Summary
Vi presenterer et robust, overførbart og prediktivt in vitro-eksponeringssystem for screening og overvåking av luftbårne partikler om deres akutte lungecytotoksisitet ved å utsette dyrkede menneskelige lungeceller ved luftvæskegrensesnittet (ALI).
Abstract
Her presenterer vi et spesialdesignet modulær in vitro eksponeringssystem som muliggjør homogen eksponering av dyrkede menneskelige lungeceller ved ALI til gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks. sigarettrøyk), og gir dermed realistisk fysiologisk eksponering av den apikale overflaten av den menneskelige alveolære regionen til luft. I motsetning til sekvensielle eksponeringsmodeller med lineær aerosolveiledning oppfyller den modulære utformingen av radialstrømningssystemet alle krav til kontinuerlig generasjon og transport av testatmosfæren til cellene, en homogen fordeling og avsetning av partiklene og kontinuerlig fjerning av atmosfæren. Denne eksponeringsmetoden er primært utformet for eksponering av celler for luftbårne partikler, men kan tilpasses eksponeringen av flytende aerosoler og svært giftige og aggressive gasser avhengig av aerosolgenereringsmetoden og materialet i eksponeringsmodulene .
Innenfor rammen av en nylig fullført valideringsstudie ble dette eksponeringssystemet bevist som en overførbar, reproduserbar og prediktiv screeningmetode for kvalitativ vurdering av akutt lungecytotoksisitet av luftbårne partikler, og dermed potensielt redusere eller erstatte dyreforsøk som normalt ville gi denne toksikologiske vurderingen.
Introduction
Innånding av giftige luftbårne partikler er en folkehelsebekymring, noe som fører til en rekke helserisikoer over hele verden og mange millioner dødsfall årlig1,2. Klimaendringer, den pågående industriutviklingen og den økende etterspørselen etter energi-, landbruks- og forbrukerprodukter har bidratt til økningen av lungesykdommer de siste årene3,4,5,6. Kunnskap og evaluering av inhalerbare stoffer om akutt innåndingstoksisitet gir grunnlag for farevurdering og risikostyring, men denne informasjonen mangler fortsatt for et bredt spekter av disse stoffene7,8. Siden 2006 krever EUs kjemiske lovgivning REACH (Registrering, evaluering, autorisasjon og begrensning av kjemikalier) at allerede eksisterende og nylig introduserte produkter gjennomgår en toksikologisk karakterisering, inkludert innåndingsruten før de plasseres på markedet. Derfor fokuserer REACH på alternative og dyrefrie metoder, implementeringen av "3R"-prinsippet (Erstatning, raffinement og reduksjon av dyreforsøk) og bruk av passende in vitro-modeller9. I de senere årene har mange forskjellige og tilstrekkelige ikke-dyr innånding toksisitet testing modeller (f.eks in vitro celle kulturer, lunge-på-en-chip modeller, presisjon kuttet lungeskiver (PCLS)) er utviklet for å vurdere den akutte innånding toksisitet av luftbårne partikler5,7,10,11. Når det gjelder in vitro celle kultur modeller, dyrket celler kan bli utsatt under nedsenket forhold eller ved ALI (Figur 1). Imidlertid er gyldigheten av nedsenkede eksponeringsstudier begrenset med hensyn til evaluering av toksisiteten av luftbårne forbindelser, spesielt partikler. Nedsenket eksponeringsteknikker samsvarer ikke med den menneskelige in vivo-situasjonen; cellekulturmediet som dekker cellene kan påvirke fysico-kjemiske egenskaper og dermed de giftige egenskapene til et teststoff12,13. ALI in vitro innånding modeller tillate direkte eksponering av celler til teststoffer uten forstyrrelser av cellekulturmediet med testpartikler, dermed etterligne menneskelig eksponering med høyere fysiologisk og biologisk likhet enn nedsenket eksponering12,14.
For regulatoriske prosesser som REACH er imidlertid bare dyremodeller tilgjengelige innen akutt innånding toksikologi, da ingen alternative in vitro-metoder har blitt tilstrekkelig validert og offisielt akseptert så langt14. For dette formålet må testmodeller valideres i henhold til kravene til EUs referanselaboratorium for alternativer til dyretesting (EURL-ECVAM) prinsipper om testgyldighet15.
En tidligere pre-validering studie og en nylig fullført validering studie vellykket demonstrert e-området av CULTEX RFS eksponeringssystem og dens overførbarhet, stabilitet, og reproduserbarhet13. Dette eksponeringssystemet er et in vitro cellebasert eksponeringssystem som muliggjør homogen eksponering av celler for gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks. sigarettrøyk) ved ALI på grunn av sitt radiale aerosoldistribusjonskonsept og ledning av testaerosolen i en kontinuerlig strøm over cellene16. Den grunnleggende modulen til dette radiale strømningssystemet består av innløpsadapteren, aerosolføringsmodulen med radial aerosoldistribusjon, prøvetaking og socket-modul og en låsemodul med et håndhjul (figur 2). De genererte partiklene når cellene via innløpsadapteren og aerosolføringsmodulen og deponeres på cellekulturinnsatsene, som ligger i de tre radialt arrangerte eksponeringskamrene i prøvetakingsmodulen. Aerosolføringsmodulen samt prøvetakingsmodulen kan varmes opp ved å koble til et eksternt vannbad17.
