Summary
Pour quantifier le flux microvasculaire des séquences d'images capillaires à grande vitesse, nous avons développé le logiciel STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Sur l'ensemble du champ d'images et au fil du temps, STAFF évalue les vitesses de débit et génère une séquence de cartes spatiales codées en couleur pour la visualisation et la sortie tabulaire pour les analyses quantitatives.
Abstract
Les changements dans la vitesse et la distribution de flux sanguin sont essentiels en maintenant la perfusion de tissu et d'organe en réponse aux besoins cellulaires variables. En outre, l'apparition de défauts dans la microcirculation peut être un indicateur primaire dans le développement de pathologies multiples. Les progrès de l'imagerie optique ont fait de la microscopie intravitale (IVM) une approche pratique, permettant l'imagerie au niveau cellulaire et subcellulaire chez les animaux vivants à grande vitesse au fil du temps. Pourtant, en dépit de l'importance de maintenir la perfusion adéquate de tissu, la variabilité spatiale et temporelle dans le flux capillaire est rarement documentée. Dans l'approche standard, un petit nombre de segments capillaires sont choisis pour l'imagerie sur une période limitée. Pour quantifier de manière exhaustive le flux capillaire d'une manière impartiale, nous avons développé l'analyse temporelle spatiale du flux fieldwise (STAFF), une macro pour le logiciel d'analyse d'image open-source FIJI. En utilisant des séquences d'images à haute vitesse de pleins champs de flux sanguin dans les capillaires, STAFF produit des images qui représentent le mouvement au fil du temps appelé kymographes pour chaque intervalle de temps pour chaque segment vasculaire. À partir des kymographes STAFF calcule les vitesses à partir de la distance que les globules rouges se déplacent au fil du temps, et produit les données de vitesse comme une séquence de cartes spatiales codées en couleur pour la visualisation et la sortie tabulaire pour les analyses quantitatives. Dans les foies normaux de souris, STAFF analyse des différences profondes quantifiées dans la vitesse d'écoulement entre les régions péricentrales et periportales dans les lobules. Encore plus inattendus sont les différences dans la vitesse de débit observée entre les sinusoïdes qui sont côte à côte et les fluctuations observées dans les différents segments vasculaires au cours des secondes. STAFF est un nouvel outil puissant capable de fournir de nouvelles idées en permettant la mesure de la dynamique spatiotemporelle complexe du flux capillaire.
Introduction
La microvasculature joue un rôle critique dans la physiologie, assurant une perfusion efficace des tissus dans des conditions changeantes. Le dysfonctionnement microvasculaire est associé à la myriade de conditions comprenant la morbidité et la mortalité cardio-vasculaires à long terme, le développement de la démence, et la maladie du foie et du rein et est ainsi un facteur clé d'intérêt dans un large éventail d'investigations biomédicales1,2,3,4,5. Bien que de multiples techniques aient été utilisées pour évaluer la perfusion tissulaire, seule la microscopie intravitale permet la collecte de données à la résolution temporelle et spatiale nécessaire pour caractériser le flux sanguin au niveau des capillaires individuels.
Le flux microvasculaire peut être visualisé dans la microscopie de fluorescence soit par le mouvement des microsphères fluorescentes ou par le mouvement des globules rouges sur le fond des marqueurs fluorescents membrane-impermeant (par exemple, dextran ou albuminfluorescent-étiqueté)6,7. Le flux microvasculaire peut être représenté dans des couches cellulaires superficielles à l'aide d'une microscopie à champ large, ou en profondeur à l'aide d'une microscopie confocale ou multiphoton. Cependant, les débits capillaires sont tels que le passage des globules rouges ne peut généralement pas être capturé à des vitesses inférieures à 60 images/s. Étant donné que la plupart des microscopes confocalets à balayage laser et multiphoton nécessitent 1 à 5 s pour numériser un champ d'image complet, cette vitesse ne peut généralement être accomplie qu'en limitant le champ de vision, parfois à une seule ligne d'analyse8. Le processus de limitation des mesures à certains segments capillaires (1) a le potentiel d'introduire un biais de sélection et (2) rend impossible la capture de l'hétérogénéité spatiale et temporelle dans les taux de flux sanguin capillaire. En revanche, les images des réseaux capillaires peuvent être recueillies à des vitesses supérieures à 100 fps à l'aide de microscopes numériques à large champ équipés de semi-conducteurs d'oxyde de métal complémentaires scientifiques (sCMOS)caméras 9,10. Ces systèmes peu coûteux, communs dans les laboratoires biomédicaux typiques permettent d'imager le flux microvasculaire à travers des réseaux bidimensionnels entiers, essentiellement en continu. Le problème devient alors celui de trouver une approche d'analyse qui est capable d'extraire des données quantitatives significatives à partir des ensembles de données d'image massives et complexes générées par la microscopie vidéo à haute vitesse.
