本方案旨在建立泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的特异性蛋白质组，以鉴定与特定条件（如处理方式或表型）相关的这类翻译后修饰（PTMs）的变化。
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本文内容
摘要
摘要
泛素（ub）和泛素样蛋白（ubl）介导的蛋白质翻译后修饰通过调控蛋白质的稳定性、活性、相互作用以及细胞内定位，在细胞内发挥重要的生物学调控作用。这些修饰使细胞能够响应信号并适应环境变化。这些机制的异常可导致严重的病理状况，例如神经退行性疾病和癌症。本文所述技术的目的是从培养的细胞系中快速、准确地建立依赖于泛素/泛素样蛋白的翻译后修饰谱。通过比较不同条件下获得的修饰谱，可以鉴定出特定的改变，例如由某种处理所诱导的变化。采用慢病毒介导的细胞转导方法，构建稳定表达双标签（6His 和 Flag）修饰蛋白（如泛素或 SUMO1、Nedd8 等泛素样蛋白）的细胞系。这些标签可用于从细胞中纯化泛素及其修饰的蛋白质。纯化过程分为两步：第一步利用 6His 标签在变性条件下进行，第二步利用 Flag 标签在天然条件下进行。该方法可实现对修饰蛋白的高度特异性和高纯度分离，随后通过液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）对这些蛋白进行鉴定和半定量分析。使用 Excel 软件对质谱数据进行简便的生物信息学分析，可通过去除背景信号建立翻译后修饰谱。通过比较不同条件下的修饰谱，识别出特异性改变，并进一步采用常规生物化学技术对其进行验证和深入研究。
引言
本文提出的方法旨在研究培养的哺乳动物细胞中由泛素家族成员介导的蛋白质翻译后修饰（PTMs），以鉴定与特定条件（如处理、分化等）相关的潜在改变。PTMs是蛋白质功能调控的最终步骤1。事实上，一旦通过翻译机制生成，大多数甚至所有蛋白质都会经历不同类型的PTMs，这些修饰可调节其活性、分子相互作用以及细胞内定位1。在众多PTMs中，由泛素蛋白家族介导的修饰尤为关键，包括泛素本身及所有类泛素蛋白，它们具有调控所有细胞内或部分胞质蛋白的潜力2。由于这些分子本身也是蛋白质，它们可以彼此共价连接，形成具有不同拓扑结构的同源或异源链，每种结构均与特定的调控功能相关联2。因此，亟需开发工具来解析并理解这一复杂的调控系统。目前全球已发展出多种方法，各有优缺点，本文所提出的方法性能优越，适用于培养细胞体系。
该方法的主要优势在于其准确性。事实上，通过联合使用两种标签（6His 和 Flag）以及两步纯化流程，分离得到的修饰蛋白纯度显著提高，因此比单一标签融合Ub/Ubl3,4更具选择性。6His标签的存在使得可在完全变性条件下进行第一步纯化，从而避免了含有泛素结合结构域的蛋白或其他与泛素化蛋白....
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方案
1. 生成稳定表达6His-Flag-Ubl的细胞系
注意：将 pCCL-6HF-Ubl、pVSVG 和 delta-Helper 质粒共同转染至 HEK-293T 细胞中。
- 第0天：将293T细胞接种于6孔板中，使次日细胞融合度达到50-70%。
- 第1天：使用慢病毒生产用的转染试剂和方案，将50-70%融合度的细胞与转染混合物共转染，混合物包含1 µg pCCL-6HF-Ubl或pCCL-GFP、1 µg pVSVG和1 µg delta-Helper载体。转染6小时后，更换为适合待转导细胞的新鲜培养基。将待转导的细胞接种于6孔板中，使次日（开始转导当天）细胞融合度达到10-20%。
- 第2天：转染24小时后，收集含有慢病毒颗粒的培养基，并用0.45 µm滤器过滤。如需，此时可加入新鲜培养基以生产第二批慢病毒。将含有慢病毒的培养基替换待转导细胞（10-20%融合度）的原有培养基。
注意：慢病毒培养基可在+4 °C保存数天，或在-80 °C长期保存数月。 - 将细胞在标准培养箱（37 °C，5% CO2）中与慢病毒共同孵育24至72小时，然后更换为新鲜的标准培养基。若条件允许，使用倒置荧光显微镜观察GFP表达，以评估转导效率：包括表达细胞的百分比及单个细胞的相对表达水平。若未检测到荧光信号，可再等待2-3天，因表达时间可能因待转导细胞类型而延长。
- ....
