Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Vurdering af de luftbårne partiklers akutte toksicitet ved indånding ved at udsætte dyrkede humane lungeceller ved luftflydende interface

Published: February 23, 2020 doi: 10.3791/60572
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 5, 3,4, 2, 2, 1, 3,4, 1,2
1Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology, 2Walther Straub Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Munich, 3Cultex Laboratories GmbH, 4Cultex Technologies GmbH (formerly Cultex Laboratories GmbH), 5seh consulting + services

Summary

Vi præsenterer et robust, overførbart og prædiktivt in vitro eksponeringssystem til screening og overvågning af luftbårne partikler vedrørende deres akutte lungecytotoksicitet ved at udsætte dyrkede menneskelige lungeceller på luftflydende interface (ALI).

Abstract

Her præsenterer vi et specielt designet modulopbygget in vitro eksponeringssystem, der muliggør ensartet eksponering af dyrkede menneskelige lungeceller på ALI til gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks cigaretrøg), hvilket giver realistiske fysiologiske eksponering af den menneskelige alveolærs apiske overflade for luft. I modsætning til sekventielle eksponeringsmodeller med lineær aerosolvejledning opfylder det modulære design af radiale flowsystem alle krav til kontinuerlig generering og transport af testatmosfæren til cellerne, en homogen fordeling og aflejring af partiklerne og den fortsatte fjernelse af atmosfæren. Denne eksponeringsmetode er primært beregnet til at blive eksponeret for celler for luftbårne partikler, men kan tilpasses eksponeringen af flydende aerosoler og meget giftige og aggressive gasser afhængigt af aerosolproduktionsmetoden og eksponeringsmodulernes materiale .

Inden for rammerne af en nyligt afsluttet valideringsundersøgelse blev dette eksponeringssystem bevist som en overførbar, reproducerbar og prædiktiv screeningsmetode til kvalitativ vurdering af luftbårne partiklers akutte lungecytotoksicitet, hvorved luftbårne partikler blev vurderet, potentielt reducere eller erstatte dyreforsøg, som normalt ville give denne toksikologiske vurdering.

Introduction

Indånding af giftige luftbårne partikler er et folkesundhedsproblem, der fører til en lang række sundhedsrisici på verdensplan og mange millioner dødsfald årligt1,2. Klimaændringer, den igangværende industrielle udvikling og den stigende efterspørgsel efter energi, landbrug og forbrugsvarer har bidraget til stigningen i lungesygdomme i de seneste år3,4,5,6. Viden om og evaluering af inhalerbare stoffer vedrørende deres akutte toksicitet ved indånding danner grundlag for risikovurdering og risikostyring, men disse oplysninger mangler stadig for en lang række af disse stoffer7,8. Siden 2006 har EU's kemikalielovgivning Reach (Registrering, Evaluering, Autorisation og Begrænsning af Kemikalier) kræves, at allerede eksisterende og nyindførte produkter underkastes en toksikologisk karakterisering, herunder inhalationsvejen, før de markedsføres. Reach fokuserer derfor på alternative og animalske metoder, gennemførelse af "3R"-princippet (erstatning, raffinement og reduktion af dyreforsøg) og anvendelse af passende in vitro-modeller9. I de seneste år er der udviklet mange forskellige og tilstrækkelige modeller til test af inhalationstoksicitet uden for dyr (f.eks. in vitrocellekulturer, lunge-on-a-chip-modeller, præcisionssnitilungeskiver (PCLS)) for at vurdere den akutte toksicitet ved indånding af luftbårne partikler5,7,10,11. Med hensyn til in vitrocellekulturmodeller kan dyrkede celler eksponeres under neddykkede forhold eller ved ALI (figur 1). Gyldigheden af undersøgelser af neddykket eksponering er imidlertid begrænset med hensyn til vurderingen af toksiciteten af luftbårne forbindelser, især partikler. Nedsænket eksponeringsteknikker svarer ikke til den menneskelige in vivo-situation cellekulturmediet, der dækker cellerne, kan påvirke de fysisk-kemiske egenskaber og dermed de toksiske egenskaber ved et teststof12,13. ALI in vitro inhalation modeller tillader direkte eksponering af celler til teststoffer uden indblanding af cellekultur medium med testpartikler, således efterligne menneskers eksponering med højere fysiologiske og biologiske lighed end neddykket eksponering12,14.

For reguleringsprocesser som REACH er der imidlertid kun tilgængelige dyremodeller inden for akut inhalationstoksikologi, da ingen alternative in vitro-metoder indtil videre er blevet tilstrækkeligt valideret og officielt accepteret indtil videre14. Med henblik herpå skal testmodellervalideres i overensstemmelse med kravene i Eu's referencelaboratorium for alternativer til dyreforsøg (EURL-ECVAM) om testgyldighed15.

En tidligere prævalideringsundersøgelse og en nyligt afsluttet valideringsundersøgelse viste med succes anvendelsesområdet for CULTEX RFS-eksponeringssystemet og dets overførsel, stabilitet og reproducerbarhed13. Dette eksponeringssystem er et in vitro-cellebaseret eksponeringssystem, der muliggør ensartet eksponering af celler for gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks. cigaretrøg) ved ALI på grund af dets radiale aerosoldistributionskoncept og udførelsen af testaerosolet i et kontinuerligt flow over cellerne16. Grundmodulet i dette radiale flowsystem består af indløbsadapteren, aerosolets styremodul med en radial aerosolfordeling, prøvetagnings- og stikmodulet og et låsemodul med et håndhjul (figur 2). De genererede partikler når cellerne via indløbsadapteren og aerosolstyremodulet og deponeres på cellekulturindsatserne, som er placeret i prøvetagningsmodulets tre radialt arrangerede eksponeringskamre. Aerosolets styremodul samt prøvetagningsmodulet kan opvarmes ved at tilslutte sig et eksternt vandbad17.

