时间内采集图像。通过点击工具栏中的 秒表 图标（即 时间间隔循环 图标）来实现。在 实验管理器 选项卡中设置时间间隔（单位为 s），然后通过将整个实验期望持续的总时间（单位为 s）除以该间隔，计算并设置循环次数。确保该循环覆盖所需的总时长。
注意：通常情况下，图像采集间隔为每 30–60 秒一次，持续时间为 3–4 小时。 - 在时间间隔循环层内，插入红外对焦校正步骤，以维持物镜的聚焦位置（如设备支持）。为此，请点击 带双箭头的方块 图标（即移动 XY 图标），从下拉菜单中选择 Z 轴漂移补偿，在时间间隔循环层中添加 Z 轴漂移补偿（ZDC）步骤。
注意：“红外对焦校正”指利用红外脉冲维持物镜与载玻片/成像腔之间距离恒定的系统。许多显微镜均配备此类系统，但各厂商使用的术语可能不同。读者应参考仪器操作手册或联系厂商代表以获取具体的命名信息。 - 在完成红外对焦校正后，在程序中添加一步，用于采集多通道图像（例如，FITC 通道用于 GFP，TRITC 通道用于 mCherry），并覆盖 3–5 层 z 轴堆栈图像。首先插入一个 z 轴堆栈步骤，然后指定成像通道。具体操作为：点击 色轮 图标（即 多通道组 图标），在时间间隔循环层内添加一个多通道组层；接着点击 三层图标（即 z 轴堆栈循环 图标），在多通道组层内添加一个 z 轴堆栈循环层。在 实验管理器 选项卡中设置所需的步进大小（Step Size）和切片数量（Number of Slices），并将每个通道的曝光时间尽可能调低，以减少光漂白。
注意：z 轴堆栈间隔、曝光时间以及 LED 的透光率百分比可能因实验条件而异。在本类实验中，通常在 3 µm 范围内采集 3 层 z 轴图像，即每层间隔 1 µm。将细胞中心而非顶部或底部定义为堆栈中心，通常可获得最佳成像效果。各通道图像采集参数通常为：曝光时间 50 ms，LED 透光率 50%，不启用中性密度（ND）滤光片。
5. 使用活细胞成像程序观察细胞分裂
注意：S2 细胞不需要 CO2，在 23–27 °C 下生长最佳。所有成像均在温度受控良好的室内环境温度下进行。
- 使用目镜找到孔板的顶部（或底部）角落，并通过 mCherry（α-微管蛋白）通道将物镜（40–60 倍油镜）聚焦到细胞上。
- 沿孔板的顶部（或底部）移动，远离垂直的孔间分隔壁。
注意：成像位置过于靠近孔间分隔壁可能干扰红外对焦检测。 - 寻找处于晚 G2 期或早 M 期（前期）的细胞（或细胞群）。
注意：可通过存在两个明确的“星状”微管结构（中心体）以及完整的细胞核（表现为细胞内圆形区域的折射光）来识别这些细胞，使用 α-微管蛋白（红色）激发滤光片可清晰区分。若选择更早间期的细胞（通常仅有一个或无明显可见的中心体），可能因 G2/M 期进展延迟而导致时间浪费。相反，若选择核膜破裂（NEBD）之后的细胞，则无法准确计算有丝分裂时间，也无法成像早期纺锤体组装和染色体动态变化。此外，S2 细胞常含有 >2 个中心体。尽管这些中心体通常会聚集成双极纺锤体12，但建议除非实验设计特别需要，否则应避免选用此类细胞。有关合适细胞选择的图像和讨论，请参见代表性结果部分。 - 点击实时视图按钮，开始在软件界面中观察细胞。使用显微镜的细调焦旋钮，对目标细胞（或细胞群）进行聚焦。点击设置对焦按钮，设定红外对焦基准。
- 点击开始按钮，启动延时成像程序。根据需要选择相应通道并调节平均像素强度，以清晰观察目标细胞（或细胞群）。
- 运行程序，并在 15–20 分钟后检查细胞，确认是否已发生核膜破裂（NEBD），其特征是细胞中心附近圆形暗区（折射光斑）的消失。
- 继续运行程序，并间歇性（每 15–20 分钟）检查，以确定是否已进入后期（anaphase onset）。若总成像时间仍有剩余，可在该时间点停止程序并保存文件。或者，若需观察末期（telophase）和胞质分裂（cytokinesis）过程，则应继续运行程序足够长时间，以完整成像这些过程。