Innenfor rammen av begge studiene ble A549-celler brukt til alle eksponeringseksperimenter. Cellelinjen A549 er en human udødeliggjort epitelcellelinje som er svært godt karakterisert og har blitt brukt som in vitro-modell for type II alveolær epitelceller i mange toksikologiske studier. Cellene er preget av lamellære kropper, produksjon av overflateaktivt middel og en rekke betennelsesrelevante faktorer18. De viser også egenskaper av bronkial epitelceller på grunn av deres slimproduksjon19. Videre kan de dyrkes på ALI. Selv om denne cellelinjen er mangelfull i å bygge cellecellekontakter, er dyrkingen av disse cellene mye mer praktisk, billigere og resultater avledet av disse er donoruavhengige sammenlignet med primærceller20.
A549 celler ble seeded i 6-brønncellekulturinnsatser (PET membran, 4,67 cm2, porestørrelse 0,4 mm) med en tetthet på 3,0 x 105 celler per innsats og dyrket i 24 timer under nedsenket forhold. Cellene ble deretter eksponert i tre uavhengige laboratorier for ren luft og tre forskjellige eksponeringsdoser (25, 50 og 100 μg/cm2)av 20 teststoffer ved ALI. Eksponeringsdosen er korrelert med avsetningstiden, noe som resulterer i en konstant partikkelhastighet på henholdsvis 25 μg/cm2,50 μg/cm2 og 100 μg/cm2 på cellene etter henholdsvis 15, 30 eller 60 min. Deponerte partiklene ble imidlertid ikke vasket av etter avsetning, men forble på cellene i 24 timer. Partiklenes avsetningstider var derfor 15, 30 og 60 min, men eksponeringen av cellene varte totalt i 24 timer. Avsetningsfrekvensen for teststoffene ble bestemt i foreløpige eksperimenter i henhold til tidligere metoder17.
Cellelevedyktighet som en indikator på toksisitet ble vurdert 24 timer etter partikkelavsetning ved hjelp av en cellelevedyktighetsanalyse. Det ble satt spesielt fokus på kvaliteten på rene luftkontroller, optimalisering og raffinement av eksponeringsprotokollen, intra- og inter-laboratoriereproduserbarhet og etablering av en prediksjonsmodell (PM). Stoffer som førte til en reduksjon av cellelevedyktighet en under 50 % (PM 50 %) eller 75 % (PM 75 %) i noen av de tre eksponeringsdosene ble ansett for å utøve en akutt innåndingsfare. Resultatene ble deretter sammenlignet med eksisterende in vivo-data (basert på minst én pålitelig studie i henhold til OECDs testretningslinje (TG) 403 eller TG 43621,22), noe som førte til en samlet konkordans på 85 %, med en spesifisitet på 83 % og en følsomhet på 88 %23.
I tillegg til måling av cellelevedyktighet, kan andre endepunkter som cytokinfrigjøring, undersøkelse av cellelysat eller membranintegritet via LDH-analyse vurderes, men var ikke nødvendig for valideringsstudien. Dermed ble eksponeringssystemet (f.eks. CULTEX RFS) bevist som et prediktivt screeningsystem for kvalitativ vurdering av den akutte innåndingstoksisiteten til de testede luftbårne partiklene, som representerer en lovende alternativ metode for dyretesting. Følgende protokoll anbefales for eksponeringseksperimenter til luftbårne partikler ved hjelp av dette eksponeringssystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Protokollen for ett eksponeringseksperiment dekker en periode på tre dager.
Dag 1
1. Generelle preparater og dyrking av celler
MERK: Human lungeadenokarsinom epitelcellelinje A549 ble brukt til eksponeringseksperimenter. Celler må håndteres under sterile forhold. Andre cellelinjer som er egnet for dyrking ved ALI kan brukes.
- Forbered vekstmediet (Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), supplert med 10% føtal storfe serum (FBS) og 5 μg/ml gentamycin) og eksponeringsmediet (DMEM, supplert med 5 μg/ml gentamycin og en endelig HEPES konsentrasjon på 100 mM).
- Kultur A549 celler i vekstmedium ved 37 °C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2.
- Dyrke celler i cellekulturkolbe på 75 cm2 (T-75) i 14 ml vekstmedium til en samløpet på 80-90% før splitting (hver 2-3 dager) og en passasje på 35.
- Beregn suspensjonsvolumet og det nødvendige antallcellekultursvedlegget (tre cellekultursetter som inkubatorkontroller og cellekulturinnsatser for ren luft og partikkeleksponering) og cellekulturplater.
- Før trypsinisering og seeding av celler, legg til 2,5 ml herdet vekstmedium til hver brønn av en 6-brønns plate. Plasser cellekulturen setter inn uten celler nøye inne i brønnene og legg til 1 ml vekstmedium til hver cellekulturinnsats. Inkuber 6-brønnplatene i minst 30 min i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
2. Prøving av celler
- Temperfosfat bufret saltvann (PBS) og vekstmedium ved 37 °C og trypsin/EDTA (0,05 %/ 0.02%) oppløsning ved romtemperatur.
- Aspirer cellekulturmediet fra cellekulturkolben og vask cellene forsiktig med 8 ml forvarmet PBS.
