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Biology

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और टी-सेल में माइटोकॉन्ड्रियल मास और झिल्ली क्षमता का मापन

Published: December 26, 2019 doi: 10.3791/60475
Automatic Translation
*1,2, 3, 1,3, 1, 2,4, *1
1Department of Oncology UNIL CHUV, Ludwig Institute for Cancer Research Lausanne, University of Lausanne, 2Swiss Institute for Experimental Cancer Research (ISREC), School of Life Sciences, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL), 3Center of Experimental Therapeutics, Department of Oncology, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, 4Hematology Service, Department of Oncology, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV)
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम पूर्व वीवो सुसंस्कृत हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और झिल्ली क्षमता को मापने के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

quiescence, आत्म नवीकरण, और भेदभाव का एक अच्छा संतुलन हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) पूल को संरक्षित करने और सभी परिपक्व रक्त कोशिकाओं के आजीवन उत्पादन को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । हाल के वर्षों में सेलुलर चयापचय एचएससी समारोह और भाग्य के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में उभरा है । हमने पहले यह दर्शाया है कि माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म का मॉड्यूलेशन एचएससी भाग्य को प्रभावित करता है। विशेष रूप से, रासायनिक रूप से इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला को अनकपलिंग करके हम संस्कृति की स्थिति में एचएससी फ़ंक्शन को बनाए रखने में सक्षम थे जो आम तौर पर तेजी से भेदभाव को प्रेरित करते हैं। हालांकि, एचएससी संख्या सीमित अक्सर एचएससी चयापचय को मापने के लिए मानक परख के उपयोग को रोकना और इसलिए उनके समारोह की भविष्यवाणी । यहां, हम एक साधारण प्रवाह साइटोमेट्री परख की रिपोर्ट करते हैं जो एचएससी जैसी दुर्लभ कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान के विश्वसनीय माप की अनुमति देता है। हम माउस बोन मैरो से एचएससी के अलगाव और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और झिल्ली संभावित पोस्ट पूर्व वीवो संस्कृति के माप पर चर्चा करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम एक मेटाबोलिक मॉड्यूलर के साथ उपचार के माध्यम से एचएससी में इन मापदंडों का मॉड्यूलेशन दिखाते हैं। इसके अलावा, हम मानव परिधीय रक्त-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं और मानव ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइट्स (TILs) पर इस पद्धति के आवेदन का विस्तार करते हैं, जो उनके माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइल में नाटकीय अंतर दिखाते हैं, संभवतः विभिन्न टी सेल को दर्शाती है कार्यक्षमता. हमारा मानना है कि इस परख को विभिन्न संदर्भों में विभिन्न सेल प्रकारों में माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म के मॉड्यूलर की पहचान करने के लिए स्क्रीनिंग में नियोजित किया जा सकता है।

Introduction

हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) अस्थि मज्जा में रहने वाली कोशिकाओं की एक छोटी आबादी है जो एक जीव के जीवनकाल में रक्त उत्पादन और होमोस्टोसिस सुनिश्चित करती है। एचएससी ने इस प्रक्रिया को जनकों को जन्म देकर मध्यस्थता की कि बदले में सेल डिवीजन के कई दौरों और अच्छी तरह से करवाया भेदभाव कदम1के माध्यम से मरणासन्न विभेदित परिपक्व रक्त कोशिका वंश का उत्पादन । महत्वपूर्ण बात, एचएससी एनारोबिक ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से अपनी ऊर्जा का उत्पादन करते हैं। इसके विपरीत, अधिक प्रतिबद्ध और सक्रिय हेमेटोपोइटिक जनक अपने चयापचय को माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म2,3,4की ओर स्विच करते हैं। माना जाता है कि यह अलग मेटाबोलिक राज्य एचएससी को सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा उत्पादित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) द्वारा दिए गए सेलुलर नुकसान से बचाता है, जिससे वीवो फ़ंक्शन5,6,7,8में उनकी दीर्घकालिक अवधि को बनाए रखा जाता है। एचएससी मेटाबोलिक राज्य का प्रत्यक्ष माप चुनौतीपूर्ण है और अक्सर उनकी सीमित संख्या के कारण कम थ्रूपुट होता है। यहां, हम एचएससी में हरे फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग (माइटोट्रैकर ग्रीन) का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (टीएमआरएम) फ्लोरेसेंस का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (टीएमआरएम) फ्लोरेसेंस के मजबूत माप नप के लिए प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित परख का वर्णन करते हैं। हमने पहले यह दर्शाया है कि कम शुद्ध एचएससी9 और मेटाबोलिक मॉड्यूलर का एक सदाशयी कार्यात्मक मार्कर है जो एचएससी कार्य9,10को कम करने में सक्षम है। यहां हम एचएससी की दीर्घकालिक रक्त पुनर्गठन क्षमता में सुधार करने में सक्षम उपन्यास अणुओं की पहचान करने के लिए रणनीति के रूप में एचएससी माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइलिंग पर अपनी विधि के उपयोग का प्रस्ताव करते हैं ।

