Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Resumen

Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Resumen

La dinámica de desarrollo puede ser seguida por una microscopía confocal de lapso de tiempo de embriones de pez cebra transgénicos vivos que expresan fluorescencia en tejidos o células específicos. Una dificultad con el desarrollo de embriones enteros es que los embriones de pez cebra crecen sustancialmente en longitud. Cuando se monta como se hace regularmente en 0.3-1% baja agarosa de fusión, la agarosa impone restricción de crecimiento, dando lugar a distorsiones en el cuerpo del embrión blando. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal de lapso de tiempo, el embrión debe ser inmovilizado. Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen la motilidad de los embriones mientras permiten el crecimiento sin restricciones. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones. Para demostrar la usabilidad de este método, el desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros se realizó en peces transgénicos durante 55 horas consecutivas. Este método de montaje se puede utilizar para obtener imágenes fáciles y de bajo costo de embriones enteros de peces cebra utilizando microscopios invertidos sin necesidad de moldes o equipos especiales.

Introducción

El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo para la biología del desarrollo, y la microscopía es el principal método para visualizar el desarrollo embrionario. Las ventajas de utilizar embriones de pez cebra para estudios de desarrollo incluyen pequeño tamaño, claridad óptica, desarrollo rápido y alta fecundidad de los peces adultos. La generación de líneas transgénicas de peces cebra que expresan fluorescencia en ciertos tejidos o células han permitido una visualización directa del desarrollo de tejidos de maneras no posibles con animales vertebrados más grandes. En combinación con la microscopía de lapso de tiempo, los detalles y la dinámica del de....

Protocolo

El trabajo animal presentado aquí fue aprobado por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUCs) de la Universidad de Houston y la Universidad de Indiana.

1. Cría de pescado

NOTA: El trabajo con modelos de vertebrados requiere un protocolo aprobado por la IACUC. Debe llevarse a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes.

1. Mantener el pez cebra adulto como se describe en la literatura publicada anteriormente⁹.
2. Por la tarde, coloque el pez cebra adulto en tanques de cría. Criar machos a hembras en una proporción de 1:2.....

Resultados

Desarrollo del método de montaje
El objetivo principal de este trabajo era desarrollar una técnica de montaje de bajo costo para la toma de imágenes de lapso de tiempo del desarrollo de peces cebra durante largos períodos de tiempo. El método de montaje en capas fue desarrollado para permitir el crecimiento completo del frágil cuerpo embrionario de pez cebra, al tiempo que restringe sus movimientos. Si la concentración de agarosa de la capa 1 es demasiado alta, los embriones se distorsionarán y curvar.......

Discusión

Aquí se describe un método de montaje para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de peces cebra. El paso más crítico para el método de montaje es identificar la concentración óptima de agarosa que permitirá el crecimiento sin restricciones del embrión del pez cebra, y al mismo tiempo mantener los embriones en una posición completamente fija para la toma de imágenes confocales. Debido a que la concentración óptima de agarosa es muy estrecha, este valor es muy sensible a los errores en l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa de bajo punto de fusión	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Almacene la solución disuelta a 4 & grados; C
Platos con fondo de vidrio de 35 mm con cubreobjetos n.º 0 y fondo de vidrio de 10 mm de diámetro	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Almacene la solución disuelta a 4 & grados; C
N-feniltiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Almacene la solución disuelta a -20 ° C
Micro cubreobjetos 22x22 mm	VWR	48366 067
Microscopio de fluorescencia Leica DMi8	Leica	NA
LAS X Software	microscopio	Leica	NA
DMC4500 cámara de microscopio digital	Leica	NA
Nikon A1S Microscopio confocal	Nikon Instruments Inc.
Nikon NIS AR Versión 4.40	Nikon Instruments Inc.	de	microscopio

Software de NASoftware NA