Inden for rammerne af begge undersøgelser blev der anvendt A549-celler til alle eksponeringsforsøg. Cellelinjen A549 er en human udødeliggjort epitelcellelinje, der er meget velkarakteriseret og har været brugt som in vitro-model for type II alveolar epitelceller i talrige toksikologiske undersøgelser. Cellerne er karakteriseret ved lamellar organer, produktion af overfladeaktive stof og en række inflammation-relevante faktorer18. De viser også egenskaber bronkial epitelceller på grund af deres slim produktion19. Desuden kan de dyrkes på ALI. Selv om denne cellelinje er mangelfuld i opbygningen af celle-celle kontakter, dyrkning af disse celler er langt mere praktisk, billigere og resultater afledt heraf er donor-uafhængige i forhold til primære celler20.

A549 celler blev seedet i 6-brøndcellekultur skær (PET membran, 4,67 cm2, pore størrelse 0,4 mm) med en tæthed på 3,0 x 105 celler pr indsætte og dyrket i 24 timer under neddykkede forhold. Celler blev derefter eksponeret i tre uafhængige laboratorier for ren luft og tre forskellige eksponeringsdoser (25, 50 og 100 μg/cm2) af 20 teststoffer ved ALI. Eksponeringsdosis korreleres med aflejringstiden, hvilket resulterer i en konstant partikelhastighed på henholdsvis 25 μg/cm2,50 μg/cm2 og 100 μg/cm2 på cellerne efter henholdsvis 15, 30 eller 60 min. De deponerede partikler blev dog ikke vasket af efter aflejring, men forblev på cellerne i 24 timer. Partiklernes aflejringstider var derfor 15, 30 og 60 min, men eksponeringen af cellerne varede i 24 timer i alt. Teststoffernes depositionrate blev fastsat ved indledende forsøg efter tidligere metoder17.

Cellelevedygtigheden som indikator for toksicitet blev vurderet 24 timer efter partikelaflejring ved hjælp af en cellelevedygtighedsanalyse. Der blev sat særlig fokus på kvaliteten af ren luftkontrol, optimering og forfinelse af eksponeringsprotokollen, intra- og interlaboratoriereproducerbarheden og etablering af en forudsigelsesmodel (PM). Stoffer, der førte til et fald i cellelevedygtigheden på under 50 % (PM 50 %) eller 75% (PM 75%) ved en af de tre eksponeringsdoser blev anset for at have en akut inhalationsfare. Resultaterne blev derefter sammenlignet med eksisterende in vivo-data (baseret på mindst én pålidelig undersøgelse ifølge OECD's testretningslinje (TG) 403 eller TG 43621,22), hvilket førte til en samlet overensstemmelse på 85 %, med en specificitet på 83 % og en følsomhed på 88 %23.

Ud over måling af cellelevedygtighed kan andre endepunkter såsom cytokinfrigivelse, undersøgelse af cellelysate- eller membranintegriteten via LDH-analyse vurderes, men var ikke påkrævet til valideringsundersøgelsen. Eksponeringssystemet (f.eks. Følgende protokol anbefales til eksponeringsforsøg med luftbårne partikler ved hjælp af dette eksponeringssystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Protokollen for et eksponeringseksperiment dækker en periode på tre dage.

Dag 1

1. Generel tilberedning og dyrkning af celler

BEMÆRK: Den menneskelige lunge adenocarcinom epitelcellelinje A549 blev brugt til eksponeringsforsøg. Celler skal håndteres under sterile forhold. Andre cellelinjer, der er egnede til dyrkning på ALI kan anvendes.

  1. Vækstmediet (Dulbeccos Minimum Essential Medium (DMEM), suppleret med 10% føtal kvægserum (FBS) og 5 μg/ml gentamycin) og eksponeringsmediet (DMEM, suppleret med 5 μg/ml gentamycin og en endelig HEPES-koncentration på 100 mM).
  2. Kultur A549-celler i vækstmedium ved 37 °C i en befugtet atmosfære , der indeholder 5% CO2.
  3. Dyrk celler i cellekulturkolbe på 75 cm2 (T-75) i 14 ml vækstmedium indtil et sammenløb på 80-90% før opdeling (hver 2-3 dage) og en passage på 35.
  4. Beregn affjedringsvolumenet og det krævede antal cellekulturskær (tre cellekulturskær som inkubatorkontrol og cellekulturskær til ren luft- og partikeleksponering) og cellekulturplader.
  5. Før trypsinisering og såning af celler, tilsæt 2,5 ml hærdet vækst medium til hver brønd af en 6-brønd plade. Placer cellekulturskær uden celler omhyggeligt inde i brøndene, og tilføj 1 ml vækstmedium til hver cellekulturindsats. Inkuber 6-brøndpladerne i mindst 30 min i rugemaskinen (37 °C, 5% CO2).