एक उदाहरण के रूप में, हम प्रदर्शित करते हैं कि यह परख विटामिन बी 3 एनालॉग निकोटिनमाइड राइबोसाइड (एनआर) के संपर्क में आने पर एचएससी को कम करने के लिए मज़बूती से मापता है। तदनुसार, हमारे हाल ही में प्रकाशित अध्ययन में हम प्रदर्शित करते हैं कि एनआर सीधे हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनककार्यों 10में सुधार करके माउस और मानवीकृत माउस सिस्टम दोनों में रक्त वसूली पोस्टट्रांसप्लांट में सुधार करता है। इस तरह के मेटाबोलिक मॉड्यूलर की क्षमता महान नैदानिक मूल्य की है , यह देखते हुए कि 25% मृत्यु दर11,12के बाद के रोगियों में रक्त और प्रतिरक्षा वसूली में देरी से जुड़ी हुई है ।

इसके अलावा, हम सबूत प्रदान करते हैं कि इस पद्धति को मेटाबोलिक प्रोफाइल और मानव टी कोशिकाओं के कार्य के लक्षण वर्णन के लिए लागू किया जा सकता है। हाल के वर्षों में, ऑटोलोगस ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइट्स (TILs) का उपयोग करके दत्तक सेल थेरेपी (अधिनियम) का विकास बेहद प्रतिकूल पूर्वानुमान (जैसे, मेटास्टैटिक मेलानोमा, जहां और 50% रोगियों के उपचार का जवाब देते हैं)13के साथ कुछ प्रकार के उन्नत कैंसर के लिए सबसे प्रभावी दृष्टिकोण बन गया है। हालांकि, पर्याप्त एंटीट्यूमर गतिविधि को शरण देने वाले टीआईएलएसको 14उत्पन्न करना मुश्किल है। पूर्व वीवो विस्तार के दौरान टीआईएल द्वारा किए जाने वाले व्यापक प्रसार और उत्तेजना के कारण टी सेल थकावट और सेनेसेंस होता है जो नाटकीय रूप से टी सेल एंटीट्यूमर प्रतिक्रिया15को ख़राब करता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि टीआईएलएस की एंटीट्यूमरल क्षमता उनके मेटाबोलिज्म16,17 से कसकर जुड़ी हुई है और PI3K/Akt मार्ग के अवरोध के माध्यम से चयापचय को मिलाने के उद्देश्य से दृष्टिकोण ने उत्साहजनक परिणाम18,19का उत्पादन किया है । इस कारण से, हम परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) और रोगी-व्युत्पन्न टीएलएस से प्राप्त टी कोशिकाओं की तुलना करते हैं, और बताते हैं कि कम विभेदित पीबीएमसी-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में मरणासन्न विभेदित टीआईएल की तुलना में कम और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान होता है।

हम कल्पना करते हैं कि इस परख का उपयोग उपन्यास मेटाबोलिक मॉड्यूलर्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो एचएससी और टी सेल फ़ंक्शन को बेहतर बनाते हैं।

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Protocol

पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रयोग हमारी संस्था के दिशा-निर्देशों का पालन करते हैं और पशु प्रयोग (प्राधिकरण: VD3194) के लिए स्विस कानून के अनुसार और मानव नमूनों (प्रोटोकॉल: 235/14) से जुड़े अनुसंधान के लिए किए गए थे; सीईआर-वीडी 2017-00490)

1. हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल निष्कर्षण

  1. जंगली प्रकार C57BL6/J चूहों की खरीद और परिवहन से जुड़े तनाव को कम करने के लिए उंहें पशु घर में कम से एक सप्ताह के लिए रखने के लिए ।
  2. प्रयोग के दिन, सीओ2 एस्फिक्सिशन का उपयोग करके माउस को इच्छामृत्यु दें।
  3. फर को स्टरलाइज करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस को स्प्रे करें और पिछले पैरों से फीमर और टिबिया हड्डियों को काटने के लिए मानक सर्जिकल उपकरणों, जैसे विच्छेदन कैंची और संदंश का उपयोग करके माउस को खोलें।
  4. फीमर, टिबिया और श्रोणि से जुड़ी मांसपेशियों को एक नरम कागज तौलिया का उपयोग करके हटा दें और साफ हड्डियों को 50 मिलीएल ट्यूब में रखें जिसमें बर्फ पर 1 mM EDTA (बफर) के साथ पीबीएस युक्त हो।
  5. 70% इथेनॉल के साथ मोर्टार और मूसल का छिड़काव करें और इसे सेल कल्चर हुड में रखें। यह 30 min के लिए यूवी के साथ बंध्याकरण । नसबंदी के बाद इथेनॉल के निशान को हटाने के लिए बफर के साथ मोर्टार और मूसल कुल्ला ।
  6. मोर्टार में कुछ बफर (~ 10 मिलील) के साथ साफ हड्डियों को रखें और अस्थि मज्जा को निलंबन में बाहर निकालने के लिए धीरे से उन्हें कुचल दें। अब, सेल निलंबन एकत्र करें और एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए इसे 50 मीटर ट्यूब में 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से पारित करें।
  7. सभी अस्थि मज्जा निकाले जाने तक चरण 1.6 दोहराएं और हड्डी का मलबा सफेद हो गया है।
  8. एक अपकेंद्रित्र पर बोन मैरो एकल सेल निलंबन युक्त 50 एमएल ट्यूब (एस) रखें। कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्री चलाएं।
  9. इस बीच ऑटोक्लेव्ड आसुत पानी में 1x आरबीसी लिसिस बफर का 10 मीटर तैयार करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
  10. सेंट्रलाइज से सैंपल ट्यूब को कलेक्ट करें और सुपरनेटेंट को डिडेंट करें। सेल पैलेट पर 1x आरबीसी लिसिस बफर(सामग्री की तालिका)पिपेट करें। गोली को उखाड़ फेंकना और कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके एक समरूप समाधान तैयार करें। आरबीसी लाइसेस होने के लिए ट्यूब को 1-2 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर होने दें। बफर के साथ ट्यूब भरकर लाइसेस प्रक्रिया बंद करें।
  11. ट्यूब को अपकेंद्रित्र पर रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन करें। अपकेंद्रित्र से ट्यूब ले लीजिए और अतिशयोक्ति को डिडेंट करें। बफर के 10 mL जोड़कर गोली को फिर से निलंबित करें और आरबीसी लिसिस के कारण मलबे को हटाने के लिए 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से एक नए 50 मीटर ट्यूब में समाधान फ़िल्टर करें।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। अपकेंद्रित्र से ट्यूब ले लीजिए और अतिशयोक्ति को डिडेंट करें। बफर के 500 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें।
  13. 100 माइक्रोन एलिकोट निकालें और एक अलग 1.5 mL ट्यूब में रखें। सेल निलंबन के शेष 450 माइक्रोन में प्रोजेनिटर एनरिचमेंट किट(सामग्री की तालिका)से बायोटिन वंश की कमी एंटीबॉडी कॉकटेल के 50 माइक्रोन जोड़ें। 15 मिन के लिए एक शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर बफर का 15 मीटर और अपकेंद्री डालें। अपकेंद्रित्र से ट्यूब ले लीजिए और अतिशयोक्ति को डिडेंट करें। बफर के 460 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें। एक 10 μL aliquot निकालें और एक अलग 1.5 mL ट्यूब में रखें।
  15. शेष 450 माइक्रोन सेल निलंबन में जनक संवर्धन किट(सामग्री की तालिका)से स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों के 50 माइक्रोन जोड़ें। 15 मिन के लिए एक शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर बफर का 15 मीटर और अपकेंद्री डालें। अपकेंद्रित्र से ट्यूब ले लीजिए और अतिशयोक्ति को डिडेंट करें। बफर के 5 mL में गोली को फिर से निलंबित करें और समाधान को 15 मीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  17. ट्यूब को एक स्वचालित सेल विभाजक(सामग्री की तालिका)में ले जाएं। सेल सेपरेटर के ट्यूबिंग को कुल्ला करने और प्राइम करने के लिए एक वॉश प्रोग्राम चलाएं। ट्यूब होल्डर पर सैंपल और दो कलेक्शन ट्यूब रखें। 'कमी'कार्यक्रम का उपयोग कर जुदाई प्रदर्शन करें। रन समाप्त होने के बाद स्वचालित सेल विभाजक से सकारात्मक और नकारात्मक अंशों को एकत्र करें।
    नोट: एक स्वचालित सेल विभाजक की अनुपस्थिति में उपयोगकर्ता मैनुअल के अनुसार मैनुअल चुंबकीय स्तंभों और इसी मैग्नेट का उपयोग कर सकते हैं। उपयोगकर्ताओं को ध्यान रखना चाहिए कि मैनुअल पृथक्करण की प्रक्रिया स्वचालित से धीमी है। इसके अलावा मैनुअल कॉलम में क्लोजिंग का खतरा भी ज्यादा होता है। इसलिए, उपयोगकर्ताओं को नमूना पतला करने और कॉलम पर धीरे-धीरे लोड करने की सलाह दी जाती है।
  18. सकारात्मक अंश को त्यागें। बफर के साथ नकारात्मक अंश ट्यूब भरें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें।
  19. इस बीच, अंतिम मात्रा समाधान के 1 mL में एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें और अंतिम मात्रा समाधान के 200 माइक्रोन में एकल-रंग नियंत्रण के रूप में सामग्री और तालिका 1की तालिका में वर्णित है।
    नोट: यदि TMRM और हरे फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग स्टेम सेल मार्कर धुंधला के साथ संयुक्त किया जाना है, तो CD150-PE की जगह CD150-PEcy5 और Streptavidin-पीएसी ऑरेंज के साथ Treptavidin-Tx लाल ।
  20. सेंट्रलाइज से सैंपल ट्यूब को कलेक्ट करें और सुपरनेटेंट को डिडेंट करें। एंटीबॉडी मिश्रण के 1 मिलील में गोली को फिर से निलंबित करें। एकल रंग नियंत्रण ट्यूबों (वंश को छोड़कर) में कोशिकाओं के 10 μL (चरण 1.13 से) जोड़ें। वंश एकल रंग ट्यूब में कोशिकाओं के 10 μL (चरण 1.14 से) जोड़ें।
  21. 45 मिन के लिए एक शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना और एकल रंग नियंत्रण ट्यूबों इनक्यूबेट करें। बर्फ की बाल्टी को ढक्कन या एल्यूमीनियम पन्नी से ढक दें।
  22. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर बफर और अपकेंद्री के साथ सभी ट्यूबों को भरें। सुपरनेटेंट को त्यागें और बफर के 200 माइक्रोन में बफर और सिंगल-कलर कंट्रोल के 1 mL में नमूने को फिर से निलंबित करें।
  23. नमूना और एकल रंग नियंत्रण 5 mL फिल्टर शीर्ष FACS ट्यूबों के लिए स्थानांतरित करें।
  24. छंटाई मशीन के लिए ट्यूबले और 1.5 मीटर स्टेम सेल विस्तार माध्यम के 400 μL युक्त ट्यूबों में एचएससी आबादी (चित्रा 1एमें गेटिंग रणनीति) सॉर्ट।

2. हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल की पूर्व वीवो संस्कृति

  1. हल कोशिकाओं युक्त ट्यूबों को इकट्ठा करें (सेल निष्कर्षण के लिए धारा 1 देखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। धीरे-धीरे गोली को उखाड़ फेंकने के बिना अधिकांश सुपरनेटेंट को हटा दें और सेल पैलेट के शीर्ष पर 50-80 माइक्रोन छोड़ दें। यह सेल हानि को कम करता है।
  2. स्टेम सेल विस्तार माध्यम में सेल गोली को परीक्षण की जाने वाली शर्तों की संख्या पर निर्भर करने के लिए अंतिम मात्रा में फिर से निलंबित करें (संस्कृति की स्थिति प्रति 100 माइक्रोन के लिए गिनती)।
  3. स्टेम सेल विस्तार माध्यम, स्टेम सेल फैक्टर (२०० एनजी/mL), FLT3 ligand (4 एनजी/mL) और कलम-स्ट्रीप एंटीबायोटिकदवाओं (1%) युक्त एक 2x संस्कृति माध्यम तैयार (2x बेसल मीडियम; सामग्री की तालिका)।
  4. एक बाँझ ऊतक संस्कृति 96 यू-बॉटम वेल प्लेट(सामग्री की तालिका)का इलाज करें और उन कुओं की पहचान करें जहां कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जाएगा (प्लेटडिजाइन इन फिगर 1बी)।
    नोट: उपयोगकर्ताओं को सीमांत कुओं से बचने की सलाह दी जाती है, क्योंकि वे वाष्पीकरण के लिए अधिक संवेदनशील होते हैं।
  5. इन कुओं में पहले चरण 2.3 में तैयार 2x बेसल माध्यम के 100 माइक्रोन डालें। एनआर में अच्छी तरह से चिह्नित एक 100x एनआर समाधान(सामग्री की तालिका)के 2 μL जोड़ें । एनआर हर 24 घंटे की भरपाई ।
    नोट: पुनःपूर्ति एनआर के लिए विशिष्ट है। अन्य मेटाबोलिक मॉड्यूलर को भरने की आवश्यकता हो सकती है या नहीं भी हो सकती है।
  6. 2x बेसल माध्यम वाले कुओं के शीर्ष पर चरण 2.2 में तैयार कोशिकाओं का बीज 100 माइक्रोन। इस प्रयोग में प्रति अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त एचएससी की संख्या 800-1,000 कोशिकाओं के बीच थी।
  7. 2x बेसल मीडियम वाले पांच अतिरिक्त कुएं तैयार करें। इनमें से प्रत्येक में 100,000 पूरे अस्थि मज्जा कोशिकाओं (चरण 1.13 से) स्टेम सेल विस्तार माध्यम के 100 μL में पुनः निलंबित करने के लिए पोस्ट संस्कृति प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए धुंधला नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा जोड़ें।
    नोट: यदि उपयोगकर्ता पोस्ट कल्चर विश्लेषण के लिए स्टेम सेल मार्कर और माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर को जोड़ना चाहते हैं तो इसके अतिरिक्त जनक आबादी (या तो सीकेआईटी + कोशिकाओं या एलकेसीडी150-कोशिकाओं) को सॉर्ट करने की सिफारिश की जाती है। पोस्ट कल्चर फ्लो साइटोमेट्री एनालिसिस के लिए धुंधला नियंत्रण कुओं में इन हल जनकों को बीज दें। एक दाग रंग प्रति एक अच्छी तरह से तैयार करें।
  8. कोशिकाओं वाले कुओं से वाष्पीकरण को कम करने के लिए आसपास के सभी कुओं में 200 माइक्रोन पानी डालें। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और संस्कृति अवधि (72 घंटे) की अवधि के लिए 5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में अव्यवस्थित छोड़ दें। हर 24 घंटे एनआर की भरपाई करने के लिए प्लेट निकालें और इसे वापस इनक्यूबेटर में रखें।