Pour permettre l'analyse des données de flux de plein champ, nous avons développé STAFF, un nouveau logiciel d'analyse d'image qui peut mesurer en permanence le flux microvasculaire dans des champs entiers de microscope de séries d'images recueillies à grande vitesse11. L'approche est compatible avec une variété de différents systèmes expérimentaux et modalités d'imagerie et le logiciel d'analyse d'image STAFF est mis en œuvre comme un ensemble d'outils macro pour la mise en œuvre FIJI de ImageJ12. Le principe sous-jacent utilisé ici pour visualiser le flux microvasculaire est que d'abord, un certain contraste doit être fourni pour être en mesure d'imager les globules rouges dans les capillaires. Dans nos études, le contraste est fourni par une sonde fluorescente en vrac qui est exclue par les globules rouges. La vitesse d'écoulement peut alors être quantifiée à partir du déplacement des globules rouges qui apparaissent comme une tache négative dans le plasma étiqueté fluorescent dans les images recueillies à grande vitesse d'un animal vivant8. Nous utilisons ensuite STAFF pour faire des parcelles de distance le long de chaque segment capillaire sur de multiples intervalles de temps appelés kymographes, puis détecter les pentes présentes dans les kymographes13, et à partir de ces pentes calculer les taux de flux microvasculaire. L'approche peut être appliquée aux images recueillies à partir de n'importe quel lit capillaire qui peut être consulté pour l'imagerie. Ici nous décrivons l'application de IVM et de STAFF aux études du flux sanguin dans le foie.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées et menées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Indiana et ont adhéré au guide du CNRC pour les soins et l'utilisation des animaux.
1. Préparation chirurgicale pour la microscopie intravitale
REMARQUE: Ce n'est pas une opéra tion de survie. Une fois la section 1 « Préparation chirurgicale pour la microscopie intravitale » commencée, les travaux ne peuvent pas être interrompus avant l'achèvement de la section 2 « microscopie intravitale ».
- Acclimater les souris C57BL/6 mâles de 9 à 10 semaines pendant au moins 4 jours et jeûner pendant 16 h avant les études.
- Peser l'animal, sédatif avec 5% d'isoflurane et placer sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle. Utilisez un débit d'oxygène de 1/2 L/min et maintenez la sédation avec 1-2% d'isoflurane. Vérifiez les réflexes par pincement d'orteil. Surveiller la température à l'aide d'un thermomètre rectal. Surveillez la fréquence cardiaque et la respiration visuellement.
- Lorsque l'anesthésie est stable, raser la zone pour le placement cannulation jugulaire et la zone sous la cage thoracique pour l'exposition du foie.
-
Pour le cannulation jugulaire, faire une incision ventrale gauche de 1 cm 1/2 cm au-dessous de la mâchoire de la souris. Effacer toute la graisse et le fascia entourant la veine jugulaire. Attachez l'extrémité antérieure de la jugulaire à l'aide de la chaîne de suture 06 pour prévenir les saignements.
- Faire une petite entaille dans la veine jugulaire et faire glisser la canule (30 G x 1/2 po, aiguille), porte-aiguille et tube en polyéthylène (0,011 x 0,024 pouces2 attaché à un adaptateur de talon Luer et rempli de 0,9% salin) dans environ 1 cm, et sécurisé à l'extrémité postérieure de la jugulaire à l'aide de 0-6 chaîne de suture.
- L'utilisation de la canule jugulaire délivre 70 kDa fluorescein dextran (à une dose de 30 mg/kg par injection de 0,1 ml d'une solution de 9 mg/mL en solution saline).
- Exposer le foie pour l'imagerie en faisant une incision de 4 à 6 cm sur le torse, à 1,2 cm au-dessous du milieu de la cage thoracique.
- Placer une éponge humide (trempée dans 0,9 % de salin) de 2 x 2 pouces2 éponge de gaze sous le lobe latéral gauche du foie. Placez du ruban adhésif à la périphérie de la fenêtre en verre d'un plat à fond de couverture de 40 mm et appliquez de l'adhésif au cyanoacrylate sur le ruban adhésif. Appuyez sur la plaque de verre sur le foie et à l'aide d'applicateurs à pointe de coton, appuyez sur la gaze dans la colle sur le ruban adhésif pour minimiser le mouvement des tissus pour la microscopie.
- Déplacer l'animal au stade du microscope. Ajouter stérile 0,9% salin dans le plat à fond de couverture pour garder le foie humide tout au long de la séance d'imagerie. Maintenir la température à 36-37 oC grâce à des coussins chauffants montés sur la scène, un coussin chauffant placé sur l'animal et un radiateur objectif.