2. Trypsinisering af celler

  1. Temper fosfat buffered saltvand (PBS) og vækstmedium ved 37 °C og trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) løsning ved stuetemperatur.
  2. Aspirat cellekulturmediet fra cellekulturkolbe og vask cellerne omhyggeligt med 8 ml forvarmet PBS.
  3. Fjern PBS, tilføj 2 ml af trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) opløsning på cellerne og inkubere i maksikal6 min. i rugemaskinen ved 37 °C. Styr løsrivelsesprocessen under mikroskopet.
  4. Neutralisere trypsinaktiviteten ved at tilføje 8 ml forvarmet vækstmedium, frigøre cellerne ved forsigtigt at trykke sidelæns på kolben og ophænge cellerne igen ved gentagne pipettering op og ned.
  5. Overfør celleaffjedringen til et 50 ml rør. Der bestemmes cellenummeret for yderligere procedure (f.eks. såning af celler, cellepassage).

3. Bestemmelse af cellenummer

BEMÆRK: Cellekoncentrationen blev bestemt ved hjælp af en celletæller eller optællingskamre.

  1. Fortyndet 100 μL af cellekultursuspensionen i en kop fyldt med 10 ml isotonisk opløsning. Vip koppen langsomt uden at ryste.
  2. Bestemme antallet af levedygtige celler/ml og cellelevedygtighed baseret på de cellespecifikke måleparametre for A549-celler.

4. Seedning af celler på mikroporøse membraner i cellekultur skær

BEMÆRK: Eksponeringssystemet er udstyret med specielle adaptere, der gør det muligt at bruge kommercielle skær fra forskellige leverandører og forskellige størrelser. Til disse eksponeringsforsøg blev der anvendt 6-brøndsplader og de tilsvarende cellekulturskær. Alle arbejdstrin skal udføres under sterile forhold.

  1. Sørg for forvarmet vækstmedium under sterile cellekulturforhold (laminarflow).
  2. Celleaffjedringen tilberedes tilstrækkeligt høj med en cellekoncentration på 3,0 x 105 celler/ml.
  3. Efter temperering pladerne i 30 min, aspirere mediet i cellekultur skær og frø 1 ml A549 celler med en tæthed på 3,0 x 105 celler / ml i hver celle kultur indsætte. Fordel celleaffjedringen ved skånsom vuggende.
  4. Inkuber cellekulturen skær med celleaffjedring i 24 timer (37 °C og 5% CO2).

5. Tryk ning af teststoffer

BEMÆRK: Teststoffer blev presset ind i pulverkager ved hjælp af en fuldt kontrollerbar hydraulisk presse. Pressepakken kan anvende en maksimal kraft på 18 kN, hvilket vises som det aktuelle olietryk (i bar) i pressepakken. Presseforhold (presningstryk, pressetid) af ukendte teststoffer skal fastslås og karakteriseres ved indledende test. Afhængigt af et stofs presseegenskaber kan der anvendes forskellige presseparametre og trykkende stempel.

FORSIGTIG: Bær beskyttelsesudstyr, når du trykker på giftige eller farlige stoffer.

  1. Indstil pressetiden via tidsstyringen på forsiden af pressen.
  2. Åbn tryklufttilførslen ved trykluftventilen. Indstil tryklufttrykket til ca. 2 bar (angivet med en trykmåler på forsiden) ved hjælp af trykregulatoren på forsiden af pressen eller på trykluftventilen for tryklufttilførslen. Træk skuffen ud, tryk på trykknappen, og læs tryktrykket på den digitale trykafbryder.
    1. Læs kun trykket ved trykregulatoren, hvis trykket er for højt eller for lavt.
  3. Stofbeholderen monteres, og sørg for, at glascylinderen er korrekt centreret (supplerende figur 1). Stofbeholderen fyldes med en lille mængde teststof. Sæt stemplet ind i stofbeholderen, og drej det lidt frem og tilbage for at fordele pulveret i beholderen jævnt.
  4. Anbring stofbeholderen med stemplet i skuffen, og tryk på trykknappen. Pressens hydrauliske stempel bevæger sig ind på stemplet og udøver et tryk på teststoffet for den indstillede trykketid. Åbn skuffen, og fjern stemplet.
  5. Trin 5.3 og 5.4 gentages, indtil stofbeholderen er mindst halvt fuld.
  6. Når presningen er afsluttet, skal du fjerne stofbeholderen fra skuffen og vende den på hovedet for at fjerne løse og deponerede partikler.
  7. Hvis stofbeholderen ikke er nødvendig samme dag, skal substansbeholderen lukkes med parafilm for at forhindre teststoffet i at udtørre eller absorbere fugt.

Dag 2

6. Samling af eksponeringssystemet og tilslutning af det perifere udstyr

NOTE: I figur 3, supplerende figur 2 og supplerende figur 3findes der en mere detaljeret oversigt . Saml både moduler og aerosolgeneratoren i overensstemmelse med producentens anvisninger.

  1. Placer eksponeringssystemet på en fast og jævn overflade, hvor vandforsyningen vender fremad. Tilslut massestrømsregulatorerne med aerosolgeneratoren og en trehalset flaske, der er tilsluttet modulet for eksponering for ren luft.
  2. Tilslut strømningsregulatoren og vakuumpumpen. Tilslut rørene fra flowcontrollerne med rørstikket på tilbehøret til aerosolets styremodul. Tilslut rørene på den anden side af flowcontrollerne med vakuumpumpen. Sørg for, at flowet går fra modulet gennem flowregulatorerne til vakuumpumpen.
  3. Tilslut vandbadet med varmevandforsyningen. Vandforsyningen går fra vandbadet til vandindløbet på aerosolets styremodul. Tilslut vandudtagningen af aerosolets styremodul med prøvetagningsmodulets vandindtag. Luk cirklen med en forbindelse fra prøvetagningsmodulets vandudtagningsmodul til vandbadet.
  4. Aerosolgeneratorenans anbringsningsgeneratoren, herunder elutriatoren, tæt på eksponeringsmodulet, og elutriatorens overskydende linjer og eksponerings- og renluftsmodulet med store mikrofiltre og eksponeringskamrenes sugning med små mikrofiltre (f.eks. engangsfiltre). Elutriatoren fungerer som reservoir for den genererede partikelatmosfære og bevarer partikler, der er større end ca. 7 μm, mens mindre partikler transporteres til eksponeringsmodulet.
  5. Tilslut den computer, der bruges til at styre aerosolgenereringen, til usb-porten på aerosolgeneratortoppen via et USB-kabel og strømforsyningen til strømforsyningsporten. Tilslut strømstikket på strømforsyningsenheden til en stikkontakt (220-240 V).
  6. Tilslut rørene til medium forsyning og fjernelse med to pumper. I stedet for at bruge en pumpe til medium forsyning, kan mediet også fyldes manuelt.