3. माइटोकॉन्ड्रियल मास और झिल्ली क्षमता का मापन

  1. संस्कृति अवधि के अंत में स्टेम सेल विस्तार माध्यम(सामग्रीकी तालिका) में टीएमआरएम (20 माइक्रोएम) और माइटोट्रैकर ग्रीन (10 माइक्रोन) (ग्रीन फ्लोरोसेंट दाग) का 100x समाधान तैयार करता है।
  2. प्रत्येक परीक्षण कुओं में 100x टीएमआरएम समाधान और 100x हरे फ्लोरोसेंट दाग समाधान के 2 माइक्रोन जोड़ें। टीएमआरएम कंट्रोल वेल में 100x टीएमआरएम के 2 माइक्रोन जोड़ें। मिटोट्रैकर कंट्रोल में 100x हरे फ्लोरोसेंट दाग के 2 माइक्रोन जोड़ें अच्छी तरह से। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 45 मिन में इनक्यूबेटर में वापस रखें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट के ऊपर को कवर करें।
    नोट: Verapamil (एबीसी पंप अवरोधक) के साथ एक अतिरिक्त नियंत्रण तैयार किया जा सकता है अगर एबीसी पंप मध्यस्थता रंगे एफलक्स परीक्षण की जरूरत है । इसके लिए टीएमआरएम और ग्रीन फ्लोरोसेंट दाग के लिए धुंधला होने से पहले एक टेस्ट वेल्स 1 एच में 50 माइक्रोन वेरापामिल डालें।
  3. इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें। सुपरनेटेंट को हटाने के लिए प्लेट को उलटदें। स्टैंडर्ड एफएसीएस बफर (पीबीएस-1 एमएम ईटीए-पी/एस-2% एफबीएस) के 200 माइक्रोन जोड़ें, 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर प्लेट को अपकेंद्रित करें। सुपरनेटेंट निकालें। इस वाशिंग स्टेप 3x को दोहराएं। उपयोगकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि प्लेट हमेशा पन्नी के साथ कवर किया जाता है, प्रत्यक्ष प्रकाश के लिए न्यूनतम जोखिम प्रदान करने के लिए।
    नोट: यदि उपयोगकर्ताओं को स्टेम सेल धुंधला के साथ माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला गठबंधन की जरूरत है, नमूना सभी स्टेम सेल मार्कर के एक एंटीबॉडी मिश्रण के साथ इनक्यूबेटेड की आवश्यकता होगी और एकल रंग नियंत्रण के लिए अलग से व्यक्तिगत एंटीबॉडी के साथ दाग 30-45 mके लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर की आवश्यकता होगी ।
    नोट: सभी चरणों में उपयोगकर्ताओं को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर थाली रखना चाहिए। उपयोगकर्ताओं को ध्यान देना चाहिए कि इस अतिरिक्त धुंधला कदम और बाद में धोने के कदम अतिरिक्त सेल हानि में परिणाम कर सकते हैं ।
  4. एफएसीएस बफर के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और एफएसीएस ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  5. प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने चलाएं (चित्रा 1देखें)। डब्ल्यूबीएम युक्त एकल रंग ट्यूबों में शामिल हैं: (1) अनदाग; (2) डीपीआई; (3) टीएमआरएम (पीई); (4) ग्रीन फ्लोरोसेंट दाग (FITC); (5) पूर्ण दाग (पीई और FITC) ।
  6. सबसे पहले मशीन स्थापित करने के लिए एकल रंग नियंत्रण प्राप्त करें। मुआवजे की गणना करने के लिए मशीन पर चल रहे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। एक बार मुआवजा लागू किया गया है, एचएससी नमूना प्राप्त करने और संभव के रूप में कई घटनाओं के रूप में रिकॉर्ड ।
    नोट: यदि स्टेम सेल और माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर संयुक्त हैं, तो उपयोगकर्ताओं को टीएमआरएम (पीई), सीडी 150 (पीई-Cy5), और एससीए-1 (एपीसी) के बीच मुआवजे के साथ विशेष रूप से सावधान रहने की आवश्यकता है। साथ ही सैंपल तुरंत पोस्ट धुंधला कर के चलाया जाए।
  7. साइटोमीटर से FACS फ़ाइलों का निर्यात और एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)पर डेटा का विश्लेषण ।
    1. विश्लेषण के लिए, विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर फ़ाइल खोलें। एफएससी-ए और एसएससी-ए गेटिंग का उपयोग सेल आबादी की पहचान करता है। डीपीआई नकारात्मक अंश (लाइव कोशिकाओं) की साजिश रचने से पहले अगले द्वारों में सिंगलों की पहचान करें। लाइव सेल गेट में क्रमशः(चित्रा 2ए)को मापने के लिए टीएमआरएम और हरे फ्लोरोसेंट दाग चैनल में एक समोच्च भूखंड बनाएं। लाइव सेल गेट में इन दोनों चैनलों की मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) का निर्यात करें।
    2. टीएमआरएम चैनल में कंधे की आबादी के आधार पर टीएमआरएम कम गेट सेट किया गया है। गेट सेट करने के लिए इस कंधे की आबादी की पहचान करने के लिए TMRM एकल रंग नियंत्रण का उपयोग किया जा सकता है। अपने नियंत्रण में TMRM कम गेट में कोशिकाओं के लाइव के अनुपात का निर्यात और साजिश रचने के लिए नमूनों का परीक्षण करें।

