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Neuroscience

आम Marmoset में Microelectrode ऐरे के प्रत्यारोपण के लिए स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी (Calithrix Jacchus)

Published: September 29, 2019 doi: 10.3791/60240
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1,3
1Edmond and Lily Safra International Institute of Neuroscience, Santos Dumont Institute, 2Neuroscience Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Physiological Sciences, Health Sciences Center, Federal University of Espírito Santo
* These authors contributed equally

Summary

यह काम आम marmoset में microelectrode सरणियों के एक स्टीरियोटैक्सिक, neurosurgical प्रत्यारोपण प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है. इस विधि विशेष रूप से स्वतंत्र रूप से व्यवहार जानवरों में electrophysiological रिकॉर्डिंग सक्षम बनाता है, लेकिन आसानी से इस प्रजाति में किसी भी अन्य समान neurosurgical हस्तक्षेप करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, दवा प्रशासन या मस्तिष्क उत्तेजना के लिए इलेक्ट्रोड के लिए cannula).

Abstract

Marmosets (Calithrix Jacchus) छोटे गैर मानव primates कि जैव चिकित्सा और पूर्व नैदानिक अनुसंधान में लोकप्रियता प्राप्त कर रहे हैं, तंत्रिका विज्ञान सहित. जातिवृत् तीय रूप से ये जंतु कृन्तकों की तुलना में मनुष्यों के बहुत निकट होते हैं। वे भी vocalizations और सामाजिक बातचीत की एक विस्तृत श्रृंखला सहित जटिल व्यवहार, प्रदर्शित करते हैं. यहाँ, आम marmoset में इलेक्ट्रोड सरणियों रिकॉर्डिंग के प्रत्यारोपण के लिए एक प्रभावी stereotaxic neurosurgical प्रक्रिया का वर्णन किया गया है. इस प्रोटोकॉल में पशु देखभाल के पूर्व और पश्चात चरणों का भी विवरण दिया गया है जो इस तरह की सर्जरी को सफलतापूर्वक करने के लिए आवश्यक हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल एक स्वतंत्र रूप से व्यवहार marmoset में स्थानीय क्षेत्र क्षमता और स्पाइक गतिविधि रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण से पता चलता है 1 सप्ताह शल्य प्रक्रिया के बाद. कुल मिलाकर, इस विधि जाग में मस्तिष्क समारोह का अध्ययन करने के लिए और स्वतंत्र रूप से marmosets व्यवहार करने का अवसर प्रदान करता है. एक ही प्रोटोकॉल आसानी से अन्य छोटे primates के साथ काम कर रहे शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, यह आसानी से अन्य प्रत्यारोपण की आवश्यकता वाले अध्ययनों की अनुमति के लिए संशोधित किया जा सकता है, जैसे उत्तेजक इलेक्ट्रोड, microinsinctions, optrodes या गाइड cannulas के प्रत्यारोपण, या असतत ऊतक क्षेत्रों के ablation.

Introduction

सामान्य marmosets (Calithrix Jacchus) तंत्रिका विज्ञान सहित अनुसंधान के कई क्षेत्रों में एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव के रूप में मान्यता प्राप्त कर रहे हैं. ये नई दुनिया प्राइमेट्स कृन्तकों और अन्य गैर-मानव प्राइमेट्स (एनएचपी) दोनों के लिए एक महत्वपूर्ण पूरक पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसे कि रीसस मैकैक। कृन्तकों की तरह, ये जानवर छोटे होते हैं, हेरफेर करना आसान होता है, और बड़े एनएचपी की तुलना में1,2,3,4की देखभाल और प्रजनन करने के लिए अपेक्षाकृत किफायती होता है। इसके अलावा, इन जानवरों में अन्य एन एच पी 1 ,2,3के सापेक्ष जुड़वां और उच्च स्त्रैणता की प्रवृत्ति होती है . एक और लाभ marmoset कई अन्य primates से अधिक है कि आधुनिक आणविक जीव विज्ञान उपकरण3,4,5,6,7 और एक अनुक्रम जीनोम2 ,3,4,5,8 आनुवंशिक रूप से उन्हें संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. दोनों नॉक-इन जानवरों lentivirus5का उपयोग कर, और दस्तक बाहर जानवरों जस्ता उंगली nucleases का उपयोग कर ($FNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह effector nucleases (TALENS)7,व्यवहार्य संस्थापक जानवरों को मिला है.

कृन्तकों के संबंध में एक लाभ यह है कि मरमोसेट , प्राइमेट के रूप में , जातिवृत् तीय रूप से मनुष्योंके3 ,5,6,9,10,11के करीब होते हैं . मनुष्यों की तरह, marmosets दैनिक जानवर है कि एक अत्यधिक विकसित दृश्य प्रणाली पर निर्भर करने के लिए उनके व्यवहार10के बहुत मार्गदर्शन कर रहे हैं. इसके अलावा, marmosets इस तरह के विभिन्न vocalizations3के उपयोग के रूप में सामाजिक व्यवहार की एक विस्तृत श्रृंखला सहित व्यवहार जटिलता प्रदर्शन, शोधकर्ताओं अन्य प्रजातियों में संभव नहीं सवालों को संबोधित करने के लिए अनुमति देता है. एक तंत्रिका वैज्ञानिक दृष्टिकोण से, marmosets lissencephaly दिमाग है, अधिक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया rhesus मैकैक9के विपरीत. इसके अलावा, marmosets एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मनुष्य के समान है, एक अधिक उच्च विकसित prefrontal प्रांतस्था9सहित. एक साथ, इन सभी विशेषताओं स्वास्थ्य और रोग में मस्तिष्क समारोह का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल के रूप में marmosets स्थिति.