- 通过记录核膜破裂（NEBD）的时间（tNEBD，单位：min）和染色体初次分离的时间（tanaphase onset，单位：min），将 tanaphase onset 减去 tNEBD，计算特定细胞从 NEBD 到后期起始的时间间隔。
- 可通过点击逐帧前进按钮，记录 NEBD 和后期起始发生的帧数，计算两者的帧数差值，再乘以成像帧间的时间间隔，得到总耗时。
- 继续扫描寻找处于分裂前期的细胞，以获得特定条件下足够的样本量（n 值）。细胞在活细胞培养腔的孔中，自初始沉降后最多可成像长达 12 小时。
结果
上述方法将实现对正在进行细胞分裂的 Drosophila S2 细胞的识别与成像。即将分裂（即即将进入 M 期）的细胞可通过其含有两个中心体以及一个完整的细胞核来识别，该细胞核在折射光下可见，并且在 α-微管蛋白通道中表现为细胞内的一个较暗斑点（图1，最左侧图组，红色通道；图1A 中箭头所示）。我们估计约有 2–5% 的细胞属于此类，在两次成像实验之间，通常最多花费 2–3 分钟寻找下一个符合条件的细胞。核膜破裂（NEBD）可通过该暗斑的消失来观察，表现为细胞质呈现均匀染色（图1，标注为“00:00”的图组，红色）。NEBD 之后，只需记录这些事件相对于 NEBD 的时间点，即可简单测量每个细胞形成纺锤体、染色体排列以及染色体分离所需的时间。
我们利用这些分裂阶段来评估有丝分裂时间，特别是从核膜破裂（NEBD）到后期起始的时间，记录染色体开始分离的时间点。大多数（约90%）经铜诱导的细胞同时表达mCherry:α-tubulin和GFP:CID。少数细胞（约10%）仅表达一种标记或两种均不表达。在细胞筛选过程中避免使用这些细胞。通常情况下，S2细胞从核膜破裂到后期起始的时间为20–30分钟（图1A，对照组）。接下来，我们用靶向Shortstop（Shot）的dsRNA处理细胞，Shot是一种肌动蛋白-微管交联蛋白，我们推测其可能影响细胞周期动态。事实上，在敲低Shot后，细胞表现出显著的有丝分裂延迟（图1B，ShotRNAi延迟），许多细胞停滞在中期，且在整个2–3小时的成像实验过程中从未进入后期（图1D，ShotRNAi停滞）。我们认为这种延迟/停滞表型很可能是由于纺锤体组装检查点（即M期检查点）被激活所致。为了直接验证这一假设，我们同时使用靶向Shot和Rough deal（Rod）的dsRNA处理细胞，其中Rod是该检查点的一个重要组分13。结果发现，这种共处理抑制了细胞停滞表型，使从核膜破裂到后期起始的时间恢复至与对照组相似的水平（图1C，ShotRNAi+RodRNAi）。因此，该活细胞成像方案使我们得出结论：Shot对于M期的正常进程是必需的，其缺失会导致检查点激活，从而延迟或阻滞有丝分裂细胞。
图1：活细胞成像揭示S2细胞中因有丝分裂检查点激活导致的细胞周期缺陷。
在所有实验条件下，均对稳定共转染了可诱导表达GFP:CID和mCherry:αTubulin的S2细胞进行活细胞成像，具体方法如文中所述。(A) 图示展示了有丝分裂过程中的关键事件，下方显示了代表性视频中指定基因型细胞的对应图像，时间点以核膜破裂（NEBD，t=00:00）为参考。对照组细胞通常在20–30分钟内进入后期。ShotRNAi处理的细胞表现出从核膜破裂到后期的延迟（B），并频繁发生中期阻滞，在整个成像过程中从未进入后期（D）。当同时用ShotRNAi和RodRNAi（纺锤体组装检查点的一个组分）处理细胞时，可抑制Shot表型，使细胞进入后期的动力学特征与对照组细胞相似（C）。(A) 中的箭头指示“星状”中心体结构，粗箭头指示细胞核。每个比例尺代表5微米。本图经许可改编并重新发表，来源10（https://www.molbiolcell.org/info-for-authors）。请点击此处查看该图的放大版本。
视频 1：对照组 S2 细胞分裂的延时电影。 该视频展示了一段代表性“对照组”基因型 S2 细胞分裂过程。本视频对应于图 1A。本视频经10许可改编并重新发布（https://www.molbiolcell.org/info-for-authors）。请点击此处下载该视频。