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Representative Results

चित्रा 1 में हम माउस बोन मैरो से हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल के अलगाव और उनके पूर्व वीवो संस्कृति के लिए प्लेट के लेआउट के लिए गेटिंग रणनीति दिखाते हैं। चित्रा 1ए एसएससी-ए/एफएससी-ए प्लॉट में लिंफोसाइट अंश की पहचान को दर्शाता है । सिंगलेट गेट में डबल्स हटा दिए गए और उसके बाद डीपीआई सिग्नल न होने से लाइव सेल की पहचान की गई । वंश-Sca1+cKit+द्वारा परिभाषित एलकेएस आबादी की पहचान की गई थी। इस आबादी को स्टेम और जनक कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए जाना जाता है । एचएससी एलकेएस आबादी में लगभग 5-10% कोशिकाओं का निर्माण करता है और सीडी 150+सीडी48- जनसंख्या के लिए गेटिंग द्वारा पहचाना गया था। चित्रा 1बी पूर्व वीवो संस्कृति के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट के लेआउट का प्रतिनिधित्व करता है। हल एचएससी विभिन्न संस्कृति शर्तों में चढ़ाया गया: इस मामले में, नियंत्रण और एनआर पूरक संस्कृति की स्थिति। पूरे अस्थि मज्जा कोशिकाओं को प्रोटोकॉल में वर्णित एकल रंग नियंत्रण के रूप में भी चढ़ाया गया था। सेल युक्त कुओं से मीडिया के वाष्पीकरण से बचने के लिए आसपास के सभी कुओं को पानी से भरना महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, सीमांत कुओं को सेल संस्कृति के लिए टाला गया क्योंकि वे वाष्पीकरण के लिए अधिक संवेदनशील हैं।

चित्रा 2 एचएससी पोस्ट कल्चर में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमओएम) और द्रव्यमान की माप को दर्शाता है। चित्रा 2ए नियंत्रण में सुसंस्कृत एचएससी और एनआर पूरक स्थितियों में टीएमआरएम स्तर (ऊपर) और हरे फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग (नीचे) के प्रतिनिधि भूखंडों को दिखाता है। एनआर ट्रीटमेंट से टीएमआरएमकम आबादी में स्पष्ट वृद्धि देखी गई । चित्रा 2बी तीन स्वतंत्र नमूनों से मात्रा करण को दर्शाता है। एनआर उपचार ने टीएमआरएमकम गेट में कोशिकाओं के अनुपात में काफी वृद्धि की और TMRM फ्लोरेसेंस तीव्रता को काफी कम दिखाया। माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान (हरे-फ्लोरेसेंस तीव्रता द्वारा प्रतिनिधित्व) एनआर पूरकता पर नहीं बदला। इसके अतिरिक्त, हमने स्टेम सेल मार्कर को माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला पोस्ट संस्कृति के साथ धुंधला कर दिया। चित्रा 2सी दो संस्कृति की स्थिति में वंश नकारात्मक और एलकेएस आबादी पोस्ट संस्कृति से एचएससी की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीति दिखाता है । इन गेटेड एचएससी का टीएमआरएम और ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग प्रोफाइल फिगर 2डीमें देखा जाता है । एनआर के संपर्क में % TMRMकम आबादी में एक महत्वपूर्ण वृद्धि और gated HSCs में TMRM फ्लोरेसेंस तीव्रता में एक महत्वपूर्ण कमी दिखाई । ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग ग्रीन सिग्नल दो स्थितियों में अपरिवर्तित रहा।

चित्रा 3 विभिन्न मानव टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एफिडेविट) क्षमता (एमओएम) और द्रव्यमान की माप को दर्शाता है: परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं (पीबीएमसी) सीडी 4+ और सीडी8+ टी कोशिकाएं, साथ ही सीडी 4+ और सीडी8+ ट्यूमर तेजी से विस्तार प्रोटोकॉल (आरईपी) के बाद लिम्फोसाइट्स (टीआईएल) में घुसपैठ करते हैं। चित्रा 3ए TMRM स्तर (ऊपर) और हरे-फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग स्तर (नीचे) परिसंचारी (PBMC) और ट्यूमर घुसपैठ (टीआईएल) CD4+ और CD8+ टी कोशिकाओं के प्रतिनिधि भूखंडों से पता चलता है । टीआईएल ने टी कोशिकाओं को प्रसारित करने की तुलना में टीएमआरएम और ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग सिग्नल में स्पष्ट वृद्धि दिखाई । चित्रा 3बी टीएमआरएम और ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला के एमएफआई क्वाटिफिकेशन को दिखाता है। टीआईएल ने पीबीएमसी-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं की तुलना में उच्च टीएमआरएम और ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला संकेतों को प्रदर्शित किया। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि टीआईएलएस में एक प्रतिष्ठित मेटाबोलिक प्रोफाइल होता है जिसमें वृद्धि हुई है और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान होता है।