मस्तिष्क समारोह का अध्ययन करने के लिए एक आम विधि stereotaxic neurosurgery के माध्यम से शारीरिक रूप से विशिष्ट स्थानों में इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपित शामिल है. इससे जागते और स्वतंत्र रूप से पशुओं के साथ व्यवहार करने वाले विभिन्न लक्ष्य क्षेत्रों में तंत्रिका क्रियाकीय की पुरानी रिकॉर्डिंग12,13. स्टीरियोटैक्सिक न्यूरोसर्जरी एक अनिवार्य तकनीक है जो अनुसंधान की कई लाइनों में इस्तेमाल की जाती है, क्योंकि यह न्यूरोएनामिकल क्षेत्रों के सटीक लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है। मैकैक और कृंतक साहित्य की तुलना में, वहाँ कम प्रकाशित marmoset करने के लिए विशिष्ट stereotaxic neurosurgery का वर्णन अध्ययन कर रहे हैं, और वे सर्जरी में शामिल कदम के विरल विस्तार प्रदान करते हैं. इसके अलावा, अधिक विस्तार के साथ उन मुख्य रूप से सिर पर संयमित जानवरों में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित14,15,16,17.

तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक मॉडल जीव के रूप में marmosets के व्यापक गोद लेने की सुविधा के लिए, वर्तमान विधि इस प्रजाति में एक सफल stereotaxic neurosurgery के लिए आवश्यक विशिष्ट कदम परिभाषित करता है. रिकॉर्डिंग सरणियों के प्रत्यारोपण के अलावा, वर्तमान विधि में विस्तृत के रूप में, एक ही तकनीक कई अन्य प्रयोगात्मक समाप्त होता है के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, रोगों के उपचार के लिए उत्तेजक इलेक्ट्रोड के प्रत्यारोपण सहित18 या कारण ड्राइविंग सर्किट व्यवहार19; निष्कर्षण और न्यूरोट्रांसमीटर के परिमाणीकरण के लिए गाइड cannulas के प्रत्यारोपण20, अभिकर्मकों के इंजेक्शन, रोग मॉडल को प्रेरित करने के लिए उन सहित12 या सर्किट अनुरेखण अध्ययन के लिए15; असतत ऊतक क्षेत्रों का अपाहिज21; ऑप्टोजेनेटिक अध्ययन के लिए ऑप्टोरोडका का प्रत्यारोपण22; cortical सूक्ष्म विश्लेषण23के लिए ऑप्टिकल खिड़कियों के प्रत्यारोपण ; और इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफिक (ईसीओजी) की प्रतिमाओं का रोपण24| इस प्रकार, इस प्रक्रिया के समग्र लक्ष्य के लिए स्वतंत्र रूप से marmosets व्यवहार में पुरानी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए microelectrode सरणियों के प्रत्यारोपण में शामिल शल्य चिकित्सा चरणों रूपरेखा है.

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Protocol

पशु प्रयोगों प्रयोगशाला पशुकी देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार प्रदर्शन किया और Santos Dumont संस्थान आचार समिति (प्रोटोकॉल 02/

1. सर्जरी की तैयारी

  1. प्रत्येक इलेक्ट्रोड सरणी एक इलेक्ट्रोड धारक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के साथ संगत करने के लिए संलग्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा.
  2. स्टीरियोटैक्सिक micromanipulator करने के लिए एक इलेक्ट्रोड धारक कनेक्ट और interaural निर्देशांक के लिए एक microwire सेट. अतिरिक्त इलेक्ट्रोड सरणियों और धारकों के लिए यह दोहराएँ, यदि आवश्यक हो.
    नोट: किसी भी microwire के interaural निर्देशांक प्रत्यारोपण संपूर्ण सरणी के लिए निर्देशांक की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि microwires के बीच सापेक्ष दूरी स्थिर है. सरणी विभिन्न लंबाई के साथ बंडलों है, सबसे लंबे समय तक तार के interaural निर्देशांक interaural शून्य स्थापित करने के लिए उपयोग करने के लिए सबसे सुविधाजनक है.
  3. स्टीरियोटैक्सिक माइक्रोमैनिप्युलेटर से इलेक्ट्रोड धारकों को अलग करें और कम से कम 2 एच के लिए एक पराबैंगनी प्रकाश (यूवी) कैबिनेट में असेंबली (इलेक्ट्रोड धारक से जुड़ी इलेक्ट्रोड) को बाँझ करें।
  4. एक stereotaxic जांच धारक के लिए एक 24 जी सुई संलग्न, micromanipulator करने के लिए कनेक्ट और सुई की नोक के लिए interaural निर्देशांक सेट.
    नोट: सर्जरी से पहले, सभी craniotomies के निर्देशांक एक परिधि के रूप में पूर्वनिर्धारित किया जाना चाहिए 200 डिग्री मीटर2 anteroposter (एपी) और सरणी के लक्ष्य प्रत्यारोपण स्थल के औसत दर्जे का (एमएल) स्थिति से बड़ा. शून्य अंतराकर्ण निर्देशांकों के आधार पर खोपड़ी में कपाल की स्थिति निर्धारित करने के लिए 24 जी सुई-प्रोब धारक असेंबली का उपयोग करें।
  5. micromanipulator से जांच धारक को अलग और कम से कम 2 एच के लिए एक यूवी कैबिनेट में विधानसभा बाँझ.
  6. इकट्ठा 6 -8 टाइटेनियम या स्टेनलेस स्टील शिकंजा. उनमें से आधे के लिए एक जमीन के तार मिलाप.
  7. व्यवस्थित करें और सर्जरी के लिए आवश्यक सभी शेष उपकरणों, उपकरण, और डिस्पोजेबल्स बाँझ।