视频 2：延迟的“ShotRNAi”S2 细胞分裂延时录像。 该视频展示了一段典型的“ShotRNAi”基因型 S2 细胞分裂过程，表现出有丝分裂表型延迟。本视频对应于图 1B。请点击此处下载该视频。
视频3：‘ShotRNAi+RodRNAi’ S2细胞分裂的延时成像。 该视频展示了一段具有代表性的‘ShotRNAi+RodRNAi’基因型S2细胞分裂过程。本视频对应于图1C。本视频经许可改编并重新发表，来源10（https://www.molbiolcell.org/info-for-authors）。请点击此处下载该视频。
视频 4：停滞的“ShotRNAi”S2 细胞分裂延时电影。 该视频展示了一段具有代表性的“ShotRNAi”基因型 S2 细胞分裂过程，导致有丝分裂表型停滞。本视频对应于图 1D。请点击此处下载该视频。
讨论
确定合适的细胞
对分裂中的S2细胞进行成像的关键在于首先找到合适的细胞。如果误判了看似即将分裂但实际上在合理时间内并未分裂的细胞，将会浪费大量时间。必须识别出具有两个明显且可见的中心体以及完整细胞核的细胞。中心体应有微管纤维从中延伸出来，呈现出“星状”外观。当调节焦距时，完整的细胞核会折射光线，使细胞大致中心区域看起来较暗。细胞核内还应包含GFP:CID“点状”结构，这是帮助识别的另一个显著特征。应避免选择具有>2个中心体、无微管纤维延伸的微管蛋白斑点，或仅有一个中心体的细胞。此外，若可见两个中心体但无法观察到细胞核，则核膜破裂（NEBD）已经发生，细胞分裂进程已过于靠后，若需完成完整的M期分析，则不适合用于成像。一旦找到合适的细胞，迅速开始成像至关重要，因为NEBD发生得很快（通常在3-5分钟内），延迟启动成像可能导致错过关键时机。应快速在成像软件中对焦，使两个中心体均可见；若两个中心体不在同一焦平面上，则将焦点设于二者之间，以便在围绕定义的中心点上下采集Z轴层扫图像时能够同时捕获两个中心体。对焦完成后，应立即使用红外对焦检测（如具备该功能）设定载物台与活细胞培养室表面之间的偏移量，并立即启动成像程序。尽管本方案专门针对评估从NEBD至后期动态过程的实验设计，但稍作修改后也可适用于研究其他有丝分裂事件的读者。对于从NEBD至中期以及从后期至末期的成像，建议采用10秒的图像采集间隔，因为这些过程在S2细胞中高度动态且发生迅速（5-10分钟）。中期至后期的转换（本研究通常关注的实验焦点）在S2细胞中是一个较长时间的过程（20-30分钟），因此我们以30秒的间隔采集图像。最后，末期至胞质分裂在S2细胞中进行得相当缓慢，持续时间约一小时，建议采用60秒的采集间隔，以获得足够的分辨率。
在整个成像程序中保持聚焦
如果无法获得红外对焦检测装置，务必避免触碰显微镜或其所在的台面，因为这可能导致在成像程序进行过程中细胞偏离焦平面，从而产生模糊、无法解读的结果。预先用多聚-L-赖氨酸（Poly-L-lysine）包被活细胞培养腔室的孔板，有助于增强细胞贴附性，减少细胞移动，对于没有配备红外对焦检测功能的系统尤其有益。此外，使用带有减震平台或气浮台的装置，可进一步防止细胞失焦。最后，某些软件程序具备暂停功能，允许用户重新对焦后继续运行成像程序。
成像多个细胞
有助于数据积累的是，通常可将多个准备分裂的细胞置于同一视野内进行成像。这对于M期持续时间较长或存在长期停滞的细胞实验尤其有用（例如，可诱导SAC激活的条件）。对于这些细胞，我们通常持续成像直至细胞发生光漂白（约2-3小时），但停滞细胞的完整成像时长应由研究人员自行决定。有时，多个准备分裂的细胞可能位于不同的焦平面上，此时添加z轴层扫可能有助于涵盖所有细胞。增加更多的z轴层扫也可提高分辨率。然而需谨慎操作，因为这会使细胞暴露于更多的辐射，导致更快的光漂白，同时也会造成硬盘存储设备上的文件体积过大。
避免光漂白和光毒性