Figure 1
चित्रा 1:हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं का अलगाव और संस्कृति। (ए)सेल सतह मार्कर के आधार पर हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) के अलगाव के लिए गेटिंग रणनीति। एचएससी की पहचान वंश-Sca1+ cKit+ (LKS) CD150+CD48 के रूप में की गईथी । (ख)संस्कृति में रखे गए 96 वेल प्लेट का डिजाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:एचएससी के माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइल। (ए)एफएसीएस कंटूर प्लॉट जो एचएससी पोस्ट कल्चर को बेसल या एनआर पूरक स्थितियों में दिखाता है। TMRM (ऊपर) और हरे फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग (Mitotracker) (नीचे) प्रोफाइल दिखाए गए हैं। (ख)टीएमआरएम और ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग संकेत का परिमाणीकरण । एनआर पूरकता के परिणामस्वरूप ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग संकेत को बनाए रखते हुए टीएमआरएम प्रोफाइल में कमी आई। (ग)समोच्च भूखंड ों में नियंत्रण में एचएससी की आबादी की पहचान और संस्कृति के बाद एनआर पूरक शर्तें दिखाई जाती हैं । (D)फेनोटाइपिक एचएससी पोस्ट कल्चर में टीएमआरएम और ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग सिग्नल के कंटूर प्लॉट और क्वांटिफिकेशन । एनआर सप्लीमेंट ने टीएमआरएम सिग्नल को कम कर दिया जबकि ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग सिग्नल एचएससी में अपरिवर्तित रहा। छात्र टी टेस्ट ***पी एंड एलटी; 0.001, ** पी एंड एलटी; 0.05, महत्वपूर्ण नहीं और 0.05, त्रुटि बार = एसईएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3:मानव PBMCs और TILs के माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइल: (ए)FACS समोच्च साजिश सीडी 4+ और सीडी 8+ हौसले से PBMCs या ट्यूमर से अलग-CD4+ और CD8+ पोस्ट REP (तेजी से विस्तार प्रोटोकॉल) दिखा । TMRM (ऊपर) और हरे फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग (Mitotracker) (नीचे) प्रोफाइल दिखाए गए हैं। (ख)टीएमआरएम और ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग संकेत का परिमाणीकरण । टीआईएलएस ने कम माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि और द्रव्यमान प्रदर्शित किया। छात्र टी-टेस्ट ***पी एंड एलटी; 0.001, **पी एंड एलटी; 0.01, *पी एंड एलटी; 0.05, महत्वपूर्ण नहीं >0.05, त्रुटि बार = एसडी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

S.No एंटीबॉडी नाम काम कमजोर पड़ने
1 स्ट्रेप्टाविडिन Tx लाल 1/200
2 Sca1 एपीसी 1/200
3 सीकेआईटी पेसाइक्ली7 1/100
4 सीडी150 पीई 1/100
5 सीडी48 पीबी 1/100
तभी उपयोग किया जाना चाहिए जब स्टेम सेल और माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर संयुक्त हों।
6 स्ट्रेप्टाविडिन पीएसी नारंगी 1/200
7 CD150 पीई-Cy5 1/100

तालिका 1: एंटीबॉडी कमजोर हो ताहै।

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Discussion

जीव के जीवनकाल के दौरान स्थिर हेमेटोपोइसिस को बनाए रखने के लिए एचएससी फ़ंक्शन का एक तंग विनियमन महत्वपूर्ण है। शरीर में विभिन्न अन्य सेल प्रकारों की तरह, एचएससी फ़ंक्शन के नियमन में योगदान देने वाला एक प्रमुख घटक सेलुलर मेटाबोलिज्म है। हमारी प्रयोगशाला9 और अन्य2,3 से पिछले अध्ययनों ने एचएससी में एक अलग मेटाबोलिक स्थिति को बनाए रखने में माइटोकॉन्ड्रिया के महत्व को फंसाया है। मूत्र अस्थि मज्जा से अलग एचएससीएस की बेहद कम संख्या के कारण, मानक मेटाबोलिक परखों (जैसे, सीहॉर्स के साथ ऑक्सीजन की खपत) के माध्यम से उनका विश्लेषण करना मुश्किल है। हमारे पिछले काम के आधार पर, हमने कोशिकाओं (यानी एचएससी) की कम संख्या में माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और झिल्ली क्षमता (गतिविधि के लिए अप्रत्यक्ष रीडआउट) को मज़बूती से मापने के लिए एक साधारण प्रवाह साइटोमेट्री परख का मानकीकरण किया। यह परख उनकी व्यवहार्यता9से समझौता किए बिना जीवित कोशिकाओं पर माप की अनुमति देता है, जिससे उन्हें किसी भी डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख (जैसे सीएफयू या बोन मैरो प्रत्यारोपण) के लिए उपलब्ध हो जाता है जो उपयोगकर्ता प्रदर्शन करना चाहते हैं। हम इस परख स्क्रीनिंग प्रयोगों में नियोजित किया जा रहा है, विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि या नॉकआउट मॉडल से एचएससी के माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफ़ाइल पर एक त्वरित readout के लिए अनुमति देने की उंमीद है । महत्वपूर्ण बात, हमारे परख CFSE धुंधला के साथ संयुक्त किया जा सकता है एचएससी प्रसार और उसके माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफ़ाइल9,10पर एक दोहरी readout है, HSCs विभाजन के चयापचय भाग्य के विश्लेषण की अनुमति । यह देखते हुए कि यह एक कठिन धुंधला प्रक्रिया है और हम कोशिकाओं (एचएससी) की कम संख्या के साथ काम कर रहे हैं, यह महत्वपूर्ण है कि पोस्ट केंद्रीकरण उपयोगकर्ताओं को हमेशा ट्यूबों में समाधान के 80-100 μL छोड़ क्रम में सेल हानि को कम करने के लिए । इसके अतिरिक्त, सभी पोस्ट धुंधला चरणों के दौरान ट्यूबों या प्लेटों को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए, या तो उन्हें पन्नी में कवर करके या कम रोशनी वाले वातावरण में काम करके। यदि उपयोगकर्ता एचएससी दाग को माइटोकॉन्ड्रियल रंगों के साथ गठबंधन करने का निर्णय लेते हैं तो उन्हें यह जांचना होगा कि मुआवजा सही ढंग से किया जाता है या नहीं, विशेष रूप से TMRM (पीई), पेCy5 और एपीसी के बीच।