- Fjern PBS, legg til 2 ml trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) oppløsning til cellene og inkubatoren for maksimal 6 min. i inkubatoren ved 37 °C. Kontroller avløsningsprosessen under mikroskopet.
- Nøytraliser trypsinaktiviteten ved å legge til 8 ml forvarmet vekstmedium, løsne cellene ved å trykke forsiktig sidelengs på kolben og resuspendere cellene ved å gjentatte pipetteropp og ned.
- Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml rør. Bestem cellenummeret for videre prosedyre (f.eks. såing av celler, passasje av celler).
3. Fastsettelse av cellenummer
MERK: Cellekonsentrasjon ble bestemt ved hjelp av en celleteller eller tellekamre.
- Fortynn 100 μL av cellekultursuspensjonen i en kopp fylt med 10 ml isotonisk oppløsning. Vipp koppen sakte uten å riste.
- Bestem antall levedyktige celler/ml og cellelevedyktighet basert på de cellespesifikke måleparametrene for A549-celler.
4. Seeding av celler på mikroporøse membraner i cellekulturinnsatser
MERK: Eksponeringssystemet er utstyrt med spesielle adaptere for å muliggjøre bruk av kommersielle innsatser fra forskjellige leverandører og i forskjellige størrelser. For disse eksponeringseksperimentene ble 6-brønnsplater og tilsvarende cellekulturinnsatser brukt. Alle arbeidstrinn må gjøres under sterile forhold.
- Gi forvarmet vekstmedium under sterile cellekulturforhold (lamimerflyt).
- Forbered et tilstrekkelig høyt volum av cellesuspensjonen med en cellekonsentrasjon på 3,0 x 105 celler/ml.
- Etter herding platene i 30 min, aspirer mediet i cellekulturen setter inn og frø 1 ml A549 celler med en tetthet på 3,0 x 105 celler / ml i hver cellekultur innsats. Fordel cellesuspensjonen ved mild gynge.
- Inkuber cellekulturen setter inn med cellesuspensjonen i 24 timer (37 °C og 5 % CO2).
5. Trykk ing av teststoffer
MERK: Teststoffer ble trykket inn i pulverkaker ved hjelp av en fullt kontrollerbar hydraulisk presse. Pressepakken kan bruke en maksimal kraft på 18 kN, som vises som dagens oljetrykk (i bar) av pressepakken. Presseforhold (trykktrykk, trykkende tid for å trykke) av ukjente teststoffer må etableres og karakteriseres i foreløpige tester. Avhengig av presseegenskapene til et stoff, kan ulike presserende parametere og typer trykkende stempel brukes.
FORSIKTIG: Bruk verneutstyr når du trykker på giftige eller farlige stoffer.
- Still inn trykktiden via tidskontrollen på forsiden av pressen.
- Åpne trykklufttilførselen ved trykkluftventilen. Sett trykklufttrykket på ca. 2 bar (indikert med en trykkmåler på forsiden) ved hjelp av trykkregulatoren på forsiden av pressen eller på trykkluftventilen på trykklufttilførselen. Trekk ut skuffen, trykk på Trykk-knappen og les trykktrykket på den digitale trykkbryteren.
- Les bare trykket på trykkregulatoren hvis trykket er for høyt eller for lavt.
- Montering av stoffbeholderen og kontroller at glasssylinderen er riktig sentrert (Tilleggsfigur 1). Fyll stoffbeholderen med en liten mengde teststoffet. Sett stempelet inn i stoffbeholderen og vri det litt frem og tilbake for å fordele pulveret jevnt i beholderen.
- Plasser stoffbeholderen med stempelet i skuffen, og trykk på Trykk-knappen. Det hydrauliske stempelavpressen beveger seg på stempelet og utøver et trykk på teststoffet for den innstilte trykketiden. Åpne skuffen og fjern stempelet.
- Gjenta trinn 5.3 og 5.4 til stoffbeholderen er minst halvfull.
- Etter at du har fullført det presserende arbeidet, fjerner du stoffbeholderen fra skuffen og vrir den opp ned for å fjerne løse og avsatte partikler.
- Hvis stoffbeholderen ikke er nødvendig på samme dag, lukk stoffbeholderen med parafilm for å forhindre at teststoffet tørker ut eller absorberer fuktighet.
Dag 2
6. Montering av eksponeringssystemet og tilkobling av det perifere utstyret
MERK: En mer detaljert visning er gitt i figur 3, tilleggstall figur 2 og tilleggstall figur 3. Monter begge modulene og aerosolgeneratoren i henhold til produsentens instruksjoner.
- Plasser eksponeringssystemet på en solid og jevn overflate, med vannforsyningen vendt fremover. Koble massestrømningsregulatorene til aerosolgeneratoren og en trehalset flaske koblet til modulen for eksponering av ren luft.
- Koble til strømningskontrolleren og vakuumpumpen. Koble rørene fra strømningskontrollerne med rørkontakten på tilbehørene til aerosolføringsmodulen. Koble rørene på den andre siden av strømningsregulatorene med vakuumpumpen. Kontroller at strømmen går fra modulen gjennom strømningsregulatorene til vakuumpumpen.
