Quantificação da coenzima A em células e tecidos

Resumo

Este método descreve a preparação da amostra de células cultivadas e tecidos animais, extração e derivatização da coenzima A nas amostras, seguida de cromatografia líquida de alta pressão para purificação e quantificação da coenzima a derivatizada por absorvância ou detecção de fluorescência.

Resumo

A pesquisa emergente revelou que a fonte celular da coenzima A (CoA) pode tornar-se limitando com um impacto prejudicial no crescimento, no metabolismo e na sobrevivência. A medida do COA celular é um desafio devido a sua abundância relativamente baixa e à conversão dinâmica de COA livre aos tioésteres de COA que, por sua vez, participam em reações metabólicas numerosas. Um método é descrito que navega através das armadilhas potenciais durante a preparação da amostra para render um ensaio com uma escala linear larga da deteção que seja apropriada para o uso em muitos laboratórios biomédicos.

Introdução

Coenzima A (COA) é um cofator essencial em todos os organismos vivos e é sintetizada a partir de ácido pantotênico, também chamado pantotenato (o sal do ácido pantotênico) ou vitamina B5. O CoA é o principal portador intracelular de ácidos orgânicos, incluindo ácidos de cadeia curta, como acetato e succinato, ácidos de cadeia ramificada, como propionato e metilmalonato, ácidos graxos de cadeia longa, como palmitato e oleato, ácidos graxos de cadeia muito longa, como ácidos graxos poliinsaturados e xenobióticos, como o ácido valproico. O ácido orgânico dá forma a um enlace do Tioéster enzymaticamente com o COA para permitir seu uso como um substrato em mais de 100 reaç....

Protocolo

O procedimento animal referido neste protocolo foi realizado de acordo com os protocolos 323 e 556 e especificamente aprovado pelo Comitê de cuidados e uso de animais institucionais do hospital de pesquisa infantil St. Jude.

1. preparação de soluções

Nota: Use água ultrapura para todas as soluções e quando indicado nos procedimentos.

1. Prepare 1 mM de hidróxido de potássio (KOH) em água.
2. Prepare 0,25 M KOH na água.
3. Prepare 1 M de Trizma-HCl em água e ajuste para pH 8,0.
4. Prepare 100 mM monobromobimane (mBBr) em acetonitrila (optima grade). As soluções conservadas em estoque de....

Resultados

Um método relativamente rápido e de confiança para a deteção do COA total em pilhas e em tecidos cultivados foi desenvolvido derivatização o tiol do COA a um agente fluorescente usando o mbbr, e então purificante o COA-bimane derivatizado usando a HPLC da fase reversa. Uma curva padrão é gerada pela primeira vez, onde as quantidades conhecidas e crescentes da norma CoA-bimana são injetadas individualmente e as áreas os picos dos cromatogramas CoA-bimane são plotadas em função da entrada CoA-bimana (F.......

Discussão

Aqui nós demonstramos um procedimento de confiança, passo a passo para quantificar o CoA total nas pilhas e nos tecidos animais com uma escala larga da deteção linear que seja acessível em muitos laboratórios que têm um HPLC com uma absorvência ou um detector da saída da fluorescência. Alternativamente, a espectrometria de massas é uma técnica comum para a avaliação de tioésteres de CoA e CoA, mas não está amplamente disponível devido ao custo da instrumentação e ao conhecimento especializado exigido para o desenvolvimen.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coluna SPE de gel de sílica 2-(2-piridil) -etil	Millipore-Sigma	54127-U
coenzima A	Avanti Polar Lipids	870700
Gemini C18 3 μ m 100 & Aring; Coluna para HPLC	Phenomenex	00F-4439-E0
monobromobimane	ThermoFisher Scientific	M-1378
Omni-Tip sonda disruptor tecidual	Omni International	32750H
	Parafilm Fisher	S37440
PowerGen 125 rotor motorizado homogeneizador de estator	ThermoFisher Scientific	NC0530997
Spin-X filtro de tubo de centrífuga	CoStar	8161
Trizma-HCl	Fisher	T395-1
Waters 2475 detector de fluorescência	Waters	2475
Waters 2489 detector UV-Vis	Waters	2489
Waters e2695 módulo de separações Waters e2695