महत्वपूर्ण बात, हाल ही में एक प्रकाशन एचएससी में माइटोकॉन्ड्रियल रंगों के उपयोग पर सवाल है क्योंकि वे efflux पंप करने के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है । इन अध्ययनों से पता चलता है कि अधिकांश आदिम हेमेटोपोइटिक डिब्बों में उनके प्रतिबद्ध जनक20की तुलना में माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या अधिक होती है । हमारे अनुभव में, माउस जेनेटिक मॉडल (माइटो ईजीएफपी चूहों21),माइटोकॉन्ड्रिया डी-इंडिपेंडेंट धुंधला तरीके (TOM20 एंटीबॉडी) का उपयोग, क्यूपीसीआर विश्लेषण इस धारणा का समर्थन करता है कि अधिकांश आदिम हेमेटोपोइटिक डिब्बों में कम माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री10होती है। हमारा मानना है कि क्षेत्र में इस विसंगति को स्पष्ट करने के लिए आगे के अध्ययन करने होंगे ।

समानांतर में, हम प्रदर्शित करते हैं कि मानव टीआईएलएस की मेटाबोलिक फिटनेस निर्धारित करने और थक टी कोशिकाओं के कार्य को बहाल करने के उद्देश्य से मेटाबोलिक रणनीतियों को विकसित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइलिंग के उपयोग का दोहन किया जा सकता है। वास्तव में, पीबीएमसी से अलग टी कोशिकाएं कम माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि (टीएमआरएम) और द्रव्यमान (माइटोट्रैकर ग्रीन) प्रदर्शित करती हैं, जबकि टीआईएलएस जैसी अधिक थक गई टी कोशिकाओं में उच्च माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि और द्रव्यमान होता है, जो थकावट के दौरान होने वाले संभावित मेटाबोलिक रीप्रोग्रामिंग का सुझाव देते हैं। तदनुसार, पिछले प्रकाशित अध्ययनों से पता चला है कि स्टेम सेल की तरह स्मृति टी कोशिकाओं (TSCM), बढ़ाया हठ और दीर्घकालिक याद प्रतिक्रिया में सक्षम के साथ टी कोशिकाओं, कम है और टी सेल चयापचय को लक्षित उपचार दृढ़ता से उनके समारोह22,23को प्रभावित कर सकते हैं ।

अंत में, हमारा मानना है कि हमारा दृष्टिकोण उपन्यास यौगिकों की पहचान के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है जो बेकार एचएससी (जैसे, उम्र बढ़ने या हेमेटोलॉजिकल घातक) की मरम्मत कर सकता है।

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Disclosures

इस काम के कुछ तत्वों को यूरोपीय पेटेंट कार्यालय में आवेदन P1828EP00 के रूप में प्रस्तुत किया गया है ।

Acknowledgments

हम उनके समर्थन के लिए यूनिल फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा विशेष रूप से डॉ रोमेन बेडेल का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को क्रिस्टियन गेरहार्ड जेबसेन फाउंडेशन ग्रांट ने एनवी और ओएन को सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL FACS tubes Falcon 352235 Sample preparation
96-U bottom plate Corning 3799 Cell culture
AutoMACS pro separator Miltenyi Biotec Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII Becton and Dickinson Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit BD 558451 Lineage depletion
BD LSRII Becton and Dickinson FACS acquisition machine
BD-DIVA Becton and Dickinson Acquisition software
CD150 PE Biolegend 115904 Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5 Biolegend 115912 Antibody staining mix
CD48 PB Biolegend 103418 Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R Eppendorf Centrifugation
Ckit PeCy7 Biolegend 105814 Antibody staining mix
Flow jo FlowJo LLC FACS Analysis software
GraphPad-Prism GraphPad Plotting data into graphs
Mitotracker Green Invitrogen M7514 Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR) Custom synthesized in house Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS CHUV 1000324 Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S) Life technologies 15140122 Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer Biolegend 420301 Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) RnD 427-FL-005/CF Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF) RnD 455-MC-010/CF Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC Thermo Fisher Scientific 17-5981-82 Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium SIGMA S0192 Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange Life Technologies S32365 Antibody staining mix
Streptavidin Tx red Life Technologies S872 Antibody staining mix
TMRM Invitrogen T668 Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA Invitrogen 15575-038 Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM

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References

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जीव विज्ञान अंक 154 हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल टी कोशिकाएं ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइट्स माइटोकॉन्ड्रिया माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान मेटाबोलिज्म
फ्लो साइटोमेट्री द्वारा हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और टी-सेल में माइटोकॉन्ड्रियल मास और झिल्ली क्षमता का मापन
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Girotra, M., Thierry, A. C., Harari, … More

Girotra, M., Thierry, A. C., Harari, A., Coukos, G., Naveiras, O., Vannini, N. Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (154), e60475, doi:10.3791/60475 (2019).

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