2. Microscopie intravitale
- Effectuez une microscopie intravitale sur un microscope à épifluorescence inversée équipé d'une caméra vidéo capable de capturer des images à haute vitesse.
REMARQUE: Ici, une lampe à arc Xenon, une excitation spécifique à la fluoréine (480 à 500 nm) et des filtres d'émission (507 à 543 nm), des filtres Plan Fluor 20x, N.A. 0,75 objectif d'immersion en eau et une caméra sCMOS à grande vitesse ont été utilisés. - Sélectionnez la zone d'intérêt pour l'analyse capillaire du flux sanguin en utilisant un éclairage minimal.
- Définir le temps d'exposition assez court pour que la caméra soit en mesure d'acquérir 100 fps. Définissez le niveau d'éclairage pour visualiser clairement les ombres de globules rouges et la topologie de la vascularisation tout en évitant la phototoxicité et le photoblanchiment de la sonde fluorescente.
- Recueillir des images à un taux de 100 fps. Définir la résolution de pixels de l'appareil photo entre 0,65 et 1,3 m/pixel. Définir la taille du cadre entre 512 x 512 et 1024 x 1024 pixels. Définir la profondeur de bits entre 8 et 16 bits. Utilisez la plus haute résolution, la taille du cadre et la profondeur de bits qui permet encore la collecte d'images 100 fps sur le système.
- Enregistrer les fichiers de séries chronologiques sous forme de séquence de fichiers TIF ou en format caméra/microscope natif si Bio-Formats14 dans FIJI peut ouvrir les fichiers de format natif.
- Imagez plusieurs zones au fil du temps. Maintenir la souris sur la scène du microscope jusqu'à 2 h. Euthanasiez la souris à la fin de l'imagerie.
REMARQUE: La durée de la série chronologique sera basée sur l'équilibre de la nécessité d'imager pour un intervalle de temps qui embrasse la variabilité, tout en n'affectant pas la viabilité du tissu. La durée de la série chronologique peut également être dictée par des considérations relatives à la taille des fichiers; une série de 1 min de 1024 x 1024 pixels 16 bits images recueillies à 100 fps va générer un fichier qui est de 12 Go de taille. Les considérations de taille de fichier peuvent également dicter la taille du cadre et la profondeur du bit utilisé. Il n'y a pas de limites de taille explicites dans STAFF.
3. Définir le réseau vasculaire utilisant TrakEM2 dans FIJI
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause après avoir sauvé le travail à n'importe quel moment de la section 3.
- Téléchargez et installez FIJI à partir de https://imagej.net/Fiji/Downloads.
REMARQUE: La version 1.51n de Fidji a été utilisée pour ce projet, et peut être téléchargée à partir de https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Notez que sur Windows, FIJI doit être installé dans l'espace utilisateur et non dans les fichiers de programme. - Ouvrez le fichier de film dans FIJI en utilisant le fichier 'gt; Ouvrir ou en utilisant le fichier 'gt; Import 'gt; séquenced'image . Sélectionnez une seule image à partir des images stables entre les respirations où la topologie du réseau vasculaire est facile à voir. Sélectionnez L'image et dupliquez l'image unique sélectionnée (et non la pile) et enregistrez l'image dans un nouveau dossier. N'incluez pas d'espaces dans les noms de fichiers ou de dossiers.
- Mettre en place un nouveau projet trakEM2 vierge en sélectionnant le fichier 'gt; Nouveau 'gt; TrakEM2 (blanc). Sélectionnez le nouveau dossier contenant l'image unique du film comme dossier de projet. Les fenêtres TrakEM2 s'ouvriront.
- Cliquez à droite dans la zone de travail principale et sélectionnez L'image d'importation . Naviguez vers l'image unique enregistrée à l'étape 3.3 et sélectionnez-la.
- Cliquez à droite dans la zone de travail principale à nouveau et sélectionnez Afficher 'gt; Autoresize toile / Couche ensemble. Cliquez à gauche dans la fenêtre de travail principale. L'image remplira la zone de travail.
- Pour sélectionner les zones de l'image qui contiennent le réseau vasculaire, configurez la sélection de la liste de zones dans TrakEM2. Dans la plus petite fenêtre TrakEM2 (Template, Project Objects, Layers) cliquez à droite sur "n'importe quoi". Sélectionnez Ajouter nouvel enfant 'gt; liste de zone.
- Dans la plus petite fenêtre TrakEM2, faites glisser "Template 'gt; n'importe quoi" sur "Project Objects -gt; project". Puis faites glisser "Template 'gt; n'importe quoi 'gt; liste de zone" sur " Objetsde projet 'gt; projet 'gt; n'importe quoi". Sous "Objets de projet 'gt; projet 'gt; n'importe quoi", - liste de zone sera maintenant présent.