2. पूर्व ऑपरेटिव प्रक्रियाओं

नोट: इस अध्ययन में 320-370 ग्राम वजन के दो वयस्क पुरुष मारमोसेट (कैलिथ्रेक्स जैककस) का उपयोग किया गया था। सुनिश्चित करें कि पशु संज्ञाहरण के प्रेरण से पहले 6 एच के लिए नहीं खाया है।

  1. लार और ब्रोन्कियल स्राव को कम करने के लिए एट्रोपीन (0.05 मिलीग्राम/किलोग्राम) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें। पेडल प्रतिक्रियाओं की कमी के लिए जाँच करें.
  2. 5 मिनट के बाद केटामाइन (10 डिग्री 20 मिलीग्राम/किलोग्राम) इंट्रामस्क्युलर लागू करें।
  3. एक बिजली नाई क्लिपर का उपयोग कर जानवर के सिर दाढ़ी.
  4. एक सामान्य एनाल्जेसिक के रूप में ट्रामाडोल (2 मिलीग्राम/किग्रा) इंट्रामस्क्युलर रूप से प्रशासन।
  5. जानवर को अंतर्दकर ले लिया।
    1. एक मुखौटा का उपयोग करना, गहरी संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए 1 "5 L/min की प्रवाह दर के साथ 1"2% ऑक्सीजन में आइसोफ़लुरेन के लिए marmoset बेनकाब. जब जानवर गहरा एनेस्थेटाइज़ किया जाता है, तो इसे कम करें और बनाए रखें 1 डिग्री 3 एल/
    2. टेप के साथ शल्य चिकित्सा तालिका के लिए एक लोचदार बैंड संलग्न करें।
    3. तकनीशियन की ओर सिर के साथ एक सुपाच्य स्थिति में marmoset स्थिति और अपने canines के पीछे marmoset मुंह में लोचदार बैंड जगह है.
      नोट: यह सबसे अच्छा है सिर की स्थिति ऐसी है कि पृष्ठीय सतह मंजिल की ओर इशारा किया है और उसके चेहरे तकनीशियन की ओर है.
    4. एक कपास की जांच का उपयोग करना, झाड़ू marmoset जीभ सूखी, और मुंह खुला रखने के लिए एक हाथ में यह समझ.
    5. एंडोट्रेकल ट्यूब की नोक पर 10% लिडोकेन स्प्रे करें।
    6. जब तक 4.0 सेमी निशान श्वासनली के प्रवेश द्वार पर नहीं है, तब तक बिना रुके, 2.0 मिमी व्यास का एंडोट्रेल ट्यूब को ट्रेकिया में डालें।
    7. 40 सांसों/मिनट के लिए सेट कृत्रिम वेंटीलेटर के साथ संज्ञाहरण विधानसभा के लिए ट्यूब संलग्न करें और उचित विस्तार और छाती के संकुचन की पुष्टि करें।
      नोट: इस समय isoflurane और ऑक्सीजन endotracheal ट्यूब के माध्यम से दिया जाना चाहिए, नहीं मुखौटा.
    8. Marmoset के मुंह से लोचदार बैंड निकालें ताकि एंडोट्रेकल ट्यूब जबड़े के लिए टेप किया जा सकता है।
  6. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के साथ लाइन में एक प्रवण स्थिति में marmoset स्थिति और stereotaxic फ्रेम में जानवर के सिर को ठीक.
    1. सबसे पहले, जानवर के दाहिने श्रवण नहर में सही कान पट्टी की नोक डालें।
    2. इसके बाद, बाएं कान बार की नोक को बाईं श्रवण नहर में डालें।
    3. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के केंद्र में जानवर के सिर केंद्र और जगह में कान सलाखों को ठीक।
    4. मुखपत्र को जानवर के मुंह में डालें और इसकी ऊंचाई को समायोजित करें ताकि यह जानवर के तालू को छू सके। साथ ही कक्षक की अस्थि की निचली सतह पर कक्षीय पट्टों को रखें।
    5. सुनिश्चित करें कि कक्षीय हड्डी की निचली सतह क्षैतिज रूप से कान सलाखों के केंद्र के साथ गठबंधन किया है।
  7. एक पोर्टेबल पल्स ऑक्सीमीटर को मारमोसेट के हाथ से कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि हृदय की दर सर्जरी की अवधि के लिए 154 डिग्री 180 धड़कता /मिनट (बीपीएम) के भीतर है; अक्सर 200 बीपीएम से ऊपर एक दिल की दर का अर्थ है जानवर जाग रहा है. सुनिश्चित करें कि ऑक्सीजन संतृप्ति 95% से ऊपर है। यह कभी कभी नुकसान के बिना 90% करने के लिए छोड़ सकते हैं.
    नोट: दिल की दर 154 bpm नीचे ड्रॉप चाहिए, isoflurane कमी.
  8. गुदा में एक होमोथेर्मिक हीटिंग पैड से जुड़े गुदा तापमान जांच की स्थिति, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित वांछित तापमान के साथ। यह जगह में तय रखने के लिए पूंछ के लिए इस सेंसर टेप.
  9. आंखों के लिए बाँझ नेत्र स्नेहक लागू करें।
  10. एक शल्य क्षेत्र के साथ जानवर को कवर करने से पहले chlorhexidine और povidone आयोडीन के साथ पशु के सिर को साफ और कीटाणुरहित।
    नोट: aseptic शर्तों के तहत सभी निम्नलिखित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं बाहर ले.