我们的方法描述了针对曝光时间、成像间隔、z轴层厚和LED光源透光率的具体设置，这些参数通常适用于我们的实验装置和预期结果。由于显微镜设备和实验目标可能存在差异，适用于我们系统的条件可能在其他系统中导致过早的光漂白或光毒性。光损伤可能表现为纺锤体运动缺失、微管断裂、微管动力学异常以及纺锤体检查点持续激活。为避免此类问题，一种潜在的方法是缩短曝光时间。目前大多数现代相机具有较宽的动态范围，可通过调整直方图在极低曝光条件下仍能清晰观察结构。另一种技术是延长成像间隔（例如将图像间间隔增至数分钟），从而减少在总采集时间内细胞接受光照的次数。该策略在长时间成像（数小时）时尤为有利，同时也有助于降低实验数据的文件大小。减少z轴堆栈层数也可降低光照暴露，例如使用2层甚至1层代替3层。此外，调节光源透光率百分比（针对LED光源），或使用中性密度（ND）滤光片（适用于卤素灯和LED光源），可降低光照强度，结合稍长的曝光时间仍可保持足够的成像可见性。通过选择中心体已分离的细胞进行观察，可进一步限制总体曝光时间，因为这些细胞通常在开始成像后很快（一至两分钟内）即进入有丝分裂。也可限制细胞在核膜破裂（NEBD）前的成像时间。我们实验室通常将该时间设定为10分钟，但用户可根据需要设定更为保守的限制。此外，我们建议采取一种更具“侵入性”的措施，即使用靶向纺锤体组装检查点（SAC）组分（如Rod或Mad2）的dsRNA进行处理。如果观察到的停滞表型源于非特异性细胞损伤（例如微管动力学异常），则此类处理抑制停滞的可能性较之由SAC介导的停滞更低 真正 目的基因在原始实验中的效应。
未来方向
本文所述方法可在相对简单的落射荧光显微镜上使用，以快速对活细胞分裂进行成像，并可根据研究人员特定的实验设计和目标轻松调整。已有多种优秀的培养方法、RNAi敲低技术、瞬时转染方案以及荧光显微镜技术被应用于S2及其他果蝇（Drosophila）细胞系9,14,15,16,17。本实验方案具有若干优势：（1）使用双稳定细胞系（GFP:CID，mCherry:α-Tubulin）可同时标记两种关键的有丝分裂结构，避免了瞬时转染带来的操作繁琐性和潜在干扰，并确保几乎所有细胞均表达荧光标记物，从而为成像提供充足的候选细胞；（2）该方法针对有丝分裂进行了优化，补充了已有文献中关于运动性非分裂细胞中细胞骨架动态的研究方案，拓展了实时观察有丝分裂事件的能力。尽管我们认为本技术是一种有力的补充手段，但仍存在进一步改进的空间。我们在细胞分裂过程中发现较难成像的一个特定环节是中心体分裂。该过程发生在核膜崩解（NEBD）之前，难以判断单个中心体何时准备分裂为两个。使用荧光细胞周期标记物（如Cyclin A和Cyclin B）可能有助于解决这一问题，但会占用可用于观察细胞分裂组分的荧光通道。目前我们尝试可视化中心体分裂的最佳策略是在成像程序中加入多点采集（在XY平面上定义多个成像位点），但这可能导致文件体积过大，并可能因采集点数量增加而需要延长图像采集间隔，从而降低最终视频的时间分辨率。另一种可能的解决方案是利用靶向细胞周期调控因子的药物将细胞同步至特定细胞周期阶段，成像前再洗脱药物，然而这些方法在S2细胞中可能并不可靠。
本文所述方案也为未来的活细胞成像应用奠定了基础。随着成像技术和软件技术的进步，利用更高通量、多孔板进行本方案的高通量改进将成为可能。此类创新将使大规模RNAi筛选（例如已在固定样品中实现的筛选12,18）在活细胞体系中更易于实施。小分子药物筛选也可被用于发现靶向细胞分裂过程的新型化合物。荧光团和光学滤光片的改进还可实现对多个有丝分裂组分（而不仅限于本文描述的两个）的同时成像，从而能够观察特定的有丝分裂调控因子及其与DNA和/或纺锤体的相互作用。例如，构建在DNA损伤或凋亡过程中表达荧光报告蛋白的细胞系，将有助于鉴定参与这些过程的新基因。类似的方法也可用于通过荧光标记的周期蛋白表达来研究细胞周期动态19。
披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（R01 GM108756）资助。我们感谢加州大学伯克利分校的 Gary Karpen 慷慨提供GFP:CID S2细胞系菌株，我们的GFP:CID/mCherry:αTubulin细胞系由此衍生10。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 亮线血细胞计数板 | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | 用于细胞计数 |