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结果
转导培养的哺乳动物细胞以构建表达 GFP 和 6HF-Ub 的细胞
为制备后续用于转导 MiaPaCa-2 细胞的慢病毒，将 70% 汇合度的 HEK-293T 细胞与等量的三种质粒共转染，即 pCCL-6HF-Ubiquitin 或 GFP/Delta-Helper/pvSvG。慢病毒产生 24 小时后，收集含病毒颗粒的培养基并进行过滤。此时可通过倒置显微镜观察表达 GFP 的 293T 细胞的绿色荧光，以检测转染效率，荧光阳性细胞比例应接近 100%。将 MiaPaCa-2 细胞与慢病毒上清共孵育 1 至 3 天。首先通过观察 GFP 转导细胞的 GFP 荧光来检测慢病毒转导效率（图 1A 上图）。GFP 表达水平在不同细胞间可能有所差异，但所有细胞均应呈现荧光。完成该检测后，还需检测 Flag-泛素的表达情况，可通过使用抗 Flag 抗体（通常为 M2 单克隆抗体）进行免疫荧光染色来实现（图.......
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讨论
我们已开发出一种稳健且可靠的方法，用于生成由泛素家族主要成员修饰的蛋白质谱型。事实上，我们已成功应用该方案生成了泛素、SUMO和Nedd8介导的翻译后修饰谱型，并检测了与治疗相关的改变7，以及在特定基因过表达或敲低（数据未显示）情况下，或在获得对多种化疗药物耐药表型的细胞中所发生的修饰变化。
在实验过程中，操作者需特别注意的步骤并不多。在吸取珠子（Ni-NTA 或抗 Flag 偶联珠）时，必须充分重悬珠子，尤其是抗 Flag 珠子，因其悬浮于黏稠的甘油缓冲液中；同时应剪去吸头末端一小段以增大孔径。另一个注意事项是应缓慢移液，以避免珠子堆积。其他关键步骤包括使用咪唑和 Flag 肽进行洗脱。洗脱后，必须使用洁净的汉密尔顿注射器收集上清液，以尽可能避免吸到仍结合有非特异性蛋白的珠子。
根据细胞类型和质谱分析所需的最终材料量，可相应增加或减少起始材料的用量。此时唯一需要调整的是镍珠的体积，应按照每1 mg裂解液蛋白使用2 µL镍珠的比例进行。有时纯化得到的蛋白量可能过低，此时应检测带标.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由法国抗癌联盟（La Ligue Contre le Cancer）资助HV和MS，由抗癌研究协会（ARC）资助PS，由法国国家癌症研究院（INCa）和普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸癌症研究中心（Canceropole PACA）资助JI。马赛蛋白质组学质谱平台（marseille-proteomique.univ-amu.fr）得到了IBISA（生物、健康与农学基础设施）、艾克斯-马赛技术平台、普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸癌症研究中心（Cancéropôle PACA）、普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区、帕奥利-卡尔梅特研究所（Institut Paoli-Calmettes）以及马赛癌症研究中心（Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ANTI-FLAG M2 亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | 可结合所有 Flag 标签蛋白 |
| 抗 Flag M2 抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | 用于检测 6His-Flag 标签的泛素/泛素样蛋白表达 |
| 细胞筛网 40 µm | Falcon | 352350 | 用于从盐酸胍裂解的细胞中去除漂浮的沉淀物 |
| Flag 肽段 | Sigma-Aldrich | F3290 | 从抗 Flag 珠粒中洗脱 Flag 标签蛋白 |
| 盐酸胍 | Sigma-Aldrich | 50933 | 变性剂，用于使细胞裂解液中的所有蛋白质变性 |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | I5513 | 从 Ni-NTA 珠粒中洗脱 6His 结合蛋白 |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | 用于转染 HEK-293T 细胞以产生慢病毒 |
| 低吸附管（Lobind 管） | Sigma-Aldrich | Z666491 | 避免珍贵样品的吸附损失 |
| 膜滤器，0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | 用于过滤慢病毒上清液 |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | 用于纯化 6His 标签蛋白 |
参考文献
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M.
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