7. Forberedelse til ren luft og partikeleksponering

  1. Tænd for vakuumpumpen, strømningsregulatorerne og vandbadet (37 °C) i en opvarmningsperiode på mindst 30 min.
  2. Åbn trykluftforsyningen. Indstil massestrømsregulatorerne til 8 L/min for tilførselslinjen til aerosolgeneratoren og til 3 L/min for forsyningsledningen til den trehalsede flaske. Luk fanerne for massestrømscontrollerne.
    BEMÆRK: Disse værdier kan variere afhængigt af teststoffets egenskaber.
  3. Juster strømningsregulatorerne via computeren for at regulere modulflowet (1,5 L/min) og kammerets suge (30 ml/min).

8. Lækagetest af radiale flowsystem

BEMÆRK: Lækagekontrollen skal udføres under vakuum og for begge moduler (eksponerings- og renluftsmodul) for at sikre, at modulet er blevet samlet korrekt.

  1. Fjern indløbsadapteren og kondensatreflektoren fra aerosolets styremodul. Luk de tre aerosolfodringsboringer i aerosolets styremodul med stik og mellemstore forsyningsforbindelser på prøvetagningsmodulet med dukkeklapper.
  2. Tilslut vakuumlinjerne uden filteret med rørstikket i aerosolets styremodul. Luk modulet ved hjælp af håndhjulet, og mål værdien af flowcontrollerne. Værdierne bør falde nogle minutter efter lukning under 5 ml/min.
  3. Efter uigennemtrængelighedskontrollen skal alle stik og dukkeklapper fjernes, sætte indløbsadapteren og kondensatreflektoren i aerosolledemodulet og tilslutte rørene til medium forsyning og fjernelse.

9. Aerosolgeneration

  1. Start computeren og softwaren (supplerende figur 4). Start aerosol generator software ved at dobbeltklikke på aerosol generator startknappen på skrivebordet på computeren. Der vises et meddelelsesvindue, og du bliver spurgt, om indstillingerne skal nulstilles eller ej. Klik på Ja, hvis softwaren startes første gang den pågældende dag. Angiv værdierne for diasplacering og skraberplacering til standardværdierne. Klik på Nej for at bevare værdierne for slideposition og skraberposition, ellers er diaset ikke i udgangspositionen.
  2. Skru en stofskraber ind i røret, som er placeret i den centrale åbning af aerosolgeneratortoppen.
    BEMÆRK: Afhængigt af pressens egenskaber kan der anvendes forskellige typer stofskraber.
  3. Brug knappen Homing Mode, hvis stofskraberen ikke er i den laveste position.
  4. Anbring stofbeholderen med det pressede testmateriale på hovedet over stofskraberen. Sørg for, at glas stofbeholderen vender mod forsiden. Sørg for, at de to huller i stofbeholderen passer på aerosolgeneratortoppens to ben. Sæt låsepladen i åbningen over stofbeholderen, og stram den sorte skrue.
  5. Ændre værdierne for feed (0,24 til 20 mm/h) og Rotation (1 til 800 omdrejninger/h) til de ønskede indstillinger. Partikelkoncentrationen kan ændres ved at øge eller reducere foderværdien eller bæregasstrømshastigheden.
  6. Brug de nedadgående pile til at skubbe ned sliden med stoffet beholder, indtil stoffet skraber er i nærheden af det pressede stof.
  7. Åbn tryklufttilførslen til aerosolgeneratoren med et tryk på massestrømsregulatoren, og start aerosoldannelsen ved at klikke på knappen Start. Indstil feedhastigheden til 15-20 mm/h for at undgå lange ventetider.
  8. Styr den korrekte partikelgenerering ved at observere den fine støvsky med en lille lommelygte (placeret nedefra bag elutriatorens glasrør). Skift værdien for Feed tilbage til de ønskede indstillinger, når den første aerosoldamp når kontinuerligt Elutriatoren og klik på stop-knappen.