- Koble vannbadet med oppvarmingsvannforsyningen. Vannforsyningen går fra vannbadet til vanninntaket på aerosolføringsmodulen. Koble vannuttaket til aerosolføringsmodulen med vanninntaket til prøvetakingsmodulen. Lukk sirkelen med en tilkobling fra vannuttaket til prøvetakingsmodulen til vannbadet.
- Plasser aerosolgeneratoren, inkludert elutriatoren nær eksponeringsmodulen, og koble til elutriatorens overskytende linjer og eksponerings- og ren luftmodul med store mikrofiltre, og sugingen av eksponeringskamrene med små mikrofiltre (f.eks. engangsfiltre). Elutriatoren fungerer som et reservoar for den genererte partikkelatmosfæren og beholder partikler større enn ca. 7 μm, mens mindre partikler transporteres til eksponeringsmodulen.
- Koble datamaskinen som brukes til å styre aerosolgenereringen til USB-porten på aerosolgeneratortoppen via en USB-kabel og strømforsyningen til strømforsyningsporten. Koble strømpluggen til strømforsyningsenheten til en stikkontakt (220-240 V).
- Koble rørene for middels forsyning og fjerning med to pumper. I stedet for å bruke en pumpe for middels forsyning, kan mediet også fylles manuelt.
7. Forberedelse til ren luft og partikkeleksponering
- Slå på vakuumpumpen, strømningsregulatorene og vannbadet (37 °C) i en oppvarmingsperiode på minst 30 min.
- Åpne trykklufttilførselen. Sett massestrømningsregulatorene til 8 L/min for tilførselsledningen til aerosolgeneratoren og til 3 L/min for tilførselsledningen til den trehalsede flasken. Lukk fanene for masseflytkontrollere.
MERK: Disse verdiene kan variere avhengig av egenskapene til teststoffet. - Juster strømningsregulatorene via datamaskinen for å regulere modulflyten (1,5 L/min) og kammersuging (30 ml/min).
8. Lekkasjetest av radialstrømningssystemet
MERK: Lekkasjekontrollen må utføres under vakuum og for begge modulene (eksponering og ren luftmodul) for å sikre at modulen er riktig montert på riktig måte.
- Fjern innløpsadapteren og kondensatreflektoren fra aerosolføringsmodulen. Lukk de tre aerosolfôringsboringene i aerosolføringsmodulen med plugger og de mellomstore forsyningstilkoblingene ved prøvetakingsmodulen med dummyklaffer.
- Koble vakuumlinjene uten filteret med rørkontakten på aerosolføringsmodulen. Lukk modulen ved hjelp av håndhjulet og mål verdien til strømningskontrollerne. Verdiene skal reduseres noen minutter etter lukking under 5 ml/min.
- Etter impermeabilitetskontrollen fjerner du alle plugger og dummyklaffer, setter inninntaksadapteren og kondensatreflektoren inn i aerosolføringsmodulen og kobler rørene for middels forsyning og fjerning.
9. Aerosol generasjon
- Start datamaskinen og programvaren (Tilleggsfigur 4). Start aerosolgeneratorprogramvaren ved å dobbeltklikke på aerosolgeneratorstartknappen på skrivebordet på datamaskinen. Det vises et meldingsvindu og spør om innstillingene skal tilbakestilles eller ikke. Klikk Ja hvis programvaren startes for første gang den dagen. Angi verdiene for lysbildeposisjon og skraperposisjon til standardverdiene. Klikk Nei for å beholde verdiene for lysbildeposisjon og skrapingsposisjon, eller lysbildet er ikke i startposisjon.
- Skru en substansskrape inn i røret, som ligger i den sentrale åpningen av aerosolgeneratortoppen.
MERK: Avhengig av trykkegenskapene kan forskjellige typer stoffskraper brukes. - Bruk knappen Homing Mode hvis stoffet skrape ikke er i lavest posisjon.
- Plasser stoffbeholderen med det pressede testmaterialet opp ned over stoffskraperen. Sørg for at glasset på stoffbeholderen vender mot fronten. Pass på at de to hullene i stoffbeholderen passer på de to pinnene på aerosolgeneratortoppen. Plasser låseplaten i sporet over stoffbeholderen og stram den svarte skruen.
- Endre verdiene for Feed (0,24 til 20 mm/t) og Rotasjon (1 til 800 tur/t) til ønskede innstillinger. Partikkelkonsentrasjonen kan endres ved å øke eller redusere mateverdien eller transportørgassstrømningshastigheten.
- Bruk nedoverpilene til å skyve ned lysbildet med stoffbeholderen til substansskraperen er nær det pressede stoffet.
- Åpne trykklufttilførselen til aerosolgeneratoren med et trykk på massestrømningskontrolleren og start aerosolgenerasjonen ved å klikke på Start-knappen. Sett matehastigheten til 15-20 mm/t for å unngå lange ventetider.
- Kontroller riktig partikkelgenerering ved å observere den fine støvskyen med en liten lommelykt (plassert nedenfra bak glassrøret på Elutriatoren). Endre verdien for Feed tilbake til de ønskede innstillingene når den første aerosoldampen når kontinuerlig Elutriatoren og klikk på Stopp-knappen.