| cellSens 成像软件 | Olympus | ||
| CELLSTAR 细胞培养瓶，50 mL，25 cm²，聚苯乙烯材质，红色滤膜螺旋盖，透明，无菌，10 个/袋 | Greiner Bio-One | 690175 | |
| CELLSTAR 细胞培养多孔板，6 孔，聚苯乙烯材质，透明，组织培养处理，带冷凝环盖，无菌，单个包装 | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge 5804 R 离心机 | eppendorf | 货号 022623508 | |
| 五水合硫酸铜(II)，纯度不低于 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
| Corning 胎牛血清 | Fisher Scientific | MT35015CV | |
| Effectene 转染试剂 1 mL | Qiagen | 301425 | 用于瞬时转染 |
| IX-83 倒置落射荧光显微镜 | Olympus | ||
| LabTek 带腔室载玻片插件 | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
| MEGAscript T7 转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | 用于双链 RNA 制备 |
| MOXI Z Mini 自动细胞计数仪试剂盒 | ORFLO | MXZ001 | 用于细胞计数 |
| MS-2000 XY 平顶自动载物台及控制器 | Applied Scientific Instruments | ||
| Nunc Lab-Tek II 带腔室盖玻片（1.5 号硼硅酸盐玻璃），8 孔 | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Orca-Flash 4.0 LT 相机 | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
| pMT/V5-His A 果蝇表达载体 | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| 多聚-L-赖氨酸 | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Purifier Logic+ II 级 A2 型生物安全柜 | Labconco | 302310000 | |
| Schneider 昆虫培养基 | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
| Spectra Tub 离心管 | VWR | 470224-998 | |
| Uner Counter BOD 培养箱 | Sheldon Manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
| X-CITE 120 LED | Excelitas Technologies | LED 光源 | |
| Z-轴漂移补偿器 (ZDC) | Olympus | 红外对焦检测 |
参考文献
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Cell division and the maintenance of epithelial order. Journal of Cell Biology. 207 (2), 181-188 (2014).
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