10. Eksponeringsforsøg

  1. Start den mellemste forsyning med forvarmet eksponeringsmedium, og fyld prøvetagningsmodulerne, indtil downpipeserne er dækket, mens modulet er åbent. Brug mediet pumpe eller fyld mediet manuelt (25 ml pr. individuelt eksponeringskammer).
  2. Indsæt blindcellekulturskær (skær uden celler) i eksponeringsmodulet. Pump eksponeringsmediet ned, indtil downpipes er dækket med medium og den nederste side af indsatserne er i kontakt med medium.
  3. Start aerosolgeneratoren, luk eksponeringsmodulet, og tilslut eksponeringsmodulet med aerosolgeneratorens eksponeringsmoduludløb. Giv aerosolgeneratoren en leveringstid på mindst 20-30 min. før eksponeringerne påbegyndes for at muliggøre en stabil generation af partikler.
  4. Forbered post-inkubationspladerne til rugemaskinekontrollerne og de udsatte cellekulturskær i gennemløbstiden. Tilsæt 1,5 ml vækstmedium pr. brønd og inkuberpladerne i rugemaskinen (37 °C, 5% CO2).
  5. Efter gennemløbstiden forsegles Elutriatorens eksponeringsmoduludløb med et gummistik og fjernes med de blinde skær. Genopfyld eksponeringsmediet (ved hjælp af pumpen eller manuelt), indtil downpipes er dækket med medium. Nu åbner også tryklufttilførslen til det rene luftmodul med hanen på massestrømsregulatoren (3 L/min)
  6. Fjern cellekulturindsatserne fra 6-brøndspladerne ved hjælp af en pincet. Hæld vækstmediet forsigtigt fra cellekulturen skær ud ved at vælte skær og aspirere og kassere den resterende væske ved hjælp af en pipette. Sæt indsatserne i eksponeringskamrene i begge moduler, eksponerings- og renluftsmodulet.
  7. Luk modulerne, og start eksponeringsforsøgene ved at forbinde eksponeringsmodulet med aerosolgeneratorens eksponeringsmoduludløb og det rene luftmodul til transportgasforsyningen samtidigt.
    BEMÆRK: Partikelkoncentrationen kan ændres ved at øge/reducere foderværdien, bæregasstrømningshastigheden eller eksponeringstidspunktet.
  8. Afbryd eksponerings- og rene luftmodulerefter forsøgets afslutning, og besegl udtagningsmodulet.
  9. Stop trykluftforsyningen og aerosolgeneratoren ved at klikke på stop-knappen.
  10. Åbn eksponerings- og renluftsmodulet, og overfør cellekulturindsatserne til de forberedte postinkubationsplader ved hjælp af en pincet. Inkuber 6-brøndpladerne for 24 timer (37 °C, 5% CO2)ved ALI.
    BEMÆRK: Gentag trin 10.5 -10.10, hvis der planlægges yderligere eksponeringsforsøg.
  11. Løft cellekulturskær, der anvendes som inkubatorkontrol til ALI'en under de samme betingelser som de eksponerede cellekulturskær og inkubere dem i 24 timer (37 °C, 5% CO2)på ALI.
  12. Brug knappen Homing Mode til at fjerne stofbeholderen. Luk aerosolgeneratorsoftwaren ved at klikke på X i øverste højre hjørne og slukke for computeren.
  13. Efter afslutningen af alle eksponeringsforsøg skal aerosolgeneratoren og begge eksponeringsmoduler rengøres. Luk stofbeholderen med parafilm, hvis teststoffet vil blive anvendt yderligere inden for de næste dage.

Dag 3

11. Cellelevedygtighed

BEMÆRK: Cellelevedygtigheden blev bestemt 24 timer efter partikelaflejring ved at måle mitokondrielle aktivitet ved hjælp af WST-1-analysen. Analysen blev udført i henhold til producentens protokol. Cellelevedygtigheden kan også bestemmes ved hjælp af andre cellelevedygtighedstest (f.eks. XTT).

  1. Temperamentsvækstmedium ved 37 °C, og optø WST-1-løsningen, der er beskyttet mod lys. Forbered et passende antal nye 6-brøndsplader med 2,5 ml vækstmedium pr. brønd og inkuberpladerne i rugemaskinen.
  2. Klargør WST-1 fortynding ved at fortynde en tilstrækkelig mængde WST-1 1:7 i vækstmedium
  3. Indsæt cellekulturen skær 24 timer efter eksponering i de nye forberedte 6-brønds plader. Tilføj 1 ml af den frisklavede WST-1-løsning til hvert cellekulturskær. Pladerne rokkes omhyggeligt for at fordele opløsningen homogent på cellerne. Inkuber 6-brøndspladerne med cellekulturskær i 1 time (37 °C, 5% CO2).
  4. Overfør 100 μL af supernatanten i treeksemplarer fra hver 6-brønd til en 96-brønds plade. Mål absorbansen ved 450 nm med en referencebølgelængde på 650 nm ved hjælp af en mikropladelæser.

12. Statistik

  1. Normalisere cellelevedygtigheden af de enkelte kuvøse kontroller til 100%.
  2. Udtryk levedygtigheden af de eksponerede celler i forhold til de enkelte kuvøse kontrol. Cytotoksicitet af teststoffer blev sammenlignet med de respektive inkubatorkontroller og anvendt som indikator for toksicitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CULTEX RFS er et specialdesignet modulopbygget in vitro-eksponeringssystem, der muliggør direkte og homogen eksponering af celler ved ALI' en. Inden for en tidligere prævalideringsundersøgelse blev det med succes påvist, at dette eksponeringssystem generelt kunne anvendes, og dets omsættelighed, stabilitet og reproducerbarhed. I et nyligt forskningsprojekt finansieret af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning blev eksponeringssystemet med succes valideret og etableret som en forudsigelsesmodel (PM) for akutte inhalationsfarer ved de testede forbindelser. Da kvaliteten af kontrollen med ren luft viste sig at være et kritisk parameter under prævalideringsundersøgelsen, blev der i begyndelsen af valideringsundersøgelsen gennemført flere protokol- og metodeoptimeringer (f.eks. ændring af cellekulturindsatser, stabilisering af eksponeringsmediets pH-værdi ved at øge HEPES-koncentrationen til 100 mM) ved valideringsundersøgelsens begyndelse, hvilket førte til meget stabile og reproducerbare resultater og en betydelig forbedring af dataene om ren luftpå tværs af alle tre laboratorier (figur 4). A549-celler blev derefter eksponeret ved ALI for tre forskellige eksponeringsdoser (25, 50 og 100 μg/cm2) af 20 forhåndsudvalgte og kodede teststoffer i de tre uafhængige laboratorier, og cytotoksicitet (anvendt som indikator for toksicitet) blev sammenlignet med de respektive inkubatorkontrol. 13 kodede stoffer blev derved testet i tre eksemplarer, syv kodede stoffer som enkeltforsøg. Teststoffer blev anset for at have en akut inhalationsfare, da cellelevedygtigheden faldt til under 50 % (PM 50 %) eller 75 % (PM 75 %).