3. सर्जरी प्रक्रियाओं

  1. स्थानीय एनाल्जेसिक subcutaneously लागू करें (उदा., lidocaine 20 mg/mL, 0.1 एमएल) इरादा चीरा के स्थल पर. खोपड़ी के मध्य रेखा में एक चीरा बनाओ.
  2. उजागर और खोपड़ी की सतह तैयार करते हैं।
    1. सावधानी से कपाल से शंखीय पेशी को अलग करना. सबसे पहले, खोपड़ी में अपनी प्रविष्टि पर फासिया को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। फिर, धीरे एक periosteal raspatory का उपयोग कर कपाल से शंखीय पेशी को अलग.
    2. एक periosteal raspatory का उपयोग कर सभी उजागर कपाल से periosteum निकालें.
    3. यदि आवश्यक हो तो एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ खून बह रहा नियंत्रण।
    4. हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ हड्डी की सतह को साफ करें।
  3. हड्डी की सतह में उथले बर्र छेद के साथ अपने कोनों अंकन द्वारा craniotomy के स्थान को रेखांकित. फिर, अधिकतम गति (यानी, 350,000 आरपीएम) पर एक दंत ड्रिल का उपयोग कर craniotomy की परिधि बाहर ड्रिल. ओवरहीटिंग को रोकने के लिए ड्रिलिंग करते समय खोपड़ी पर बाँझ नमकीन की कुछ बूँदें जोड़ें। craniotomy की स्थिति और interaural निर्देशांक के संबंध में इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण के निर्देशांक को मापने.
  4. खोपड़ी में शिकंजा प्रत्यारोपण.
    1. ड्रिल 6 "8 पेंच पालने में छेद.
    2. शिकंजा इस तरह है कि प्रत्येक जमीन तार जुड़े पेंच के लिए और एक unaltered पेंच की निकटता में आसन्न है (यानी, यह एक जमीन से जुड़े तार के बिना) प्रत्यारोपण.
    3. आसन्न, unaltered पेंच के आसपास प्रत्येक जमीन तार हवा.
    4. जमीन के तार और प्रत्येक पेंच के बीच चांदी के रंग की एक बूंद जोड़ें।
  5. एक घुमावदार टिप (उदा., McPherson संदंश) के साथ संदंश का उपयोग कर craniotomy के केंद्र में हड्डी निकालें। बाँझ नमकीन के साथ ड्यूरा मैटर हाइड्रेटेड रखें।
  6. ड्यूरा मेटर निकालें। एक बाँझ hypodermic सुई का प्रयोग करें (25 या 26 जी) बेवल के साथ लगभग 90 डिग्री पर तुला पंचर और मस्तिष्क की सतह से दूर ड्यूरा मैटर की सतह उठा. फिर, माइक्रोसिसेर्स के साथ ड्यूरा मैटर को काटें। नमकीन के साथ उजागर मस्तिष्क हाइड्रेटेड रखें।
    नोट: यदि महत्वपूर्ण dural खून बह रहा है मनाया जाता है, का उपयोग करें cautery या बाँझ शोषक जिलेटिन स्पंज थ्रोम्बिन25में भिगो .
  7. इम्प्लांट माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियां।
    1. sterilized इलेक्ट्रोड धारक और इलेक्ट्रोड सरणी स्टीरियोटैक्सिक micromanipulator करने के लिए संलग्न करें।
    2. माइक्रोमैनिप्युलेटर को ऐसी स्थिति में डालें कि इलेक्ट्रोड वांछित एन्टेरोपोस्टर और औसतारीय निर्देशांकों पर होता है।
    3. इलेक्ट्रोड सरणी कम जब तक सबसे लंबे समय तक बंडल की नोक मस्तिष्क की सतह को छू लेती है.
    4. धीरे धीरे मस्तिष्क के ऊतकों में सरणी डालने जब तक यह dorsoventral निर्देशांक तक पहुँचता है.
    5. बाँझ, शोषक जिलेटिन स्पंज के छोटे टुकड़े के साथ उजागर प्रांतस्था कवर.
    6. उजागर खोपड़ी के लिए दंत एक्रिलिक लागू करने से खोपड़ी के लिए इलेक्ट्रोड सुरक्षित, एक पेंच, और इलेक्ट्रोड.
    7. इलेक्ट्रोड धारक को अलग करें और इसे माइक्रोमैनिप्युलेटर से निकालें।
  8. यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त सरणियों के साथ चरण 3.7 से प्रत्यारोपण प्रक्रिया दोहराएँ।
  9. एक साथ हवा और अलग सरणियों और शिकंजा की जमीन तारों वेल्ड. एक बिजली के कनेक्शन हासिल किया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए वेल्ड के आसपास एक पुल बनाने के लिए चांदी के रंग का उपयोग करें।
  10. दंत एक्रिलिक का उपयोग करना, सरणियों के पार्श्व सीमा के आसपास एक मजबूत headcap बनाने के लिए, और पूरी तरह से जमीन तारों और किसी भी उजागर खोपड़ी और शिकंजा encase.
  11. यदि आवश्यक हो, headcap में एक समर्थन पट्टी डालें. यह एक कपास झाड़ू से उन लोगों की तरह एक मजबूत प्लास्टिक सिलेंडर हो सकता है. यह दंत एक्रिलिक के साथ जगह में सील.
    नोट: यह जगह में electrophysiology केबल कनेक्टर्स हासिल करने में सहायक हो सकता है, लेकिन इस्तेमाल किया उपकरणों के आधार पर अनावश्यक हो सकता है. वर्तमान विधि में, इसी तरह की सहायता छड़ सिर के चरण से चिपका ईसर्ग है कि एक प्रत्यास्थ बैंड कनेक्टर्स पर सिर के चरणों को मजबूती से पकड़ सकता है।
  12. हेडकैप के चारों ओर त्वचा को सीवन करें।