10. Eksponeringseksperimenter
- Start mediumforsyningen med forvarmet eksponeringsmedium og fyll prøvetakingsmodulene til nedrørene er dekket mens modulen er åpen. Bruk mediumpumpen eller fyll mediet manuelt (25 ml per individuell eksponeringskammer).
- Sett inn blindcellekulturinnsatser (setter inn uten celler) i eksponeringsmodulen. Pump eksponeringsmediet ned til nedrørene er dekket med middels og den nedre siden av innsatsene er i kontakt med medium.
- Start aerosolgeneratoren, lukk eksponeringsmodulen og koble eksponeringsmodulen til eksponeringsmoduluttaket til aerosolgeneratoren. Gi aerosolgeneratoren en ledetid på minst 20-30 min før eksponeringer startes for å muliggjøre en stabil generasjon partikler.
- Forbered postinkubasjonsplatene for inkubatorkontrollene og de eksponerte cellekulturene i løpet av ledetiden. Tilsett 1,5 ml vekstmedium per brønn og inkuber platene i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
- Etter ledetiden forsegler du eksponeringsmodulen til Elutriatoren med en gummiplugg og fjerner blindinnsatsene. Fyll på eksponeringsmediet (bruk av pumpen eller manuelt) til nedrørene er dekket med medium. Nå åpner du også trykklufttilførselen til ren luftmodul med kranen på massestrømningskontrolleren (3 L/min)
- Fjern cellekulturinnsatsene fra 6-brønnplatene ved hjelp av en pinsett. Hell vekstmediet forsiktig fra cellekulturen setter av ved å velte innsatsene og aspirere og kast gjenværende væske ved hjelp av en pipette. Plasser innsatsene i eksponeringskamrene i begge modulene, eksponeringen og ren luftmodulen.
- Lukk modulene og start eksponeringseksperimentene ved å koble eksponeringsmodulen til eksponeringsmoduluttaket til aerosolgeneratoren og den rene luftmodulen til transportørgasstilførselen samtidig.
MERK:Partikkelkonsentrasjonen kan endres ved å øke/redusere mateverdien, transportørgassstrømningshastigheten eller eksponeringstidspunktet. - Koble fra eksponerings- og ren luftmoduler etter at eksperimentet er fullført, og forsegle eksponeringsmodulens utløp.
- Stopp trykklufttilførselen og aerosolgeneratoren ved å klikke på Stopp-knappen.
- Åpne eksponerings- og ren luftmodulen og overfør cellekulturinnsatsene til de tilberedte postinkubasjonsplatene ved hjelp av en pinsett. Inkuber 6-brønnsplatene for 24 timer (37 °C, 5 % CO2)ved ALI.
MERK: Gjenta trinn 10,5 -10,10 hvis det planlegges flere eksponeringseksperimenter. - Løft cellekulturinnsatsene, som brukes som inkubatorkontroller til ALI under samme forhold som eksponertcellekultur setter inn og inkuberer dem i 24 timer (37 °C, 5 % CO2)ved ALI.
- Bruk knappen Homing Mode til å fjerne stoffbeholderen. Lukk aerosolgeneratorprogramvaren ved å klikke på X øverst til høyre og slå av datamaskinen.
- Etter fullføring av alle eksponeringseksperimenter, rengjør aerosolgeneratoren og begge eksponeringsmodulene. Lukk stoffbeholderen med parafilm hvis teststoffet vil bli viderebrukt i løpet av de neste dagene.
Dag 3
11. Cellelevedyktighet
MERK: Cellelevedyktighet ble bestemt 24 timer etter partikkeldeponering ved å måle mitokondrieaktiviteten ved hjelp av WST-1-analysen. Analysen ble utført i henhold til produsentens protokoll. Cellelevedyktighet kan også bestemmes ved hjelp av andre cellelevedyktighetstester (f.eks. XTT).
- Temperament vekstmedium ved 37 °C og tine WST-1-løsningen beskyttet mot lys. Forbered et passende antall nye 6-brønnplater med 2,5 ml vekstmedium per brønn og inkuber platene i inkubatoren.
- Forbered WST-1-fortynningen ved å fortynne en tilstrekkelig mengde WST-1 1:7 i vekstmedium
- Sett inn cellekulturen setter inn 24 timer etter eksponering i de nye preparerte 6-brønnplatene. Tilsett 1 ml av den ferske WST-1-løsningen til hver cellekulturinnsats. Rock platene nøye for å distribuere løsningen homogent på cellene. Inkuber 6-brønnsplatene med cellekulturinnsatser i 1 t (37 °C, 5 % CO2).
- Overfør 100 μL av supernatanten i triplisitre fra hver 6-brønn til en 96-brønnstallerken. Mål absorbansen ved 450 nm med en referansebølgelengde på 650 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
12. Statistikk
- Normaliser cellelevedyktigheten til den enkelte inkubatorkontroller til 100%.
- Uttrykk levedyktigheten til de eksponerte cellene i forhold til de enkelte inkubatorkontrollene. Cytotoksisitet av teststoffer ble sammenlignet med de respektive inkubatorkontrollene og brukes som en indikator på toksisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CULTEX RFS er et spesialdesignet modulær in vitro-eksponeringssystem som muliggjør direkte og homogen eksponering av celler ved ALI. I en tidligere pre-valideringstudie ble den generelle anvendelsen av dette eksponeringssystemet og dets overførbarhet, stabilitet og reproduserbarhet vellykket demonstrert. I et nylig forskningsprosjekt finansiert av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet ble eksponeringssystemet vellykket validert og etablert som en prediksjonsmodell (PM) for akutte innåndingsfarer for de testede forbindelsene. Ettersom kvaliteten på de rene luftkontrollene viste seg å være en kritisk parameter under pre-valideringsstudien, ble flere protokoll- og metodeoptimaliseringer (f.eks. endring av cellekulturinnsatser, stabilisering av pH av eksponeringsmediet ved å øke HEPES-konsentrasjonen til 100 mM) implementert i begynnelsen av valideringsstudien, noe som førte til svært stabile og reproduserbare resultater og en betydelig forbedring av ren luftlevedyktighetsdata på tvers av alle tre laboratoriene (Figur 4). A549 celler ble deretter eksponert ved ALI for tre forskjellige eksponeringsdoser (25, 50 og 100 μg/cm2)av 20 forhåndsvalgte og kodede teststoffer i de tre uavhengige laboratoriene, og cytotoksisitet (brukes som en indikator på toksisitet) ble sammenlignet med de respektive inkubatorkontrollene. Tretten kodede stoffer ble dermed testet i triplicates, syv kodede stoffer som enkelteksperimenter. Teststoffer ble ansett for å utøve en akutt innåndingsfare når cellelevedyktigheten minket under 50 % (PM 50 %) eller 75 % (PM 75 %).
Som vist eksemplarisk i figur 5,viste eksponering av A549-celler til forskjellige teststoffer nei, middels eller sterk toksisitet. Ettersom alle eksperimenter ble utført uavhengig i tre laboratorier, ble data analysert om reproduserbarheten i og mellom laboratoriene og forutsivitetiviteten til eksponeringssystemet. Avhengig av den anvendte pm (PM 50% eller PM 75%), innenfor laboratoriet og mellomlaboratoriet reproduserbarhet varierte fra 90-100%, viser robusthet og overførbarhet av denne metoden. Ettersom alle testede stoffer hadde relevante tilgjengelige referansedata (basert på minst én pålitelig studie i henhold til OECD TG 403 eller TG 436 ved hjelp av en tradisjonell LC50-protokoll og en konsentrasjon x tid (C x t)-protokoll), sammenligning av i vivo- og in vitro-data viste en samlet konkordans på 85 % (17/20) med en spesifisitet på 83 % (10/12) og en følsomhet på 85 % (7/8) (tabell 1). Bare to stoffer ble klassifisert som falskt positive og en som feilaktig negativ.
Oppsummert presenterer våre resultater av valideringsstudien en overførbar, reproduserbar og prediktiv screeningmetode for kvalitativ vurdering av akutt lungecytotoksisitet hos de valgte luftbårne partiklene.
Figur 1: Eksponering av celler ved ALI eller under nedsenkede forhold. A549 celler kan enten utsettes med et teststoff (blå piler og prikker) ved ALI (venstre) gjennom et inntak av eksponeringssystemet eller med teststoffet fortynnet i eksponeringsmedium (blå prikker) som skaper nedsenforelsesforhold (høyre). Røde stiplede linjer representerer fyllnivåene for eksponeringsmedium (lyse rødt) i det respektive eksperimentelle oppsettet. Dette tallet er endret fra Tsoutsoulopoulos et al.24. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksponeringsmodulen. Skjematisk oversikt over den grunnleggende modulen i radialstrømningssystemet som består av innløpsadapteren, aerosolføringsmodulen, prøvetakings- og socketmodulen og en låsemodul med et håndhjul. Dette tallet er endret fra Aufderheide et al.17. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Oversikt over eksponeringssystemet. Komponentene er de to eksponeringsmodulene for ren luft og partikkeleksponering, aerosolgeneratoren inkludert elutriatoren og tilsvarende styreenhet, og mediumpumpene. Dette tallet er endret fra Aufderheide et al.17. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Ren luftlevedyktighetsdata etter optimalisering av testmetoden. Eksponering av celler til ren luft førte til ingen reduksjon av cellelevedyktighet over tid, noe som førte til en betydelig forbedring av levedyktighetsdata for ren luft sammenlignet med pre-valideringsstudien. Alle rene luftkontroller ble samlet for hvert laboratorium (Lab 1-3) og eksponeringstid (n = 46 per laboratorium og tidspunkt). Data vises som boxplots med en median linje og området som er angitt av whiskers. Dette tallet er endret fra Tsoutsoulopoulos et al.23. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Eksponering av A549-celler til forskjellige teststoffer. (A) Eksponering av A549 celler for wolfram(IV) karbid viste ingen reduksjon av cellelevedyktighet for de tre forskjellige eksponeringsdosene og syntes å være giftfri (n = 3 per laboratorie- og eksponeringsdose). (B) Eksponering av celler for tetrabromophthalic anhydrid resulterte for alle laboratorier i moderat toksisitet som presenterer en god doseresponskurve (n = 1 per laboratorie- og eksponeringsdose). (C) Sinkdimetylditiokarboamat viste en sterk toksisitet, noe som førte til redusert cellelevedyktighet allerede etter en avsatt dose på 25 μg/cm2 (n = 3 per laboratorie- og eksponeringsdose). Feilfelt representerer standardavvik. Dette tallet er endret fra Tsoutsoulopoulos et al.23. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Referanseresultater i vivo | Resultater i vitro | |||||
| Stoff | OECD TG | CLP-regulering | Toksisitet | PM50% | PM75 % | Samsvar in vivo / in vitro |
| Wolfram(IV) karbid | 403 | n. c | 0 | 0 | 0 | ja |
| Wolfram(IV) karbid nano | - | n. c. | 0 | 0 | 0 | ja |
| N,N'-etylenbeis(N-acetylaketamid) | EPA OPPTS 870.1300 | n. c. | 0 | 0 | 0 | ja |
| Silisiumdioksid | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | ja |
| Diammonium hydrogenortho-fosfat | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | ja |
| Disodium fluorosfat | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | ja |
| Neodymoksid | 436 | n. c. | 0 | 0 | 0 | ja |
| Kaliumhydrogen monopersulfate | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | ja |
| Cyclohepta-pentylose | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0(2x) / 1 (1x) | (Ja) |
| Vanadium(III) oksid | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0(2x) / 1 (1x) | (Ja) |
| Tetrapotassium pyrofosfat | 403 | n. c. | 0 | 1 | 1 | nei |
| Tetra-bromoftaltisk anhydrid | 403 (lignende) | n. c. | 0 | 1 | 1 | nei |
| Cetylpyridiniumklorid | 403 | Akutt tox. 2 | 1 | 1 | 1 | ja |
| N-Lauroylsarcosine natriumsalt | 403 | Akutt tox. 2 | 1 | 1 | 1 | ja |
| Sink dimetyldithio-karboamat | 403 | Akutt tox. 2 | 1 | 1 | 1 | ja |
| Kobber(II) hydroksid | 403 | Akutt tox. 2 | 1 | 1 | 1 | ja |
| Sink selenitt | 436 | Akutt tox. 3 | 1 | 1 | 1 | ja |
| Natriummetavanadate | 403 | Akutt tox. 4 | 1 | 1 | 1 | ja |
| Divanadium pentaoxide | 403 | Akutt tox. 4 | 1 | 1 | 1 | ja |
| Kadmium telluride | 403 | Akutt tox. 4 (n. c.) | 1 | 0 | 0 | nei |
| n. c. = ikke klassifisert; 0 = giftfri; 1 = giftig; CLP = klassifisering, merking og emballasje | ||||||
Tabell 1: Samsvar mellom resultatene fra in vivo og in vitro. Av 20 stoffer ble 10 stoffer klassifisert som korrekt negative, og syv stoffer korrekt som positive, noe som førte til en konkordans på 85 % (17/20). Denne tabellen er endret fra Tsoutsoulopoulos et al.23. (Test nr. 403: Akutt giftighet i innånding, test nr. 436: akutt innåndingstoksisitet - akutt giftig klassemetode; Akutt tox. 2 = dødelig, akutt tox. 3 = giftig, akutt tox. 4 = skadelig).
Supplerende figur 1: Montering av stoffbeholderen. Bilde tatt fra CULTEX DG (Dust Generator) Brukerhåndbok. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggstall Figur 2: Aerosolføringsmodul i eksponeringssystemet. A) Øverste visning og B) bunnvisning av aerosolguidingmodulen. Bilde tatt fra CULTEX RFS (Radial Flow System) Brukerhåndbok. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggstall Figur 3: Aerosolgeneratoren. A) Skjematisk oversikt over aerosolgeneratoren, bestående av aerosolgeneratortoppen og Elutriatoren. Detaljert visning av B) aerosolgeneratortoppen og C) Elutriatoren. Bilde tatt fra CULTEX DG (Dust Generator) Brukerhåndbok. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggsutstyr Figur 4: Programvaren for aerosolgeneratorkontroll. Bilde tatt fra CULTEX DG (Dust Generator) Brukerhåndbok. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange ikke-dyr innånding toksisitet testing modeller har blitt utviklet de siste årene for å få informasjon om akutt innånding fare for inhalerbare partikler og for å redusere og erstatte dyreforsøk i henhold til 3R prinsippet25.
Når det gjelder cellekulturmodeller, kan eksponering av celler gjøres under nedsenkede forhold eller ved ALI. Utsette celler under nedsenket forhold kan påvirke fysico-kjemiske egenskaper og dermed giftige egenskaper av en test stoff12. In vitro ALI innåndingmodeller etterligner imidlertid den menneskelige eksponeringssituasjonen med høyere biologisk og fysiologisk likhet enn nedsenket eksponering og er derfor bedre egnet for å analysere den akutte innåndingstoksisiteten til luftbårne partikler. Betydningen av CULTEX RFS med hensyn til andre eksisterende eksponeringsmoduler er ikke bare eksponering av celler under ALI-forhold, men også den svært homogene fordelingen og avsetningen av partikler. I motsetning til sekvensielle eksponeringsmodeller med lineær aerosolveiledning, gjør den modulære utformingen av denne eksponeringsmetoden en radial forsyningslinje som fører til en svært homogen deponering av partikler på cellene17.
Det viktigste punktet for vellykkede eksponeringseksperimenter er den stabile og kongruent kvaliteten på de rene luftkontrollene. Spesiell oppmerksomhet må rettes for at levedyktigheten til de rene luftkontrollene ikke påvirkes over tid og så nært som mulig ved 100 % sammenlignet med de tilsvarende inkubatorkontrollene. Faktorer som spiller en viktig rolle angående ren luftlevedyktighet er valget av egnede cellekulturinnsatser, pH-verdien av eksponeringsmediet og sammensetningen av ren luft. Når det gjelder cellekulturinnsatser, må en god kvalitet og en høy tetthet av porene garanteres. Dette sikrer en bedre medium forsyning og en høyere relativ fuktighet inne i cellekulturen setter inn, beskytte cellene mot uttørking26. Ved å bruke cellekulturinnsatser med sideveggåpninger, må spesielle innsatshylser brukes for å unngå lekkasje av testpartikler gjennom sideveggåpningene som kan føre til en mulig forurensning av eksponeringsmediet. Et skifte av pH-verdien høyere enn 8 kan allerede ha en giftig effekt på cellene og derfor føre til en svekkelse av cellelevedyktighet27. Dette skjer spesielt i depotpartikkelavsetningstider (f.eks. 60 min) hvis den rene luften inneholder mindre enn 5 % CO2 eller HEPES-konsentrasjonen av eksponeringsmediet er for lav, noe som må unngås.
Et kritisk spørsmål i protokollen er pressing av teststoffene. Teststoffene må være tilstrekkelig komprimert til en pulverkake i stoffbeholderen for å muliggjøre en stabil partikkeleksponering. Dermed må stoffene karakteriseres i foreløpige eksperimenter angående deres presseegenskaper og for å få informasjon om hvilken trykkstempel, type skrapingblad eller fôrfrekvenser må brukes.
Det maksimale trykktrykket på den hydrauliske pressen er imidlertid 10 kN, som representerer samtidig belastningsgrensen for glasssylinderen og dermed en begrensning av trykkeprosessen. Stoffbeholderen tåler ikke høyere trykkkrefter enn 10 kN. En høyere presserende kraft kan tilby pressing av krystallinske stoffer og dermed utvide anvendelsen av denne pressen, men ville kreve mer robuste stoffbeholdere.
Videre kan dette eksponeringssystemet som primært er designet for undersøkelse av luftbårne partikkeleksponeringer tilpasses eksponeringen av flytende aerosoler og svært giftige og aggressive gasser avhengig av aerosolgenereringsmetoden og materialet til eksponeringsmodulene. Utveksling av aerosolgeneratoren med membranforstøver og bruk av en eksponeringsmodul i rustfritt stål gjorde det mulig å eksponering en celler til svært giftige flytende aerosoler24.
Et ytterligere kritisk problem er overbelastningseffekten. Cellelevedyktighet kan påvirkes ikke bare av toksikologiske egenskaper av et teststoff, men også av mengden av et stoff som er avsatt på cellene. Dette eksponeringssystemet viser faktisk betydelig likhet med de fysiologiske forholdene i den menneskelige alveolære regionen, men inneholder ingen klaringsmekanismer for fjerning av partikler. Det er derfor svært viktig at cellelevedyktigheten ikke svekkes på grunn av et for stort antall partikler.
Protokollen beskriver heri den homogene eksponeringen av dyrkede menneskelige lungeceller ved ALI til luftbårne partikler. Reproduserbarheten, robustheten og overførbarheten gjør det nåværende eksponeringssystemet gjeldende som en in vitro screeningmetode for kvalitativ vurdering av inhalerbare partikler angående deres akutte innåndingstoksisitet. Fordi ingen alternative in vitro metoder har blitt tilstrekkelig validert så langt, akutt lungetoksisitet blir fortsatt vurdert ved å utsette dyr (f.eks. helkroppskamre, nese eller munnbare metoder). Alle allment aksepterte OECDs testretningslinjer for akutt innåndingstoksisitet (f.eks. TG 403, TG 433 og TG 436) er basert på dyremodeller i dag21,22,28,29. En fremtidig retning vil derfor være å søke i Organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling (OECD) om aksept som en in vitro test retningslinje for akutt innånding toksisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne PÅ, KG, AB, SH, HM, TG, HT og DS har ingenting å avsløre. Selskapet Cultex Technology GmbH (tidligere Cultex Laboratories GmbH) produserer instrumenter (f.eks. CULTEX RFS, CULTEX DG) som brukes i denne artikkelen. NM var ansatt i Cultex Laboratories GmbH under denne studien. OK er ansatt i Cultex Technology GmbH (tidligere Cultex Laboratories GmbH). Patentet PCT/EP2009/007054 for enheten er innesatt av grunnleggeren av Cultex Technology GmbH Prof. Dr. Ulrich Mohr (tidligere Cultex Laboratories GmbH).
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Tyskland (Grant 031A581, underprosjekt A-D)) og av Den tyske forskningsstiftelsen (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Forskningsopplæringsgruppe GRK 2338).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP - Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
References
- Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
- Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 (2018).
- De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
- LANUV Nordrhein-Westfalen. Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
- Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
- Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
- Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
- Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
- Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
- Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
- Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
- Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
- Eskes, C., Whelan, M. Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, Springer International Publishing. (2016).
- Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
- Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
- Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
- Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
- OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
- Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
- OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2018).
- OECD. Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , OECD Publishing. Paris. (2018).