Som vist eksemplarisk i figur 5udviste eksponering af A549-celler for forskellige teststoffer ingen, medium eller stærk toksicitet. Da alle forsøg blev udført uafhængigt i tre laboratorier, blev der analyseret data om reproducerbarheden i og mellem laboratorierne og eksponeringssystemets forudsigelighed. Afhængigt af den anvendte PM (PM 50% eller PM 75%), inden for laboratoriet og mellem-laboratorium reproducerbarhed varierede fra 90-100%, viser robusthed og overførbarhed af denne metode. Da alle testede stoffer havde relevante tilgængelige in vivo-referencedata (baseret på mindst én pålidelig undersøgelse ifølge OECD TG 403 eller TG 436 ved hjælp af en traditionel LC50-protokol og en koncentration x time (C x t) protokol), in vivo- og in vitro-data afslørede en samlet overensstemmelse på 85 % (17/20) med en specificitet på 83 % (10/12) og en følsomhed på 85 % (7/8) (tabel 1). Kun to stoffer blev klassificeret som falsk positive og et som falsk negativt.

Sammenfattende præsenterer vores resultater af valideringsundersøgelsen en overførbar, reproducerbar og prædiktiv screeningsmetode til kvalitativ vurdering af de udvalgte luftbårne partiklers akutte lungecytotoksicitet.

Figure 1
Figur 1: Eksponering af celler ved ALI eller under neddykkede forhold. A549 celler kan enten eksponeres med et teststof (blå pile og prikker) ved ALI (til venstre) gennem et indløb af eksponeringssystemet eller med teststoffet fortyndet i eksponeringsmedium (blå prikker), hvilket skaber undermersebetingelser (til højre). Røde stiplede linjer repræsenterer fyldniveauerne for eksponeringsmedium (lyserødt) i den respektive eksperimentelle opsætning. Dette tal er blevet ændret fra Tsoutsoulopoulos et al.24. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Eksponeringsmodulet. Skematisk oversigt over det grundlæggende modul i radiale flowsystem bestående af indløbsadapteren, aerosolstyremodulet, prøvetagnings- og stikmodulet og et låsemodul med et håndhjul. Dette tal er blevet ændret fra Aufderheide et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Oversigt over eksponeringssystemet. Komponenterne er de to eksponeringsmoduler til ren luft- og partikeleksponering, aerosolgeneratoren, herunder elutriatoren og den tilsvarende styreenhed, og de mellemstore pumper. Dette tal er blevet ændret fra Aufderheide et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Rene luftlevedygtighedsdata efter optimering af testmetoden. Cellers eksponering for ren luft førte til et fald i cellernes levedygtighed over tid, hvilket førte til en betydelig forbedring af data om ren lufts levedygtighed sammenlignet med undersøgelsen forud for valideringen. Alle ren luft kontrol blev samlet for hvert laboratorium (Lab 1-3) og eksponering tid (n = 46 per laboratorium og punkt i tid). Data vises som boxplots med en midterlinje og det område, der er angivet af whiskers. Dette tal er blevet ændret fra Tsoutsoulopoulos et al.23. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Eksponering af A549-celler for forskellige teststoffer. A) Eksponering af A549-celler for wolfram(IV) carbid viste ingen fald i cellernes levedygtighed for de tre forskellige eksponeringsdoser og syntes at være ikke-giftig (n = 3 pr. laboratorie- og eksponeringsdosis). (B) Eksponering af celler for tetrabromofthalic anhydrid resulterede for alle laboratorier med en moderat toksicitet, der viste en god dosisresponskurve (n = 1 pr. laboratorie- og eksponeringsdosis). (C)Zink dimethyldithiocarbamat udviste en stærk toksicitet, hvilket førte til en nedsat cellelevedygtighed allerede efter en deponeret dosis på 25 μg/cm2 (n = 3 pr. laboratorie- og eksponeringsdosis). Fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Dette tal er blevet ændret fra Tsoutsoulopoulos et al.23. Klik her for at se en større version af denne figur.