4. पोस्टऑपरेटिव वसूली

  1. घाव के आसपास एंटीसेप्टिक समाधान (उदा., क्लोरहेक्डीन) लागू करें।
  2. आइसोफ्लुरेन आपूर्ति बंद करें लेकिन ऑक्सीजन नहीं और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से जानवर को हटा दें।
  3. पशु को एंडोट्रेकल ट्यूब के माध्यम से बनाए रखा ऑक्सीजन के साथ हीटिंग पैड पर रखें।
  4. जब न्यूरोजेनिक सजगता के पहले लक्षण, जैसे लार्निगोस्पास्म्स देखे जाते हैं, तो एंडोट्रेकल ट्यूब को निकालें।
  5. एक मुखौटा के साथ ऑक्सीजन की आपूर्ति रखें जब तक जानवर संवेदनाहारी वसूली के स्पष्ट संकेत प्रस्तुत करता है, जैसे सुरक्षात्मक सजगता, postural टोन, और ambulate करने के लिए प्रयास करता है.
  6. जानवर को अपने घर के पिंजरे में ले जाने से पहले 24 डिग्री 48 एच के लिए एक वसूली कमरे में एक साफ पिंजरे के अंदर जानवर रखें। घर प्रत्येक प्रत्यारोपित पशु व्यक्तिगत रूप से.
    नोट: क्योंकि marmosets पिंजरे की दीवारों पर चढ़ने के लिए करते हैं, चिकनी दीवारों के साथ एक पिंजरे का उपयोग करें या गिरने से जानवर को रोकने के लिए एक चिकनी सतह के साथ पिंजरे की दीवारों को कवर।
  7. सर्जरी के बाद पहले घंटे में, पिंजरे के पक्ष के खिलाफ संकट या समन्वित सिर संपर्क के लक्षण देखने के लिए जानवर का निरीक्षण करें।
  8. एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे, enrofloxacin 5 mg/kg, subcutaneously, एक दिन में एक बार 5 "7 दिनों के लिए), एनाल्जेसिक (उदाहरण के लिए, मौखिक tramadol 1 mg/kg, 3 डिग्री 5 दिनों के लिए हर 8 एच) और विरोधी भड़काऊ दवाओं (जैसे, डेक्समेथासोन 0.5 डिग्री 1.5 मिलीग्राम, एक दिन के लिए, एक दिन के लिए) .
    नोट: एक सफल सर्जरी के बाद, जानवरों को पूरी तरह से 3 "5 दिनों के भीतर ठीक हो जाएगा.

5. स्वतंत्र रूप से व्यवहार marmosets में क्रोनिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग

  1. सर्जरी के बाद कम से कम 1 सप्ताह के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग सत्र शुरू करें।
    नोट: कम से कम 1 महीने के लिए सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को शुरू करने से पहले शोधकर्ता और प्रयोगात्मक वातावरण के लिए जानवरों को आदत.
  2. प्रत्येक सत्र की शुरुआत में, इसोफ्लुरेन (1 डिग्री एल/मिन, 1% हे2) का उपयोग करके जानवर को हल्के से एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: छोटे primates के sedation के बारे में प्रासंगिक संस्था के दिशा निर्देशों का पालन करें. यदि रिकॉर्डिंग सत्र बहुत अक्सर होते हैं, तो जानवरों को संभाला जा सकता है ताकि केबल संज्ञाहरण के बिना जोड़ा जा सके।
  3. इलेक्ट्रोड सरणियों एक वाणिज्यिक तंत्रिका रिकॉर्डिंग प्रणाली से कनेक्ट करें.
  4. पशु को प्रयोगात्मक कक्ष के अंदर रखें।
    नोट: यहाँ प्रयुक्त प्रयोगात्मक कक्ष एक घन एक्रिलिक बॉक्स (0.45 मीटर x 0.45 मीटर x 0.45 मीटर) राशि और सहज मोटर गतिविधि के पैटर्न का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है26,27.
  5. पशु पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है यह सुनिश्चित करने के लिए रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    नोट: Isoflurane एक तेजी से शुरुआत और ऑफसेट कार्रवाई जो तेजी से sedation और जागृति28के लिए अनुमति देता है. एक बार isoflurane आपूर्ति बंद कर दिया है, जानवर को जगाने के लिए शुरू कर देंगे. जानवर जाग रहा है जब यह ईमानदार स्थिति में रहता है और गिरने के बिना प्रयोगात्मक कक्ष में स्वतंत्र रूप से ambulate कर सकते हैं. यह कम से कम 15 मिनट लगते हैं. किसी भी शामक प्रभाव की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए, isoflurane बंद कर दिया है के बाद रिकॉर्डिंग 30 मिनट शुरू करते हैं।
  6. माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी प्रत्यारोपण पोस्टमार्टम की स्थिति की पुष्टि NISSL द्वारा फिक्सिंग और ऊतक29अनुभाग के बाद धुंधला .