- Dans la fenêtre trakEM2 principale sous l'onglet espace Z,une liste de zone étiquetée à barres a été créée. Cliquez pour le sélectionner. Dans la fenêtre principale TrakEM2 également sélectionner l'outil de pinceau. Appuyez sur Shift et rouler la roue de la souris pour sélectionner une taille appropriée pour le pinceau, par exemple, plus petit que le diamètre de la vascularisation. Pour enregistrer la configuration TrakEM2 presse Contrôle des touches S.
- Peignez le réseau vasculaire à l'aide de l'outil de pinceau. Pour effacer tenir Vers le bas Alt tout en utilisant l'outil de pinceau. N'incluez pas les régions floues. Économisez souvent à l'aide de Contrôle S.
- Lorsque l'étiquetage du réseau vasculaire est terminé, cliquez à droite dans la fenêtre principale TrakEM2 et sélectionnez Export 'gt; AreaLists comme étiquettes (tif). Dans la fenêtre popup sélectionnez Échelle 100% et Export All area list. Fermez les fenêtres TrakEM2 et choisissez oui pour le projet Enregistrer.
- L'image de AreaLists s'ouvrira et peut apparaître comme une image noire vierge. Dans le menu principal FIJI sélectionnez Image 'gt; Ajuster 'gt; Luminosité / Contraste. Dans la fenêtre B et C, appuyez sur le bouton automatique et la ZoneList deviendra visible. Dans le menu principal FIJI sélectionnez Image 'gt; Lookup Tables 'gt; Invert LUT. Enregistrez cette image d'étiquettes noires sur fond blanc et fermez l'image.
- Ouvrez le fichier d'étiquettes dans FIJI. Sélectionnez Plugins 'gt; Squelette 'gt; Skeletonize. Enregistrer l'image squelettée comme un tif. Utilisez le fichier skeleton.tif comme l'un des fichiers d'entrée nécessaires pour exécuter l'analyse de flux STAFF. Lors de l'enregistrement du fichier, n'utilisez pas d'espaces dans le nom du fichier.
- Modifier manuellement le fichier squelette au besoin, en plaçant une lacune (à l'aide de l'outilde peinture ) dans le dessin de ligne par exemple à des endroits où les branches de la vascularisation n'ont pas été capturées parce qu'elles sortent du plan d'image.
4. Préparer la séquence de film pour l'analyse STAFF
- Ouvrez le fichier de film dans FIJI en utilisant le fichier 'gt; Ouvrir ou Fichier 'gt; Import 'gt; Séquence d'image. Sélectionnez une période de temps de la séquence d'image pour l'analyse du flux (peut être de secondes à quelques minutes, des centaines à des dizaines de milliers d'images) où la position des tissus est restée stable au fil du temps, sauf pendant la respiration.
- Sélectionnez L'image et le doublement de la partie sélectionnée de la séquence en tapant les numéros des images de début et de fin. Vérifier l'étalonnage spatial et temporel de l'image sous Image et corriger si nécessaire. Enregistrer le fichier d'image comme un TIF (ou comme un AVI non compressé). Ce movie.tif est nécessaire comme un fichier d'entrée pour exécuter l'analyse STAFF. N'incluez pas d'espaces dans le nom du fichier.
5. Installer des macros STAFF dans FIJI
REMARQUE: (Important) Plusieurs dossiers dans les sous-répertoires de dossiers FIJI ont des noms de fichiers similaires, certains capitalisés, d'autres non. Assurez-vous que les dossiers corrects sont sélectionnés lors de l'installation de STAFF.
- Téléchargez les macros STAFF à partir de https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
-
Pour installer, ouvrez d'abord le dossier FIJI.
- Sur Windows trouver le dossier où FIJI est installé dans l'espace utilisateur, le plus souvent sur le bureau. Sur MacOS trouver l'icône FIJI dans le dossier Applications, cliquez à droite et sélectionnez Open.
- Dans le dossier FIJI, ouvrez le dossier plugins. À l'intérieur du dossier plugins, ouvrez le dossier Macros. Copiestaff.ijm dans ce dossier Macros: Fidji-plugins-Macros-STAFF.ijm.
- Dans le dossier FIJI, ouvrez le dossier plugins. Copiez STAFF_Dir.jar dans ce dossier de plugins: Fiji-plugins-STAFF_Dir.jar.
- Dans le dossier FIJI, ouvrez le dossier macros. À l'intérieur de ce dossier macros, ouvrez le dossier AutoRun. Copiez STAFF_Loader.ijm dans ce dossier AutoRun: Fidji-macros'AutoRun'STAFF_Loader.ijm.
- Démarrer FIJI et vérifier l'installation macro. Pour vérifier l'installation, sélectionnez Plugins 'gt; Macros. Une fois correctement installé, le menu déroulant comprendra : Open-Create Project, Analyze Skeleton, Edit Time Intervals, Analyze Flow et Produce Spatial Map.
- Si ces commandes ne sont pas présentes dans le menu Macros, sélectionnez Plugins 'gt; Macros 'gt; Installer, ouvrir le dossier Fiji-plugins'Macros, sélectionnez le fichier STAFF.ijm, puis cliquez sur le bouton OK. Les commandes doivent maintenant apparaître dans le menu Plugins .' Macros' .
6. Quantifier le flux vasculaire à l'aide de STAFF
- Créez un nouveau projet.
- Sélectionnez Plugins 'gt; Macros 'gt; Open-Create Project et suivez les invites à créer ou mettre à jour un fichier de configuration.
- À partir du menu Open-Create Project, naviguez vers et sélectionnez le répertoire de projet, le dossier de fichiers d'entrée et les fichiers d'entrée Movie.tif et Skeleton.tif. Modifier les noms de fichiers de sortie auto-peuplés si nécessaire.
- Valeurs d'entrée pour la longueur de segment la plus courte (20 m), vitesse maximale mesurée (2 000 m/s) et vitesse maximale cartographiée (1 000 m/s).
REMARQUE: Le produit de la longueur de segment la plus courte et des cadres par seconde donne la vitesse de débit maximale qui peut théoriquement être mesurée. Les vitesses d'écoulement capillaires les plus élevées signalées dans la littérature sont d'environ 2 000 m/s15. Dans le foie, nous avons observé que les vitesses d'écoulement capillaires étaient généralement en moyenne d'environ 300 m/s et dépassaient rarement 1 000 m/s. - Tapez les valeurs de la taille du pixel et du taux d'image pour la séquence d'image (à partir de métadonnées d'images ou de notes expérimentales). Ces valeurs nécessitent l'entrée de l'utilisateur. Vérifiez la case Correction Flicker si les images ont un scintillement périodique de l'intensité de fond.
- Sélectionnez les paramètres pour la meilleure visualisation des données. Sélectionnez la vitesse maximale cartographiée pour inclure environ 95% des données afin que les données soient cartographiées sur toute la plage de l'échelle de couleur. STAFF cartographie les valeurs aberrantes à grande vitesse jusqu'à l'extrémité haute vitesse de l'échelle de couleur.
- Analysez le squelette.
- Sélectionnez Plugins 'gt; Macros 'gt; Analyser le squelette. Le fichier skeleton.tif s'ouvrira et le gestionnaire de la région d'intérêt (ROI) s'ouvrira et s'exécutera.
REMARQUE: Analyze Skeleton classe chaque pixel par son nombre de voisins comme étant soit à un point de terminaison, à une jonction, soit dans un segment. Pour chaque segment, un numéro d'identification (numéro d'identification), une longueur de branche calibrée et les coordonnées spatiales des extrémités de la branche sont enregistrés. - Attendez que les identifiants de segment apparaissent sur le squelette, la liste de segment pour apparaître dans le gestionnaire de retour sur investissement, et un popup indiquant que le fichier de gestionnaire de retour sur investissement pour le squelette est enregistré. Cliquez OK.
- Vérifiez qu'entre les mouvements de respiration, le squelette reste au-dessus de l'endroit où les globules rouges passent à travers le capillaire (par exemple, pas le bord et non pas en dehors du capillaire). Affichez les segments étiquetés comme une overlay sur le film, en ouvrant le fichier du film, puis en faisant glisser le fichier zip roi sur le film ouvert. Jouez au film avec les segments superposés.
- Sélectionnez Plugins 'gt; Macros 'gt; Analyser le squelette. Le fichier skeleton.tif s'ouvrira et le gestionnaire de la région d'intérêt (ROI) s'ouvrira et s'exécutera.
- Sélectionnez les intervalles de temps.
- Sélectionnez Plugins 'gt; Macros 'gt; Select Time Intervals. Attendez pendant que la macro génère un kymographe à partir d'un seul segment sur le temps total pour le film. À partir de ce kymographe, l'utilisateur sélectionne les intervalles de temps pour l'analyse. Utilisez les touches Control et ' pour augmenter la taille du kymographe si nécessaire.
- L'outil de sélection du rectangle est automatiquement activé. Dessinez un rectangle autour de chaque intervalle de temps. Un bon point de départ pour la longueur d'intervalle de temps est l'intervalle de 1/2 s entre les respirations, qui sont apparents comme des régions floues horizontales dans le kymographe.
- Cliquez sur la touche T ou le bouton Ajouter dans le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer les sélections d'intervalle de temps. Répétez l'opération pour autant d'intervalles de temps que désiré. Faire des sélections séquentiellement du haut (ou de la gauche) vers le bas (ou à droite) du kymographe.
- Évaluer les choix de paramètres (à partir du projet Open-Create) en sélectionnant un petit nombre d'intervalles de temps (3 à 4) et en complétant l'analyse pour seulement ces intervalles, puisque Analyze Flow (l'étape suivante) peut prendre des heures pour de grands jeux de données.
- Cliquez OK dans le Faire un retour sur investissement pour chaque fenêtre d'intervalle de temps une fois terminé. Une fenêtre popup s'affiche lorsque les intervalles sélectionnés ont été enregistrés dans le dossier de projet. Cliquez OK.
- Analyser le flux.
- Sélectionnez Plugins 'gt; Macros 'gt; Analyze Flow et la boîte de dialogue Analyze Flow Parameters s'ouvre et affiche les valeurs saisies dans l'étape du projet Open-Create. Modifier si nécessaire, puis cliquez sur OK.
- La boîte de dialogue Noms de fichiers de sortie s'ouvre et affiche les noms entrés dans l'étape du projet Open-Create. Modifier si nécessaire, puis cliquez sur OK.
- Une boîte de dialogue s'ouvre pour demander si l'utilisateur est prêt à commencer l'analyse. Cliquez sur OK et l'analyse va commencer. Attendez une boîte de dialogue qui s'ouvre pour indiquer quand l'analyse de flux est terminée.
REMARQUE: Le temps nécessaire dépend de la vitesse du processeur et de la taille de l'ensemble de données. - Confirmez que les fichiers de résultats ont été stockés sous forme de fichiers de feuilles de calcul en format .csv dans le dossier de projet.
REMARQUE: Les fichiers de sortie incluent : segment_velocities.csv contient des valeurs de vitesse qui ont des valeurs positives et négatives indiquant la direction du flux. Les cellules représentant des segments inférieurs à la longueur minimale contiennent le texte SHORT. Les cellules dont la vitesse est supérieure à la vitesse mesurée maximale contiennent le texte OUT (pour les valeurs aberrantes). kym_ang.csv contient des angles de kymographe mesurés par le plugin Directionality dans FIJI. good_fit.csv contient la bonté de l'ajustement d'une courbe à la distribution des angles mesurés à partir de chaque kymographe. Une mauvaise bonté d'ajustement (lt; 0,8) peut indiquer des points de branche cachés dans un segment, un changement de vitesse pendant l'intervalle de temps, une lampe ou un scintillement de lumière de la pièce. - Vérifiez que segment_velocities.csv contient peu de valeurs OUT. S'il y a un grand nombre de valeurs OUT, vérifiez que la longueur minimale du segment à analyser n'est pas inférieure à 15 à 20 m, puis reexécutez Analyze Flow. Si le nouveau segment_velocities.csv contient toujours une grande proportion de valeurs OUT, puis cochez la case de correction clignotante, puis reexécutez Analyze Flow.
- Produire des cartes spatiales.
- Sélectionnez Plugins 'gt; Macros 'gt; Produce Spatial Map et la fenêtre Spatial Map Parameters s'ouvrira, affichant les valeurs entrées dans l'étape du projet Open-Create. Modifier si nécessaire, ou de continuer à sélectionner OK.
- Regardez comme une séquence temporelle de cartes spatiales des vitesses de débit est générée avec la couleur indiquant la vitesse de débit. La sortie est sous la forme d'une pile d'image .tif avec une image pour chaque intervalle de temps. Faites défiler la pile .tif pour visualiser la variation spatiale et temporelle du débit. Enregistrer la pile comme un fichier AVI (non compressé pour une portabilité maximale) à partager comme un film.
7. Analyse quantitative à l'aide de la sortie STAFF
- Ouvrez le fichier segment_velocities.csv dans une feuille de calcul ou un programme d'analyse statistique. Ces valeurs ont un signe positif ou négatif indiquant la direction du débit par rapport aux points de départ/arrêt de ce segment (enregistré dans le fichier de retour sur investissement du segment).
- Faites une nouvelle page de feuille de calcul contenant les valeurs absolues de toutes les valeurs de vitesse. Utilisez ces valeurs pour calculer la vitesse moyenne globale du débit, la vitesse moyenne du débit pour tous les segments vasculaires au fil du temps, la vitesse d'écoulement pour chaque segment vasculaire au fil du temps, et faire des histogrammes de distributions de vitesse.
- Calculer les valeurs autour de régions morphologiques spécifiques, ou d'autres régions d'intérêt, en trouvant d'abord les segments pertinents spécifiques dans le squelette étiqueté, puis en effectuant des analyses sur ces segments sélectionnés.
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Representative Results
L'analyse STAFF génère un recensement complet des vitesses microvasculaires dans des champs entiers de microscope sur des périodes de temps s'étendant de secondes à minutes. Les résultats des représentants sont présentés à la figure 1, à la figure 2, à la figure 3et à la figure 4. La figure 1 montre un exemple d'une série chronologique du réseau microvasculaire dans le foie d'une souris, de la génération de l'image squelettisée qui est utilisée pour définir l'axe du flux microvasculaire, et de la carte générée par staff des segments vasculaires individuels identifiés pour la quantification. STAFF utilise ensuite l'image squelettée pour décomposer le réseau microvasculaire en segments individuels, puis génère des images de kymographes pour chaque segment. Ces images sont fournies à l'utilisateur, ainsi que des outils pour identifier les intervalles de temps à utiliser pour l'analyse du kymographe (Figure 2). STAFF utilise ensuite le squelette, et les intervalles de temps fournis par l'utilisateur pour briser le kymographe de chaque segment en intervalles de segment-temps individuels. STAFF identifie ensuite l'angle prédominant dans le kymographe de chaque intervalle de temps segmentet et fournit des mesures de vitesse sous forme de fichiers de données .csv (Figure 3) et sous la forme de piles d'images cartographiques à code couleur (Figure 4). Afin de soutenir l'exploration du pipeline d'analyse de données, STAFF fournit également des fichiers .csv contenant toutes les mesures d'angle kymographe et les valeurs de bonté de l'ajustement.
Figure 1 : Génération du squelette vasculaire. (A) Image originale d'un seul cadre à partir d'images de séries chronologiques recueillies dans le foie d'une souris vivante. Barre d'échelle de 100 m . (B) Image montrée dans le panneau A avec des veines centrales (CV) et des triades de portail (PT) indiquées, pour identifier les directions principales du flux sinusoïde. (C) Image du panneau A avec la perle de la segmentation TrakEM2 des sinusoïdes. (D) Image binaire de la segmentation TrakEM2. (E) Skeletonisation de la segmentation TrakEM2. (F) IMAGE de sortie STAFF de segments vasculaires individuels avec des étiquettes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyse de Kymograph. (A) Image agrandie des segments vasculaires montrée dans la figure 1F. (B) Kymograph typique d'un segment recueilli sur deux intervalles de temps interrespiratoires. Les périodes de respiration sont notées avec des flèches. (C) Kymographs pour les segments 240, 252 et 254 du panneau A. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse des données de vitesse. (A, B) Tableaux des mesures de vitesse de quatre segments sur 19 intervalles de temps exprimés soit comme vitesse avec direction (A) ou comme vitesse absolue (B). (C) Histogramme montrant la distribution des valeurs de vitesse absolue s'est étendue à l'ensemble du champ sur l'ensemble de la période de 20 s. (D) Graphique des vitesses des trois segments dont les kymographes sont représentés dans la figure 2C sur l'ensemble de la période de 20 s. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Carte de la vitesse. (A) IMAGE de sortie STAFF de la carte de vitesse codée en couleur pour un seul intervalle de temps pour le champ indiqué dans la figure 1. (B) Composite des cartes de vitesse pour tous les intervalles de temps présentés comme un volume 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole. Tout d'abord, la minimisation du mouvement pendant l'imagerie intravitale du foie est essentielle pour générer des films qui sont utilisables pour l'analyse du flux capillaire à l'aide de STAFF. En raison de la proximité du diaphragme, de courtes périodes de mouvement respiration induite se produisent, avec le foie sécurisé de retour à sa position initiale après chaque respiration. Fixer le foie exposé chirurgicalement contre le plat à fond de couverture à l'aide de gaze, puis l'imagerie d'en bas à l'aide d'un microscope inversé sert à immobiliser l'organe entre les respirations16,17,18,19. Deuxièmement, une vitesse d'acquisition d'image de 100 fps est fortement recommandée parce que la vitesse de débit qui peut être mesurée est fonction de la vitesse d'acquisition d'image et de la longueur minimale des segments dans lesquels le débit est mesuré11. Troisièmement, la production d'un squelette de haute qualité, la représentation de dessin de ligne du réseau vasculaire, est la prochaine étape critique dans l'obtention des vitesses de débit capillaire en utilisant STAFF. Les segments de ligne de squelette devraient se trouver près du point médian de la vascularisation entre les respirations au cours du cours de temps en cours d'analyse et la ramification vasculaire hors du plan d'image devrait être identifiée. Les emplacements de ces branches cachées le long d'un segment vasculaire peuvent être déduits en regardant le film, en examinant le kymographe ou en examinant les valeurs de vitesse au fil du temps pour ce segment. En regardant le film, ces segments vasculaires sont considérés soit comme ayant un flux bidirectionnel, émanant loin ou convergeant vers l'emplacement de la branche invisible, ou comme ayant un changement brusque de la vitesse d'écoulement à ce point le long du segment vasculaire. L'emplacement des points de branche cachés peut être identifié dans les kymographes comme l'emplacement d'un changement d'angle qui est produit par le changement de direction de débit ou de vitesse. Dans la feuille de calcul, les segments vasculaires avec des emplacements de branche cachés peuvent faussement changer de direction (signe) ou changer entre les valeurs des deux segments contributeurs. Si la série chronologique comprend trop de points de branche qui sont hors du plan d'image, l'analyse STAFF doit être répétée après l'édition manuelle du squelette, en plaçant une lacune (à l'aide de l'outil de peinture) dans le dessin de ligne à l'emplacement des points de branche manqués.
Nous avons découvert un problème commun dans l'acquisition d'image qui passe généralement inaperçu, mais a eu un effet fort sur la mesure des vitesses de débit à l'aide de STAFF. Dans l'acquisition d'image, l'instabilité ou le « scintillement » dans l'intensité de la source de lumière de lampe d'épi-illumination ou de l'éclairage de secteur dans la salle de microscope peut se produire. De l'une ou l'autre source, le baguage clair/foncé au fil du temps avec la période du scintillement se produit à l'angle zéro dans les kymographes. Si le pic à angle zéro est le pic majeur, alors même si l'angle produit par le mouvement des globules rouges à travers le vaisseau où la vitesse d'écoulement est mesurée est évident pour l'œil humain, le plugin directionnalité s'adapte à une courbe au pic zéro et signale une valeur très proche de zéro degrés, résultant en des mesures de vitesse qui sont irréalistement élevés. Même si le pic à angle zéro n'est pas le pic majeur, il influencera l'ajustement de la courbe de directionnalité de telle sorte que la vitesse signalée est déplacée vers une valeur plus élevée. Pour résoudre ce problème, STAFF fournit une option de « correction de scintillement » qui ignore les angles de pointe se produisant à 0 degrés. Cette modification a éliminé les effets du scintillement de la lampe sans affecter les quantifications de vitesse.
La principale limitation de l'obtention des vitesses d'écoulement à l'aide de la microscopie à large champ est que l'acquisition d'images est limitée à des préparations minces telles que la vascularisation mésentérique, ou les vaisseaux intersegmentaires de poisson zèbre ou les couches superficielles d'organes tels que le foie ou rein qui peut être extériorisé.
Un avantage significatif de l'utilisation de STAFF par rapport aux méthodes existantes de quantification du débit est qu'il permet une détection rapide et impartiale des modèles spatiaux et temporels du flux vasculaire. La collecte et l'analyse des données sur les flux microvasculaires à l'aide de systèmes de balayage raster sont généralement limitées aux mesures des capillaires sélectionnés par un seul utilisateur à la fois20,21,22,23. Des méthodes existent pour extraire les vitesses d'écoulement dans les champs24,25,26, mais aucune de ces approches ne supportent l'analyse dans des champs entiers et toutes sont à forte intensité de main-d'œuvre. À l'aide de STAFF, l'analyse de chaque segment capillaire au fil du temps sur l'ensemble du champ d'images d'un jeu de données avec des dizaines de milliers d'images peut être réalisée en une journée. L'analyse manuelle d'un seul ensemble de données du flux vasculaire de plein champ prendrait des mois à des années. Ainsi, l'analyse manuelle n'est pas pratique, même pour la caractérisation du débit normal et ne permet manifestement pas la comparaison de plusieurs groupes de traitement.
La facilité de la quantification staff du modelage spatiotemporal du flux vasculaire offre la possibilité pour les futurs utilisateurs de lier les observations morphologiques vasculaires aux effets sur le modèle de vitesse d'écoulement capillaire. En définissant la relation entre les mesures de morphologie vasculaire des diamètres des vaisseaux et la topologie du réseau pour le modèle de vitesse d'écoulement, nous pouvons alors être en mesure de prédire les modèles d'écoulement de la morphologie vasculaire. De même, la corrélation des schémas vasculaires et de la morphologie vasculaire avec des événements tels que le moment, la localisation et l'étendue de l'infiltration des cellules immunitaires, les lésions tissulaires résultant d'une exposition ou d'une maladie toxique, ou l'état du transport intracellulaire, donnerait non seulement nous une meilleure compréhension du schémaage du débit et de la fonction cellulaire dans la santé et la maladie, mais fournirait également un cadre pour identifier les scénarios pathophysiologiques particulièrement nocifs.
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Disclosures
Les auteurs ne font état d'aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Les études présentées ici ont été financées par les National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 et NIH NIDDK P30 DK079312). Des études de microscopie intravitale ont été menées à l'Indiana Center for Biological Microscopy. Nous remercions le Dr Malgorzata Kamocka pour son assistance technique en microscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 G x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
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