Referenceresultater in vivo Resultater in vitro
Stof OECD TG CLP-regulering Toksicitet PM50% PM75% Overensstemmelse i vivo / in vitro
Wolfram(IV) hårdmetal 403 n. 0 0 0 Ja
Wolfram(IV) carbid nano - n. c. 0 0 0 Ja
N,N'-ethylenebis(N-acetylacetamide) EPA OPPTS 870.1300 n. c. 0 0 0 Ja
Siliciumdioxid 403 n. c. 0 0 0 Ja
Diammonium hydrogenortho-fosfat 403 n. c. 0 0 0 Ja
Dinatriumfluorophosphat 403 n. c. 0 0 0 Ja
Neodymoxid 436 n. c. 0 0 0 Ja
Kalium hydrogen monopersulfat 403 n. c. 0 0 0 Ja
Cyclohepta-pentylose 403 n. c. 0 0 0(2x) / 1(1x) (Ja)
Vanadium(III) oxid 403 n. c. 0 0 0(2x) / 1(1x) (Ja)
Tetrakalium pyrophosphat 403 n. c. 0 1 1 Nej
Tetra-bromofthalic anhydrid 403 (lignende) n. c. 0 1 1 Nej
Cetylpyridiniumchlorid 403 Akut Tox. 2 1 1 1 Ja
N-Lauroylsarcosin natriumsalt 403 Akut Tox. 2 1 1 1 Ja
Zink dimethyldithio-carbamate 403 Akut Tox. 2 1 1 1 Ja
Kobber(II) hydroxid 403 Akut Tox. 2 1 1 1 Ja
Zinkselenite 436 Akut Tox. 3 1 1 1 Ja
Natriummetavanadate 403 Akut Tox. 4 1 1 1 Ja
Divanadium pentaoxid 403 Akut Tox. 4 1 1 1 Ja
Cadmiumtelluride 403 Akut Tox. 4 (n. c.) 1 0 0 Nej
n. c. = ikke klassificeret 0 = ikke-giftig; 1 = giftig; CLP = klassificering, mærkning og emballering

Tabel 1: Overensstemmelse mellem in vivo- og in vitro-resultater. Ud af 20 stoffer blev 10 stoffer klassificeret som korrekt negative, og syv stoffer korrekt som positive, hvilket førte til en overensstemmelse på 85 % (17/20). Denne tabel er blevet ændret fra Tsoutsoulopoulos et al.23. (Test nr. 403: Akut toksicitet ved indånding, test nr. 436: akut toksicitet ved indånding - akut toksisk klassemetode; Akut Tox. 2 = dødelig, akut Tox. 3 = giftig, akut Tox. 4 = skadelig).

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: Samling af stofbeholderen. Billede taget fra CULTEX DG (Dust Generator) Brugervejledning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: Eksponeringssystemets aerosolstyremodul. A) Top visning og B) nederste visning af aerosol vejledende modul. Billede taget fra CULTEX RFS (Radial Flow System) Brugervejledning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur 3: Aerosolgeneratoren. A) Skematisk oversigt over aerosolgeneratoren, bestående af aerosolgeneratortoppen og Elutriatoren. Detaljeret visning af B) aerosolgeneratorens top og C) elutriatoren. Billede taget fra CULTEX DG (Dust Generator) Brugervejledning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplementary Figure 4
Supplerende figur 4: Aerosolgeneratorens styringssoftware. Billede taget fra CULTEX DG (Dust Generator) Brugervejledning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mange modeller for toksicitetstest for indånding af indånding uden for dyr er blevet udviklet i de senere år for at få oplysninger om den akutte fare for indånding af partikler, der kan inhaleres, og for at reducere og erstatte dyreforsøg i henhold til 3R-princippet25.

Med hensyn til cellekultur modeller, eksponering af celler kan ske under neddykkede forhold eller på ALI. Udsætter celler under neddykkede forhold kan påvirke de fysisk-kemiske egenskaber og dermed de giftige egenskaber af et teststof12. In vitro ALI inhalationsmodeller efterligner imidlertid situationen med større biologisk og fysiologisk lighed end neddykket eksponering og er derfor bedre egnet til at analysere luftbårne partiklers akutte toksicitet ved indånding. Betydningen af CULTEX RFS for andre eksisterende eksponeringsmoduler er ikke kun eksponering af celler under ALI-forhold, men også den meget homogene fordeling og aflejring af partikler. I modsætning til sekventielle eksponeringsmodeller med lineær aerosolvejledning muliggør denne eksponeringsmetodes modulære design en radial forsyningslinje, der fører til en meget homogen aflejring af partikler på cellerne17.

Det vigtigste punkt for vellykkede eksponeringsforsøg er den stabile og kongruente kvalitet af den rene luftkontrol. Der skal lægges særlig vægt på, at levedygtigheden af kontrollen med ren luft ikke påvirkes over tid og så tæt som muligt på 100 % i forhold til de tilsvarende inkubatorkontroller. Faktorer, der spiller en vigtig rolle med hensyn til ren luft levedygtighed er valget af egnede celle kultur skær, pH-værdien af eksponeringsmediet, og sammensætningen af den rene luft. Med hensyn til cellekultur skær, en god kvalitet og en høj tæthed af porer skal garanteres. Dette sikrer en bedre medium forsyning og en højere relativ luftfugtighed inde i cellekultur skær, beskytte cellerne mod udtørring26. Ved hjælp af cellekulturskær med sidevægsåbninger skal der anvendes specielle skærærmer for at undgå udsivning af testpartikler gennem sidevægsåbningerne, hvilket kan føre til en muligvis kontaminering af eksponeringsmediet. Et skift i pH-værdien, der er højere end 8 , kan allerede have en toksisk virkning på cellerne og kan derfor føre til en forringelse af cellernes levedygtighed27. Dette sker især i længere tid for partikelaflejring (f.eks. 60 min),hvis den rene luft indeholder mindre end 5 % CO2, eller hepes-koncentrationen af eksponeringsmediet er for lav, hvilket skal undgås.

Et kritisk spørgsmål i protokollen er presningen af teststofferne. Teststofferne skal være tilstrækkeligt komprimeret til en pulverkage i stofbeholderen til at muliggøre en stabil partikeleksponering. Stofferne skal således karakteriseres ved foreløbige forsøg med hensyn til deres presseegenskaber og for at få oplysninger om, hvilke trykstempel, type skrabningsblade eller foderprocenter der skal anvendes.