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Representative Results

इस अध्ययन का उद्देश्य आम marmoset में electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए microelectrode सरणियों के प्रत्यारोपण के लिए एक stereotaxic neurosurgical प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए किया गया था. एक ठेठ सर्जरी (एनेस्थेसिया प्रेरण से संज्ञाहरण वसूली करने के लिए) लगभग के लिए पिछले जाएगा 5 "7 एच, अनुपचारित सरणियों की संख्या पर निर्भर करता है. यहाँ, दो सरणियों सममित प्रत्यारोपित किया गया, प्रत्येक मस्तिष्क गोलार्द्ध में एक. प्रत्येक सरणी निहित 32 स्टेनलेस स्टील microwires सात बंडलों में व्यवस्थित बेसल ganglia-corticothalamic सर्किट के कई संरचनाओं को लक्षित (चित्र 1),लेकिन इलेक्ट्रोड डिजाइन और लक्षित मस्तिष्क क्षेत्रों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं प्रयोग. सफल सर्जरी और पश्चात प्रक्रियाओं के बाद, पशु पूरी तरह से 3 डिग्री 5 दिनों के भीतर बरामद किया जाना चाहिए। यदि सरणी को जमीन पर रखा गया है और ठीक से प्रत्यारोपित किया गया है तो स्पाइक्स को रिकॉर्ड करना संभव होगा (चित्र 2क) और स्थानीय क्षेत्र संभाव्यता (चित्र 2 ख) कई हफ्तों या महीनों में पशुओं के साथ स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने से पहले, परिपक्व ग्लियोटिक निशान स्थापित होने से पहले 13,30. एक उदाहरण के रूप में, यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रतिमान में एकत्र इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा को प्रभावी ढंग से सहज, जमीन आधारित के दौरान बेसल गैंगलिया-कॉर्कोथैलेमिक सर्किट के विभिन्न क्षेत्रों की समवर्ती गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है पार्किंसंस रोग26के एक मॉडल में चलन |

अंत में, एक सफल सर्जरी भी लक्षित संरचनाओं में arrays प्रत्यारोपण शामिल है. गैर इनवेसिव इमेजिंग के तरीके, जैसे एमआरआई या टोमोग्राफी सर्जरी के बाद और प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले किया जा सकता है। इस तरह की पद्धति का उपयोग केवल तभी संभव होगा जब उपयोग किए गए विशिष्ट प्रत्यारोपण ों को ऐसी तकनीकों के साथ संगत बनाने के लिए निर्मित किया जाता है, और यदि शोधकर्ता के पास उपयुक्त छोटे पशु उपकरणों तक पहुंच है। अंतिम पुष्टि भी पोस्टमार्टम किया जा सकता है. इलेक्ट्रोड पटरियों युक्त Nissl दाग वर्गों ठीक प्रत्येक प्रत्यारोपित microwire की स्थिति निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्र 3) . ध्यान दें कि कोरोनल वर्गों में इलेक्ट्रोड पटरियों ऊतक में आँसू के रूप में दिखाई देते हैं. इस प्रकार चरम देखभाल का उपयोग किया जाना चाहिए जब अनुभागीकरण व्याख्या उलझन में होगा कि कलाकृतियों बनाने की संभावना को कम करने के लिए किया जाता है.

Figure 1
चित्र 1: छोटे प्राइमेट में प्रत्यारोपण के लिए Microelectrode सरणी. सरणी 32 स्टेनलेस स्टील microwires से बना था. तार व्यास में 50 डिग्री थे और निम्नलिखित क्षेत्रों तक पहुँचने के उद्देश्य से सात बंडलों में आयोजित किए गए: प्राथमिक मोटर प्रांतस्था (एम 1), putamen (पुत), caudate (सीडी), ग्लोबस pallidus (GPe), ventrolateral और ventroposter पार्श्व thalamic नाभिक (VPL), और अवथैलेमिक नाभिक (एसटीएन)। प्रत्येक बंडल में अंतराइलेक्ट्रोड रिक्ति 300 डिग्री उ थी। interbundle रिक्ति प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र के लिए लक्ष्य निर्देशांक पर निर्भर करता है. माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी डिजाइन और विनिर्माण के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी निकोलिस31, लेहेव और निकोलिस32, और डिजिरासा एट अल33में पाई जा सकती है . स्केल बार - 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि electrophysiological परिणाम एक सफल सर्जरी के बाद. बाएं पैनल दो न्यूरॉन्स की स्पाइक गतिविधि से पता चलता है (पीला और हरे waveforms) एक इलेक्ट्रोड से दर्ज की गई. सही पैनल 14 इलेक्ट्रोड से दर्ज स्थानीय क्षेत्र संभावित दोलनों से पता चलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: Nissl दाग ऊतक अनुभाग एक इलेक्ट्रोड ट्रैक का प्रदर्शन. इस खंड (एंटीरोपोस्टर निर्देशांक, interaural लाइन के सापेक्ष: +8.0, Paxinos और वाटसन द्वारा एटलस के अनुसार34) Putamen पर टिप के साथ एक इलेक्ट्रोड ट्रैक दर्शाया गया है, के रूप में काले त्रिकोण द्वारा संकेत दिया. स्केल बार - 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह काम marmoset मस्तिष्क में microelectrode रिकॉर्डिंग सरणियों के प्रत्यारोपण में शामिल प्रक्रियाओं का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है. यह एक ही प्रोटोकॉल आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है जब इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण, चाहे घर का बना या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, अन्य छोटे primates में. इसके अतिरिक्त, यह आसानी से मस्तिष्क संरचनाओं के सटीक लक्ष्यीकरण की आवश्यकता है कि अन्य प्रयोगात्मक समाप्त होता है के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल उद्देश्यपूर्ण stereotaxic निर्देशांक और कपाल ड्रिलिंग तकनीक के बारे में अस्पष्ट है, क्योंकि उन पहलुओं है कि सबसे भिन्न हो सकते हैं. उदाहरण के लिए, इस सर्जरी में इस्तेमाल सरणियों प्रत्यारोपण करने के लिए, craniotomies प्रत्येक गोलार्द्ध में दो उचित आकार खिड़कियों को खोलने के लिए प्रदर्शन किया गया. हालांकि, जब मजबूत प्रत्यारोपण, व्यक्तिगत संरचनाओं, गाइड cannulas के रूप में, न तो यह और न ही durectomy आवश्यक है. बल्कि, ड्यूरा के स्तर के लिए एक साधारण बर्र छेद पर्याप्त होगा। इसी तरह, जब nonelectric प्रत्यारोपण शामिल हैं यह शिकंजा जमीन के लिए आवश्यक नहीं है. इस प्रकार, शल्य प्रोटोकॉल में चरण 3.9 छोड़ा जा सकता है। इसके बजाय, दंत एक्रिलिक बस उजागर खोपड़ी को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रत्यारोपण, और शिकंजा.

स्टीरियोटैक्सिक न्यूरोसर्जरी के विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्य के बावजूद, दी गई प्रक्रिया का सफल कार्यान्वयन काफी हद तक अच्छे शल्य चिकित्सा प्रथाओं के आसपास घूमती है। इसका अर्थ यह है कि पश्चातसंक्रमणको रोकने के लिए पश्चात संक्रमण को रोकने के लिए एसेप्टिक परिस्थितियों में शल्य चिकित्सा करने के लिए कठोर प्रोटोकॉल का पालन किया जाना चाहिए . सबसे महत्वपूर्ण क्षणों में से कुछ प्रेरित कर रहे हैं और संज्ञाहरण को हटा. इसलिए यह आवश्यक है कि पशु के महत्वपूर्ण लक्षण (दिल की दर, रक्त ऑक्सीजन संतृप्ति, और शरीर के तापमान) पूरी शल्य प्रक्रिया36भर में नजर रखी जा सकती है। यदि ऑक्सीजन संतृप्ति में समवर्ती गिरावट के साथ दिल की दर में कमी होती है, तो पुष्टि करें कि छाती सामान्य रूप से फुलाना और deflating है, अन्यथा श्वास मशीन के लिए कनेक्शन गलती पर हो सकता है। पहली बात यह है कि दिल की दर और ऑक्सीजन संतृप्ति ठीक करने का प्रयास करने के लिए किया जा सकता है isoflurane एकाग्रता को कम करने के लिए है. यदि यह समस्या हल नहीं होती है, atropine दिल की दर को बढ़ाने और जानवर को स्थिर करने का प्रयास करने के लिए इंट्रामस्क्युलर द्वारा प्रशासित किया जा सकता है। यह बेहद सावधानी से किया जाना चाहिए, क्योंकि पिछले अनुभव से पता चलता है कि पर्याप्त isoflurane बिना 200 बीपीएम से ऊपर एक दिल की दर जानवर को जगाने होगा.

कृन्तकों के विपरीत, प्राइमेट में सभी निर्देशांकों को अंतराकर्ण निर्देशांक के सापेक्ष मापा जाता है, न कि ब्रीग्मा और लैम्बडा34के सापेक्ष । इसलिए, यह stereotaxic उपकरण में जानवर के सिर फिक्सिंग से पहले इलेक्ट्रोड सरणियों और अन्य जांच के interaural शून्य निर्देशांक को मापने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, marmosets में क्षैतिज विमान कक्षीय हड्डी के निचले मार्जिन और बाहरी श्रवण meatus के केंद्र के माध्यम से गुजर विमान के रूप में परिभाषित किया गया है. इस प्रकार, यह stereotaxic फ्रेम में सिर फिक्सिंग से पहले कान सलाखों के केंद्र के साथ कक्षीय हड्डी के निचले सतह संरेखित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, मारमोसेट की अस्थायी मांसपेशियों में कपाल के एक विस्तृत क्षेत्र को कवर किया जाता है। इस प्रकार, कई तंत्रिका लक्ष्य के तहत या इस पेशी के लिए बहुत करीब निकटता में प्रदर्शन किया जा करने के लिए craniotomies की आवश्यकता है। क्योंकि इन मांसपेशियों marmoset संचार38के लिए महत्वपूर्ण हैं, सर्जन धीरे धीरे और ध्यान से कपाल से इस पेशी को अलग करने के लिए क्षति को कम करना चाहिए.

व्यवहार कार्य के साथ परिचित शोधकर्ताओं या तो कृन्तकों या marmosets कई सीमाओं के बारे में पता होना चाहिए जब स्वतंत्र रूप से व्यवहार NHPs में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रदर्शन. सबसे पहले, वर्तमान व्यवस्था और उच्च घनत्व सरणियों या एकाधिक सरणियों को शामिल दूसरों में, यह संभावना है कि प्रकाश संज्ञाहरण inducing केबल कनेक्टर्स संलग्न करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, यहां तक कि उचित habituation के बाद. इस प्रक्रिया, जबकि NIH और अन्य देशों के नियामक दिशा निर्देशों के दायरे के भीतर, कम से कम marmoset पर मानसिक और शारीरिक तनाव को कम करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि शोधकर्ता यह सुनिश्चित करें कि डेटा अधिग्रहण शुरू करने से पहले पशु संज्ञाहरण से पूरी तरह से बरामद हो जाए, अन्यथा संज्ञाहरण डेटा39को भ्रमित कर सकता है। एक अन्य संबंधित सीमा ही केबल की शारीरिक उपस्थिति है. जबकि वायरलेस रिकॉर्डिंग समाधान उपलब्ध होते जा रहे हैं40,अधिक आम वायर्ड विकल्प जानवर पर एक भौतिक प्रतिबंध लगाने. अंत में, प्रयोगात्मक कक्ष का इस्तेमाल किया जा रहा भी marmoset के लिए उपलब्ध व्यवहार की सीमा को प्रतिबंधित करेगा. कृन्तकों के विपरीत, marmosets अद्वितीय व्यवहार (उदा., चढ़ाई) है कि प्रयोगात्मक कक्ष इस्तेमाल किया जा रहा है के आधार पर संभव नहीं होगा प्रदर्शित करते हैं.

भौतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग के क्षेत्र में प्रगति उपन्यास तंत्रिका इंटरफेस41के लिए अग्रणी रहे हैं. प्रभावी neurosurgical प्रक्रियाओं, इस तरह के एक इस पांडुलिपि में वर्णित के रूप में, शोधकर्ताओं marmosets में इन नए और आगामी उपकरणों को लागू करने की अनुमति देगा. आणविक जीव विज्ञान में समवर्ती घटनाओं के साथ संयुक्त3,4,5, marmosets तंत्रिका विज्ञान में महत्वपूर्ण बुनियादी और नैदानिक सवालों की जांच की अनुमति देने की क्षमता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकफिल्माऔर संपादन के साथ तकनीकी सहायता के लिए बर्नार्डो Luiz शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम के लिए Santos Dumont संस्थान (ISD), ब्राजील के शिक्षा मंत्रालय (MEC) और Coordena-o de Aperfeiomento de Pessoal de Nvel सुपीरियर (CAPES) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipments
683 Small Animal Ventilator Harvard Apparatus, Inc. 55-0000
Anesthesia Assembly BRASMED COLIBRI
Barber Clippers Mundial HC-SERIES
Dental Drill Norgen B07-201-M1KG
Homeothermic Heating Pad and Monitor Harvard Apparatus, Inc. 50-7212
Marmoset Stereotaxic Frame Narishige Scientific Instrument Lab SR-6C-HT
Patient Monitor and Pulse Oximeter Bionet Co., Ltd BM3
Stereotaxic Micromanipulator Narishige Scientific Instrument Lab SM-15R
Surgical Microscope Opto SM PLUS IBZ
Instruments
Allis tissue forceps Sklar 36-2275
Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth Rhosse RH11078
Angled McPherson Forceps Oftalmologiabr 11301A
Curved Surgial Scissors Harvard Apparatus, Inc. 72-8422
Curved Tissue Forceps Sklar 47-1186
Delicate Dissection forceps WPI WP5015
Dental Drill Bit Microdont ISO.806.314.001.524.010
Essring Tissue Forceps Sklar 19-2460
FG 1/4 Dental Drill Bit Microdont ISO.700.314.001.006.005
Halsey Needle Holder WPI 15926-G
Halstead Mosquito forceps WPI 503724-12
Hemostatic Forceps, Straight Sklar 17-1260
Jewler Forceps Sklar 66-7436
McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point Argos Instrumental ARGOS-4004
Pereosteal Raspatory Golgran 38-1
Scalpal Handle Harvard Apparatus, Inc. 72-8354
Screwdrivers Eurotool SCR-830.00
Sodering Iron Hikari 21K006
Surgical Scissor Harvard Apparatus, Inc. 72-8400
Toothed forceps WPI 501266-G
Disposables/Single Use
1 ml sterile syringe with 26 G needle Descarpack 7898283812785
130 cm x 140 cm surgical field, presterilized ProtDesc 7898467276344
24G Needle, presterilized Descarpack 7898283812846
50 cm x 50 cm surgical field, presterilized Esterili-med 110100236
Cotton Tipped Probes, Presterilized Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD 23007
Cotton tipped Qutips Higie Topp 7898095296063
Electrode Array Home made
Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm Solidor 7898913077201
Tinned copper wire, 0.15 mm diameter
M1.4x3 Stainless steel screws USMICROSCREW M14-30M-SS-P
Medical Tape Missner 7896544910102
Nylon surgical sutures Shalon N540CTI25
Scalpal Blade, presterilized AdvantiVe 1037
solder Kester SN63PB37
Sterile Saline 0.9% Isofarma 7898361700041
Sterile Surgical Gloves Maxitex 7898949349051
Sterile Surgical Gown ProtDesc 7898467281208
Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized Héika 7898488470315
Gelfoam Pfizer
Drugs/Chemicals
0.25mg/ml Atropine Isofarma
10% Lidocaine Spray Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. 7896676405644
2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic Chemitec 0137-02
Dexametasona Veterinary Anti inflammatory MSD R06177091A-00-15
Hydrogen Peroxide Farmax 7896902211537
Isoflourane BioChimico 7897406113068
Jet Acrylic polymerization solution Artigos Odontológicos Clássico
Jet Auto Polymerizing Acrylic Artigos Odontológicos Clássico
Ketamine 10% Syntec
Lidocaine and Phenylephrine 1.8 ml local anesthetic SS White 7892525041049
Povidone-Iodine solutiom Farmax 7896902234093
Riohex 2% surgical Soap Rioquímica 7897780209418
Silver Paint SPI Supplies 05002-AB
Tramadol chloride 50 mg/ml União Química 7896006245452
Refresh gel (polyacrylic acid) Allergan

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 151 marmoset स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी न्यूरोसर्जरी गैर मानव primates microelectrode सरणी
आम Marmoset में Microelectrode ऐरे के प्रत्यारोपण के लिए स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी (<em>Calithrix Jacchus</em>)
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