Det maksimale tryktryk på den hydrauliske presse er imidlertid 10 kN, hvilket samtidig repræsenterer belastningsgrænsen for glascylinderen og dermed en begrænsning af presningsprocessen. Stofbeholderen kan ikke modstå højere trykkekræfter end 10 kN. En højere trykkekraft kan give mulighed for presning af krystallinske stoffer og dermed udvide anvendelsen af denne presse, men ville kræve mere robuste stofbeholdere.

Desuden kan dette eksponeringssystem, som primært er udformet til undersøgelse af luftbårne partikeleksponeringer, tilpasses eksponeringen af flydende aerosoler og meget giftige og aggressive gasser afhængigt af aerosolproduktionsmetoden og eksponeringsmodulernes materiale. Udskiftning af aerosolgeneratoren med en membranforstøver og ved hjælp af et eksponeringsmodul i rustfrit stål gjorde det muligt at eksponere cellerne for meget giftige flydende aerosoler24.

Et andet kritisk spørgsmål er overbelastningseffekten. Cellelevedygtigheden kan ikke kun påvirkes af et teststofs toksikologiske egenskaber, men også af mængden af et stof, der deponeres på cellerne. Dette eksponeringssystem udviser faktisk betydelig lighed med de fysiologiske forhold i den menneskelige alveolærregion, men indeholder ingen rydningsmekanismer til fjernelse af partikler. Det er derfor meget vigtigt, at cellens levedygtighed ikke forringes på grund af et for stort antal partikler.

Protokollen heri beskriver den homogene eksponering af dyrkede humane lungeceller ved ALI for luftbårne partikler. Reproducerbarheden, dets robusthed og overførbarhed gør det nuværende eksponeringssystem gældende som in vitro-screeningsmetode til kvalitativ vurdering af inhalerbare partikler vedrørende deres akutte toksicitet ved indånding. Da der indtil videre ikke er tilstrækkeligt valideret alternative in vitro-metoder, vurderes akut lungetoksicitet stadig ved at udsætte dyr (f.eks. helkropskamre, næse- eller mundbehandlingsmetoder). Alle almindeligt accepterede OECD-testretningslinjer for akut toksicitet ved indånding (f.eks. En fremtidig retning vil derfor være at gælde i Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD) for accept som en in vitro-testretningslinje for akut toksicitet ved indånding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT og DS har intet at afsløre. Virksomheden Cultex Technology GmbH (tidligere Cultex Laboratories GmbH) producerer instrumenter (f.eks. CULTEX RFS, CULTEX DG), der anvendes i denne artikel. NM var ansat hos Cultex Laboratories GmbH i løbet af denne undersøgelse. OK er ansat hos Cultex Technology GmbH (tidligere Cultex Laboratories GmbH). Patentet PCT/EP2009/007054 for enheden er ejet af grundlæggeren af Cultex Technology GmbH Prof. Dr. Ulrich Mohr (tidligere Cultex Laboratories GmbH).

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Tyskland (Grant 031A581, underprojekt A-D)) og af Den Tyske Forskningsfond (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Forskningsuddannelsesgruppe GRK 2338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
A549 ATCC CCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEM Biochrom, Berlin, Germany FG 0415 used as growth medium
DMEM Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany 22320 used as exposure medium
FBS superior Biochrom, Berlin, Germany S 0615
Gentamycin (10mg/mL) Biochrom, Berlin, Germany A 2710
HEPES 1M Th. Geyer, Renningen, Germany L 0180
PBS Biochrom, Berlin, Germany L 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) Biochrom, Berlin, Germany L 2143
Cell culture material
CASY Cups Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651794
Cell culture plates Corning, Wiesbaden, Germany 3516 6­-well plates
Corning Transwell cell culture inserts Corning, Wiesbaden, Germany 3450 24mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYton Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021) Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany 2290152
WST-1 Abcam, Cambridge, United Kingdom ab155902
Instruments + equipment
CASY Cell Counter Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostat LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic Press Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeve Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large) Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany LP-050 Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small) Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany 9933-05-DQ Balston disposable filter
Medium pump Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser digital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 Pro Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pump KNF, Freiburg, Germany N86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min TrigasFI GmbH Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water Bath LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline Staredition RE 104

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
  2. Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 (2018).
  3. De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
  4. LANUV Nordrhein-Westfalen. Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
  5. Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
  6. Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
  7. Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
  8. Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
  9. Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
  10. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  11. Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  12. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
  13. Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  14. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  15. Eskes, C., Whelan, M. Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, Springer International Publishing. (2016).
  16. Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
  17. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
  18. Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
  19. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
  20. Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
  21. OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  22. OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  23. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
  24. Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
  25. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).
  26. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
  27. Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
  28. OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2018).
  29. OECD. Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , OECD Publishing. Paris. (2018).

Tags

Medicin Akut lungetoksicitet in vitro eksponeringssystem luftflydende grænseflade validering cytotoksicitet luftbårne partikler
Vurdering af de luftbårne partiklers akutte toksicitet ved indånding ved at udsætte dyrkede humane lungeceller ved luftflydende interface
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tsoutsoulopoulos, A., Gohlsch, K.,… More

Tsoutsoulopoulos, A., Gohlsch, K., Möhle, N., Breit, A., Hoffmann, S., Krischenowski, O., Mückter, H., Gudermann, T., Thiermann, H., Aufderheide, M., Steinritz, D. Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface. J. Vis. Exp. (156), e60572, doi:10.3791/60572 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter